«Основы бактериологической техники»

Примечание.—Каждая пробирка теперь содержит осадок из 100 см³ пробы молока, и количество можно считать в сотых долях сантиметра. Умножение этой цифры на 100 даст количество «видимых загрязнений» в «частях на миллион» — обычный метод регистрации этого качества молока.

9. Отпипетируйте всю надосадочную жидкость и переверните пробирку, чтобы она стекла на прокладку из стерилизованной ваты, находящуюся в стакане. (Эта вата впоследствии сжигается.)

10. Исследуйте как сливки (C1), так и осадок (D1) микроскопически —

(а) В препаратах «висячая капля».

(б) В мазках, окрашенных карболовым метиленовым синим, по методу Грама, по методу Нейссера и по методу Циль-Нильсена.

Отметьте наличие или отсутствие измененных и неизмененных растительных волокон; гнойных клеток, кровяных телец; кокков в группах или цепочках, дифтероидных палочек, грамотрицательных палочек или кокков, спор и кислотоустойчивых бактерий.

11. Приспособьте заключительные этапы исследования к особым требованиям каждой отдельной пробы, таким образом:

1. Члены группы кишечной и тифозной палочек.—

1. Эмульгируйте осадок из второй центрифужной пробирки (D2) с 10 см³ стерильного бульона и инокулируйте три пробирки с бульонной средой с желчными солями следующим образом:

To Tube No. 1 add 2.5 c.c. milk deposit emulsion (=25 c.c. original milk.)

To Tube No. 2 add 1.0 c.c. milk deposit emulsion (=10 c.c. original milk.)

To Tube No. 3 add 0.5 c.c. milk deposit emulsion (= 5 c.c. original milk.)

2. Инокулируйте пробирку с бульонной средой с желчными солями № 4 1 см³ исходного молока.

3. Инокулируйте дополнительные пробирки с бульонной средой с желчными солями предварительно приготовленными разведениями (см. стр. 445) следующим образом:

To tube No. 5 add 1.0 c.c. from capsule I.

To tube No. 6 add 0.1 c.c. from capsule I.

To tube No. 7 add 1.0 c.c. from capsule II.

To tube No. 8 add 0.1 c.c. from capsule II.

To tube No. 9 add 1.0 c.c. from capsule III.

To tube No. 10 add 0.1 c.c. from capsule III.

To tube No. 11 add 1.0 c.c. from capsule IV.

To tube No. 12 add 0.1 c.c. from capsule IV.

и инкубируйте анаэробно (в пробирках Бухнера) при 42° C в течение максимального периода сорока восьми часов.

4. Если рост происходит, завершите исследование, как подробно описано в соответствующем разделе исследования воды (см. стр. 428–431).

Примечание.—B. coli communis, происходящая из кишечных выделений коровы, почти повсеместно присутствует в больших или малых количествах в розничном молоке. Поэтому ее обнаружение, если только не в огромных количествах (когда это указывает на отсутствие чистоты), имеет малое значение.

2. Vibrio Choleræ.—Инокулируйте пробирки с пептонной водой, используя те же количества, что и при поиске членов групп кишечной и тифозной палочек (см. выше 1–3); инкубируйте аэробно при 37° C и завершите исследование, как подробно описано в соответствующем разделе исследования воды (см. стр. 439).

3. B. Enteritidis Sporogenes.—Инокулируйте пробирки с лакмусовым молоком такими же количествами, как те, что использовались в предыдущих поисках, пропуская пробирку № 1 (см. выше 1–3), поместите в дифференциальный стерилизатор при 80° C на десять минут, а затем инкубируйте анаэробно при 37° C в течение максимального периода сорока восьми часов. Завершите исследование, как подробно описано в соответствующем разделе исследования воды (см. стр. 438).

4. B. Diphtheriæ.—

(А) 1. Посейте три серии последовательных культур, по двенадцать пробирок в каждой серии, из (а) сливок C2, (б) осадка D1 на скошенную свернутую сыворотку крови и инкубируйте при 37° C.

2. Снимите любые подозрительные колонии, которые могли появиться через двенадцать часов после инкубации, исследуйте микроскопически и пересейте на сыворотку крови и поместите в инкубатор; верните исходные пробирки в инкубатор.

3. Повторите это после восемнадцати часов инкубации.

4. Из полученных культур сделайте мазки на покровных стеклах и окрасьте карболовым метиленовым синим, по методу Нейссера, по методу Грама. Пересейте те, которые кажутся состоящими из дифтерийных палочек, в раствор глюкозо-пептона. Отметьте те, в которых происходит образование кислоты.

5. Инокулируйте морских свинок подкожно одним или двумя кубическими сантиметрами сорокавосьмичасовой культуры на глюкозном бульоне, полученной из первого пересева каждого ферментатора глюкозы, и наблюдайте за результатом.

6. Если наступает смерть, по-видимому, от дифтерийной токсемии, инокулируйте еще двух морских свинок таким же количеством летальной культуры. Оставьте одно животное в качестве контроля, а другому введите 1000 единиц противодифтерийной сыворотки. Если контрольное животное умирает, а леченое выживает, доказательство идентичности выделенного организма с палочкой Клебса-Леффлера становится абсолютным.

7. Инокулируйте морских свинок подкожно фильтрованными культурами на глюкозном бульоне (токсины?) и наблюдайте за результатом.

(Б) 1. Эмульгируйте остаток осадка с 5 см³ стерильного бульона и инокулируйте двух морских свинок, таким образом: морская свинка «а» — подкожно 1 см³ эмульсии; морская свинка «б» — подкожно 2 см³ эмульсии; и наблюдайте за результатом.

2. Если одно или оба инокулированных животных погибают, произведите полное вскрытие и попытайтесь выделить патогенные организмы из местного поражения. Подтвердите их идентичность, как в A5 и 6 (см. выше).

5. Bacillus Tuberculosis.—

(А) 1. Инокулируйте каждую из трех морских свинок (предварительно проверенных туберкулином, чтобы доказать их свободу от спонтанного туберкулеза) подкожно во внутреннюю сторону сгиба левого колена 1 см³ эмульсии осадка, оставшейся в той или иной пробирке (D1 или D2).

2. Введите небольшое количество сливок в подкожный карман, подготовленный на внутренней стороне сгиба правого колена каждого из этих трех животных. Наложите на рану герметичную повязку.

3. Тщательно наблюдайте и точно взвешивайте каждый день.

4. Умертвите одну морскую свинку в конце второй недели и произведите полное вскрытие.

5. Если результат исследования отрицательный или неубедительный, умертвите вторую морскую свинку в конце третьей недели и тщательно исследуйте.

Fig. 215.—Cadaver of guinea-pig experimentally infected with B. tuberculosis.

6. Если результат по-прежнему отрицательный или неубедительный, умертвите третью морскую свинку в конце шестой недели. Произведите тщательное вскрытие. Исследуйте материал из любых казеозных желез микроскопически и обильно инокулируйте на яичную среду Дорсета.

Примечание.—Каждое вскрытие животных, зараженных туберкулезным материалом, должно включать осмотр невооруженным глазом и микроскопическое исследование подколенных, поверхностных и глубоких паховых, подвздошных, поясничных и подмышечных желез с каждой стороны тела, а также запеченочных, бронхиальных и грудинных желез, селезенки, печени и легких (рис. 215).

(Б) 1. Тщательно смешайте все имеющиеся сливки и осадок из пробы молока и перенесите в стерильную колбу Эрленмейера.

2. Обработайте смесь методом антиформина (см. Приложение, стр. 502).

3. Инокулируйте каждую из двух морских свинок внутрибрюшинно половиной полученной эмульсии.

4. Умертвите одну из морских свинок в конце первой недели и тщательно исследуйте.

5. Умертвите вторую морскую свинку в конце второй недели и тщательно исследуйте.

6. Используйте остаток осадка для микроскопического исследования и культивирования на яичной среде Дорсета.

Примечание.—Результат микроскопического исследования на наличие B. tuberculosis не имеет никакой ценности, если он не подтвержден результатами экспериментов по инокуляции.

6. Streptococcus Pyogenes Longus.—

(А) 1. Сделайте последовательные поверхностные посевы на нутрозо-агар. Также сделайте последовательные посевы на скошенный питательный агар (шесть пробирок в серии).

2. Если полученный рост показывает колонии, которые напоминают колонии стрептококка, сделайте пересевы на агар и в бульон в первую очередь и тщательно изучите.

(Б) 1. Посейте большую петлю осадка D2 в каждую из трех пробирок с глюкозо-формиатным бульоном и инкубируйте анаэробно (в пробирках Бухнера) в течение двадцати четырех часов при 37° C.

2. Если полученный рост напоминает рост стрептококка, сделайте пересевы на питательный агар.

3. Подготовьте пересевы любых подозрительных колоний, которые появляются, на все обычные среды и тщательно изучите.

Если стрептококк успешно выделен, инокулируйте культуры из сывороточного бульона мыши, морской свинке и кролику, чтобы определить его патогенность и вирулентность.

7. Staphylococcus Pyogenes Aureus.—

1. Тщательно исследуйте рост на последовательных культурах на сыворотке крови, подготовленных для выделения B. diphtheriæ, и последовательных культурах на агаре для выделения стрептококков после сорока восьми часов инкубации.

2. Снимите любые подозрительные оранжевые колонии, посейте на скошенный агар и инкубируйте при 20° C. Наблюдайте за образованием пигмента.

3. Подготовьте пересевы из любых подозрительных культур на все обычные среды, тщательно изучите и исследуйте их патогенность.

8. Micrococcus Melitensis.—Молоко от животного, зараженного M. melitensis, обычно содержит организмы в больших количествах и лишь немногие другие бактерии.

1. Сделайте несколько серий поверхностных посевов на нутрозо-агар, каждый из одной петли осадка в пробирке D1 или D2.

2. Сделайте несколько серий поверхностных посевов на нутрозо-агар, каждый из одной капли исходной пробы молока.

3. Инкубируйте аэробно при 37° C и осматривайте ежедневно до конца десяти дней.

4. Снимите подозрительные колонии, исследуйте их микроскопически и пересейте на нутрозо-агар в пробирках; на глюкозный агар и в лакмусовое молоко.

5. Проверьте последующий рост против сыворотки экспериментального животного, инокулированного против M. melitensis, чтобы определить его агглютинируемость.

6. Если это по-видимому M. melitensis, инокулируйте культуру с нутрозо-агара после трех дней инкубации внутричерепно морской свинке.

МОРОЖЕНОЕ.

Сбор пробы.—

1. Возьмите пробу из барабана черпаком или ложкой, которой продавец торгует мороженым, и немедленно поместите ее в стерильную медную капсулу, подобную той, что используется для проб почвы (см. стр. 471).

2. Упакуйте для отправки в ящик со льдом.

3. По прибытии в лабораторию поместите медные капсулы с мороженым в инкубатор при 20° C на пятнадцать минут — то есть до тех пор, пока хотя бы часть мороженого не станет жидкой.

Качественный и количественный анализ.—Обрабатывайте жидкое мороженое как молоко и проводите исследование точно так же, как описано для молока (см. стр. 443).

ИССЛЕДОВАНИЕ СЛИВОК И МАСЛА.

Сбор пробы.—Собирайте, храните и отправляйте пробы в лабораторию точно так же, как это делается в случае с мороженым.

Количественный анализ.—

Необходимая аппаратура:

Sterile test-tube.

Sterilised spatula.

Water-bath regulated at 42° C.

Case of sterile plates.

Case of sterile graduated pipettes, 1 c.c. (in hundredths).

Tubes of gelatine-agar (+10 reaction).

Plate-levelling stand, with its water chamber filled with water at 42° C.

Метод.—

1. Перенесите несколько граммов пробы в стерильную пробирку с помощью стерилизованного шпателя.

2. Поместите пробирку на водяную баню при 42° C, пока содержимое не станет жидким.

3. Разжижьте восемь пробирок с желатин-агаром, поместите их на водяную баню при 42° C и охладите до этой температуры.

4. Инокулируйте пробирки с желатин-агаром следующими количествами пробы с помощью стерильной пипетки, градуированной в сотых долях кубического сантиметра, а именно:

To tube No. 1 add 1 c.c. liquefied butter.

2 add 0.5 c.c. liquefied butter.

3 add 0.3 c.c. liquefied butter.

4 add 0.2 c.c. liquefied butter.

5 add 0.1 c.c. liquefied butter.

6 add 0.05 c.c. liquefied butter.

7 add 0.03 c.c. liquefied butter.

8 add 0.02 c.c. liquefied butter.

9 add 0.01 c.c. liquefied butter.

5. Залейте чашку Петри из каждой пробирки с желатин-агаром и инкубируйте при 28° C.

6. «Подсчитайте» чашки после трех дней инкубации и на основе полученных цифр оцените количество организмов, присутствующих в одном кубическом сантиметре пробы.

Качественный анализ.—

Необходимая аппаратура:

Стерильный стакан, горлышко которого закрыто стерильной ватной пробкой.

Противовес для стакана.

Весы и гири.

Стерилизованный шпатель.

Водяная баня, отрегулированная на 42° C.

Делительная воронка емкостью 250 см³, выходная трубка которой защищена от загрязнения путем пропускания ее через ватную пробку внутрь небольшой колбы Эрленмейера, служащей опорой для воронки. Этот аппарат стерилизуется целиком в сушильном шкафу.

Большая центрифуга.

Стерильные пробирки (для центрифуги), закрытые сплошными резиновыми пробками.

Case of sterile pipettes, 10 c.c.

Case of sterile graduated pipettes, 1 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).

Метод.—

1. Отвесьте 100 граммов пробы в стерильный стакан.

2. Закройте горлышко стакана стерильной ватной пробкой и погрузите стакан в водяную баню при 42° C, пока содержимое полностью не разжижится.

3. Перелейте разжиженное масло в стерильную делительную воронку.

4. Перенесите воронку в инкубатор при 37° C и оставьте ее там на четыре дня.

По истечении этого времени содержимое воронки разделится на два четких слоя.

(а) Поверхностный маслянистый слой, практически свободный от бактерий.

(б) Глубокий водянистый слой, мутный и облачный от роста бактерий.

5. Слейте нижний мутный слой в стерильные центрифужные пробирки, предварительно нагретые примерно до 42° C, и немедленно центрифугируйте.

6. Отпипетируйте надосадочную жидкость и наполните пробирки теплым стерильным 1%-м раствором карбоната натрия; закройте пробирки пробками и энергично встряхивайте в течение нескольких минут.

7. Снова центрифугируйте.

8. Отпипетируйте надосадочную жидкость; наполните пробирки теплым стерильным бульоном, хорошо встряхните и снова центрифугируйте, чтобы промыть осадок.

9. Отпипетируйте надосадочную жидкость.

10. Подготовьте мазки на покровных стеклах, зафиксируйте и очистите, как для препаратов молока, окрасьте карболовым метиленовым синим, по методу Грама, по методу Циль-Нильсена и исследуйте микроскопически с помощью 1/12-дюймового иммерсионного объектива.

11. Продолжите исследование осадка, как в случае с осадком молока (см. стр. 450 и далее).

ИССЛЕДОВАНИЕ ИСПОРЧЕННОГО МЯСА.

(Включая консервированное или паштетное мясо, рыбу и т. д.) Бактериоскопическое исследование испорченных продуктов направлено главным образом на обнаружение тех членов группы кишечной и тифозной палочек — B. enteritidis Гертнера и их союзников, — которые обычно связаны с эпидемическими вспышками пищевых отравлений, а также таких анаэробных бактерий, которые инициируют процессы гниения в пище, приводящие к образованию ядовитых птомаинов; следовательно, количественный анализ в чистом виде часто опускается.

А. Культуральное исследование.

Количественный анализ.—

Необходимая аппаратура:

Стерилизованный консервный нож (если необходимо).

Колба Эрленмейера (емкостью 500 см³), содержащая 200 см³ стерильного бульона и снабженная сплошной резиновой пробкой.

Противовес.

Ножницы и пинцет.

Весы и гири.

Водяной стерилизатор.

Подкожный шприц.

Шприц с внутрижелудочной трубкой.

Крысиный пинцет.

Набор стерильных капсул.

Фильтровальный аппарат, как для анализа воды.

Набор стерильных чашек.

Case of sterile graduated pipettes, 10 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).

Case of sterile graduated pipettes, 1 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).

Подставка для выравнивания чашек.

Пробирки с питательным желатином.

Пробирки с питательным агаром.

Водяная баня, отрегулированная на 42° C.

Аппарат Буллока.

Метод.—

1. Поместите колбу, содержащую 200 см³ стерильного бульона, на одну чашку весов и точно уравновесьте.

2. Измельчите часть пробы с помощью стерильных ножниц и пинцета и добавьте измельченную пробу в бульон в колбе в количестве 20 граммов.

3. Сделайте экстракт, поместив колбу в инкубатор, работающий при 42° C (или на водяную баню, отрегулированную на эту температуру), на полчаса, время от времени встряхивая содержимое. Лучшие результаты получаются, если внутри инкубатора установлен электрический шейкер и колба находится в движении в течение всех тридцати минут.

Теперь каждый сантиметр содержит бактерии, вымытые из 0,1 грамма исходной пищи.

4. Инокулируйте пробирки с разжиженным желатином следующим образом:

To tube No. 1 add 1.0 c.c. of the extract.

2 add 0.5 c.c. of the extract.

3 add 0.3 c.c. of the extract.

4 add 0.2 c.c. of the extract.

5 add 0.1 c.c. of the extract.

Залейте чашки из этих пробирок и инкубируйте при 20° C.

5. Подготовьте точно такой же набор агаровых чашек и инкубируйте при 37° C.

6. Отпипетируйте 5 см³ экстракта в стерильную пробирку, нагрейте в дифференциальном стерилизаторе при 80° C в течение десяти минут.

7. Из нагретого экстракта подготовьте дублирующие наборы агаровых и желатиновых чашек и инкубируйте анаэробно в аппарате Буллока при 37° C и 20° C соответственно.

8. После трех дней инкубации исследуйте агаровые чашки, как аэробные, так и анаэробные, и подсчитайте колонии, развившиеся из спор (7), и из вегетативных форм и спор (5), и рассчитайте и запишите количество каждой группы на грамм исходной пищи.

9. После семи дней инкубации (или раньше, если это необходимо из-за роста разжижающих колоний) подсчитайте желатиновые чашки таким же образом.

10. Сделайте пересевы из колоний, которые появляются, и идентифицируйте различные организмы.

11. Продолжите исследования в отношении обнаружения патогенных организмов, как описано в разделе «Вода» (стр. 429 и далее).

Качественный анализ.—

I. Культуральный.

Микроорганизмы, которые ищут во время исследования испорченных продуктов, включают следующее:

Члены групп кишечной и тифозной палочек (главным образом класса Гертнера).

B. anthracis.

Стрептококки.

Анаэробные бактерии:

B. enteritidis sporogenes.

B. botulinus.

B. cadaveris.

Методы, с помощью которых эти организмы, если они присутствуют, могут быть идентифицированы и выделены, уже описаны в соответствующем разделе исследования воды, за исключением тех, которые применимы к B. botulinus и B. cadaveris. Их можно удовлетворительно выделить только из тел экспериментально инокулированных животных.

II. Экспериментальный.

Ткань.—

1. Кормите крыс и мышей порциями пробы и наблюдайте за результатом.

2. Если кто-либо из животных умирает, произведите полное вскрытие и попытайтесь выделить патогенные организмы.

Экстракт.—

1. Вводите различные количества бульонного экстракта в желудки нескольких крыс, мышей и морских свинок повторно в течение двух или трех дней внутрижелудочным методом инокуляции (см. стр. 367) и наблюдайте за результатом. Морские свинки и мыши очень восприимчивы к инфекции B. botulinus этим методом; кролики менее восприимчивы.

2. Инокулируйте крыс, мышей и морских свинок подкожно в глубокие карманы и внутрибрюшинно различными количествами бульонного экстракта и наблюдайте за результатом.

3. Отфильтруйте часть экстракта через свечу Шамберлана и инкубируйте фильтрат, чтобы определить наличие растворимых токсинов.

4. Если кто-либо из животных погибает от любого из этих методов инокуляции, произведите тщательное вскрытие и попытайтесь выделить патогенные организмы.

ИССЛЕДОВАНИЕ УСТРИЦ И ДРУГИХ МОЛЛЮСКОВ.

При открытии раковины устрицы обнаруживается некоторое количество жидкости, называемой «ликером». Это количество варьируется от капли до многих кубических сантиметров (0,1 см³ – 10 см³) — в последнем случае большая часть жидкости, вероятно, является последним квантом воды, проглоченным двустворчатым моллюском перед закрытием раковины. Чтобы получить рабочее среднее значение бактериологической флоры пробы, следует взять десять устриц, а тело, желудочный сок и ликер следует тщательно перемешать перед исследованием. Исследование, как и при работе с другими продуктами питания, направлено на поиск членов группы кишечной и тифозной палочек, сточных стрептококков и, возможно, также B. enteritidis sporogenes.

Необходимая аппаратура:

Две жесткие щетки для ногтей.

Жидкое мыло.

Стерильная вода в аспираторной банке с выпускным соплом, управляемым пружинным зажимом.

Стерильные ножи для устриц.

Стерильная стеклянная чашка с крышкой, достаточно большая, чтобы вместить десять устриц.

Стерильный пинцет.

Стерильные ножницы.

Стерильные полотенца или большие марлевые прокладки.

Стерильные градуированные цилиндры емкостью 1000 см³, с крышкой или дном стерильной чашки Петри, перевернутыми над открытым горлышком в качестве крышки.

Стеклянные палочки.

Corrosive sublimate solution, 1 per mille.

Пробирки с бульонной средой с желчными солями.

Пробирки с лакмусовым молоком.

Поверхностные чашки с нутрозо-агаром.

Case of sterile pipettes, 1 c.c. (in tenths of a c.c.)

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths of a c.c.)

Набор стерильных стеклянных капсул.

Erlenmeyer flasks, 250 c.c. capacity.

Бульонная среда с желчными солями двойной концентрации.

Метод.—

1. Тщательно очистите внешнюю поверхность раковин устриц, очищая каждую по очереди жидким мылом и щеткой для ногтей под краном с проточной водой. Затем, держа раковину устрицы в паре стерильных щипцов, промойте каждую часть внешней стороны раковины струей стерильной воды, вытекающей из аспираторной банки; поместите устрицу внутрь стерильной стеклянной чашки. Повторите процесс с каждой из оставшихся устриц.

2. Прежде чем продолжить, тщательно очистите руки чистой щеткой для ногтей, мылом и водой, затем погрузите их в 2%-й раствор лизола и, наконец, в стерильную воду.

3. Расстелите стерильное полотенце на столе.

4. Возьмите одну из устриц из стерильной стеклянной чашки и положите ее, опираясь на выпуклую раковину, на полотенце. Поверните угол стерильного полотенца над верхней плоской раковиной, чтобы обеспечить более прочный захват левой рукой, которая удерживает раковину в нужном положении.

5. Стерильным ножом для устриц (в правой руке) откройте раковину и отделите тело устрицы от внутренней поверхности верхней плоской раковины. Отогните и отделите плоскую раковину, оставив тело устрицы внутри и прикрепленным к вогнутой раковине. Избегайте проливания ликера.

(Некоторую ловкость в открывании устриц следует приобрести перед проведением этих экспериментов).

6. Разрежьте тело устрицы стерильными ножницами на мелкие кусочки и дайте ликеру, освободившемуся из тела во время процесса, смешаться с ликером, который ранее находился в раковине.

7. Перенесите измельченную устрицу и ликер в цилиндр.

8. Обработайте каждую из оставшихся устриц аналогичным образом.

9. Тщательно перемешайте содержимое цилиндра, помешивая стерильной стеклянной палочкой. Общий объем составит около 100 см³.

10. Используйте 0,1 см³ смешанного ликера для инокуляции каждой из серии трех поверхностных чашек с нутрозо-агаром.

11. Инокулируйте 0,1 см³ смешанного ликера в каждую из трех пробирок с лакмусовым молоком.

12. Добавьте стерильную дистиллированную воду к содержимому цилиндра до 1000 см³, тщательно перемешайте стерильной стеклянной палочкой и дайте отстояться. Бактериальное содержание каждой устрицы можно рассматривать для всех практических целей как содержащееся в 100 см³ жидкости.

13. Расставьте четыре стеклянные капсулы в ряд и пронумеруйте I, II, III, IV. Отпипетируйте по 9 см³ стерильной дистиллированной воды в каждую.

14. В капсулу № I добавьте 1 см³ разбавленного ликера и т. д. из цилиндра и тщательно перемешайте. В капсулу II добавьте 1 см³ разведения из капсулы I и тщательно перемешайте. Перенесите 1 см³ жидкости из капсулы II в капсулу III, после чего добавьте 1 см³ жидкости из капсулы III в капсулу IV.

15. Промаркируйте пробирки с бульонной средой с желчными солями и инокулируйте их следующими количествами разведенных устриц:

No. 6 with 10 c.c. cylinder fluid = 0.1 oyster.

No. 5 with 1 c.c. cylinder fluid = 0.01 oyster.

No. 4 with 1 c.c. capsule I fluid = 0.001 oyster.

No. 3 with 1 c.c. capsule II fluid = 0.0001 oyster.

No. 2 with 1 c.c. capsule III fluid = 0.00001 oyster.

No. 1 with 1 c.c. capsule IV fluid = 0.000001 oyster.

16. Перенесите 100 куб. см жидкости из цилиндра (= 1 устрица) в коническую колбу, добавьте 50 куб. см бульонной среды с желчными солями двойной концентрации и промаркируйте цифрой 7.

17. Сделайте дубликаты всех вышеуказанных культур.

18. Поместите пробирочные культуры в пробирки Бухнера и инкубируйте в анаэробных условиях при температуре 42° C.

Если в пробирке 1 наблюдается рост, то окончательно выделенный микроорганизм, например B. coli, должен был присутствовать в количестве одного миллиона на устрицу.

19. Завершите исследование на наличие представителей группы кишечной палочки-тифа и сточных стрептококков, как указано в разделе «Исследование воды», стр. 429 (шаги 11-21).

20. Инокулируйте серию из 6 пробирок с лакмусовым молоком количествами материала, аналогичными указанным в шаге 15; нагрейте до 80° C в течение десяти минут и инкубируйте в анаэробных условиях при 37° C. Исследуйте на наличие B. enteritidis sporogenes, как указано в разделе «Исследование воды», стр. 438 (шаги 7-10).

ИССЛЕДОВАНИЕ СТОЧНЫХ ВОД И СТОЧНЫХ ЭФФЛУЕНТОВ.

Количественное исследование.—

Сбор пробы.—Поскольку требуется лишь небольшое количество материала, пробы следует собирать способом, аналогичным описанному для количественного исследования воды, и транспортировать в ледяном аппарате, используемом для упаковки таких проб.

Необходимое оборудование.—Как для воды (см. стр. 420).

Метод.—

1. Расставьте четыре стерильные капсулы в ряд и пронумеруйте их I, II, III, IV.

2. Пипеткой внесите 9 куб. см стерильного бульона в капсулу № I.

3. Пипеткой внесите 9,9 куб. см стерильного бульона в капсулы II, III и IV.

4. Добавьте 1 куб. см сточной воды в капсулу № I с помощью стерильной пипетки и тщательно перемешайте.

5. Возьмите чистую стерильную пипетку и перенесите 0,1 куб. см смеси из № I в № II и тщательно перемешайте.

6. Таким же образом перенесите 0,1 куб. см из № II в № III, а затем 0,1 куб. см из № III в № IV.

Теперь 1 куб. см разведения № I содержит 0,1 куб. см исходной сточной воды. 1 куб. см разведения № II содержит 0,001 куб. см исходной сточной воды. 1 куб. см разведения № III содержит 0,00001 куб. см исходной сточной воды. 1 куб. см разведения № IV содержит 0,0000001 куб. см исходной сточной воды.

7. Залейте набор желатиновых чашек из содержимого каждой капсулы, по три чашки в наборе, содержащих соответственно 0,2, 0,3 и 0,5 куб. см разведения. Тщательно промаркируйте; инкубируйте при 20° C в течение трех, четырех или пяти дней.

8. Подсчитайте количество микроорганизмов в тех наборах чашек, где не произошло разжижение, вероятно, в тех, что из разведения III или IV, и рассчитайте на их основе количество, присутствующее в одном кубическом сантиметре исходной пробы сточных вод.

Качественное исследование.—Качественное исследование сточных вод связано с идентификацией и подсчетом тех же бактерий, что рассматривались в соответствующем разделе исследования воды; следовательно, оно проводится по точно таким же принципам, как уже указано (см. стр. 426–441).

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДУХА.

Количественное исследование.—

Необходимое оборудование:

Аспирационная бутыль емкостью 10 литров, снабженная отводной трубкой, горлышко которой закрыто перфорированной резиновой пробкой, через которую проходит короткий отрезок стеклянной трубки.

Erlenmeyer flask, 250 c.c. capacity (having a wide mouth properly plugged with wool), containing 50 c.c. sterile water.

Резиновая пробка, подходящая к горлышку колбы, с двумя отверстиями, оснащенная следующим образом:

Возьмите стеклянную трубку длиной 9 см и согните 3 см на одном конце под прямым углом к основной длине трубки. Пропустите длинное плечо угла через одно из отверстий в пробке; заткните открытый конец короткого плеча ватой.

Возьмите стеклянную воронку диаметром 5 или 6 см со стеблем длиной 12 см и согните стебель близко к вершине воронки, сделав плавный изгиб на четверть круга; пропустите длинный стебель через другое отверстие в резиновой пробке.

Банка для батареи или небольшая водяная баня для размещения конической колбы, обложенной льдом.

Запас колотого льда.

Резиновая трубка.

Винтовые зажимы и пружинные зажимы для трубок.

Стерилизатор для воды.

Штатив и зажимы.

Оборудование для посева на чашки (как для подсчета микроорганизмов в воде, см. стр. 420).

Метод.—

1. Налейте 10 литров воды в аспирационную бутыль и прикрепите кусок резиновой трубки с винтовым зажимом к отводной трубке. Полностью откройте краны и отрегулируйте винтовой зажим опытным путем так, чтобы трубка выдавала 1 куб. см воды каждую секунду. Винтовой зажим больше не трогают во время эксперимента.

При такой скорости аспирационная бутыль опорожнится чуть менее чем за три часа. Закройте кран и снова долейте содержимое аспирационной бутыли до 10 литров.

2. Стерилизуйте подогнанную резиновую пробку с воронкой и трубкой путем кипячения в стерилизаторе для воды в течение десяти минут.

3. Удалите ватную пробку из колбы и замените ее резиновой пробкой с приспособлениями. Убедитесь, что конец стебля воронки погружен в бульон.

4. Поместите колбу в стеклянный или металлический сосуд и обложите ее толченым льдом. Установите колбу с ледяной оболочкой чуть выше горлышка аспирационной бутыли.

Fig. 216.—Arrangement of apparatus for air analysis.

5. Соедините свободный конец стеклянной трубки от колбы — после удаления ватной пробки — с трубкой для входа воздуха в горлышке аспирационной бутыли (рис. 216).

6. Полностью откройте кран и дайте воде стечь.

При необходимости время от времени пополняйте лед.

(Опорожняясь, аспирационная бутыль будет медленно всасывать 10 литров воздуха через воду в конической колбе.)

7. Когда аспирация завершена, отсоедините колбу и извлеките ее из ледяной упаковки.

8. Разжижьте три пробирки с питательным желатином и добавьте в них соответственно 0,5 куб. см, 0,3 куб. см и 0,2 куб. см воды из колбы с помощью стерильной градуированной пипетки, как при количественном исследовании воды. Разлейте по чашкам.

9. Залейте второй аналогичный набор желатиновых чашек.

10. Инкубируйте оба набора чашек при 20° C.

11. Подсчитайте колонии, присутствующие в двух наборах желатиновых чашек через три, четыре или пять дней, и усредните результаты, полученные таким образом; оцените количество микроорганизмов, присутствующих в 1 куб. см, а затем в 50 куб. см бульона в колбе.

12. Результат исследования воздуха обычно выражается как количество бактерий, присутствующих в одном кубическом метре (т. е. килолитре) воздуха; и поскольку количество микроорганизмов, присутствующих только в 50 куб. см воды, представляет собой те, что содержатся в 10 литрах воздуха, полученную цифру необходимо умножить на 100.

Качественное исследование.—

1. Действуйте точно так же, как при количественном исследовании воздуха (см. выше), шаги с 1 по 10.

2. Залейте чашки с сусло-агаром аналогичными количествами воды, зараженной воздухом, и инкубируйте при 37° C.

3. Залейте чашки с питательным агаром аналогичными количествами воды и инкубируйте при 37° C.

4. Залейте аналогичные чашки с сусло-желатином и инкубируйте при 20° C.

5. Отберите отдельные колонии, которые появляются на различных чашках, пересейте их на различные среды и идентифицируйте.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ.

Бактериологическое исследование почвы дает ценную информацию санитарному врачу в ходе процесса гомогенизации «насыпного грунта» (например, зоны свалки городских отходов) и определяет период, в течение которого такая территория может быть надлежащим образом и безопасно использована для строительных целей; или сельскохозяйственному специалисту, информируя его о пригодности любого участка для выращивания сельскохозяйственных культур.

Поверхность земли, подвергающаяся бактерицидному воздействию солнечного света и резким сменам тепла и холода, дождя и ветра, содержит лишь немного микроорганизмов. Кроме того, из-за плотности молекул глубоких слоев почвы и отсутствия аэрации, с одной стороны, и фильтрующего действия верхних слоев почвы и бактериального антагонизма, с другой, бактериальная жизнь практически прекращается на глубине около 2 метров. Промежуточный слой почвы, расположенный на глубине от 25 до 50 см ниже поверхности, неизменно дает наиболее многочисленную и разнообразную бактериальную флору.

Сбор пробы.—Небольшая медная капсула высотой 6 см и диаметром 6 см со съемной крышкой, закрепленной байонетным затвором, предварительно стерилизованная в сушильном шкафу, является наиболее удобным сосудом для проб почвы.

Fig. 217.—Soil scoop.

Инструмент, используемый для фактического извлечения почвы из ее естественного положения, будет варьироваться в зависимости от того, требуются ли нам поверхностные пробы или почва с разной глубины.

(а) Для поверхностных проб используйте железный совок, по форме напоминающий рожок для обуви, но снабженный острым шипом (рис. 217). Его оборачивают асбестовой тканью и стерилизуют в сушильном шкафу. После извлечения из шкафа оберните кусок промасленной бумаги, шелка или гуттаперчевой ткани поверх асбестовой ткани и закрепите его бечевкой в качестве дополнительной защиты от загрязнения.

По прибытии на место, откуда должны быть взяты пробы, покрытия совка снимаются, а асбестовая ткань используется для сметания рыхлых камней и мусора с выбранного участка. Затем поверхностная почва разрыхляется острием совка, соскабливается, собирается в корпус совка и переносится в стерильную капсулу для транспортировки.

Fig. 218.—Fraenkel's borer.

(б) Для глубоких проб, собранных на различных расстояниях от поверхности, можно вырыть экспериментальную траншею на требуемую глубину и собрать пробы в нужных точках на срезе. Однако предпочтительнее использовать какую-либо форму бура, например, разработанную Френкелем (рис. 218).

Земляной бур Френкеля.—Этот инструмент состоит из прочного стержня из твердой стали длиной 150 см, размеченного в сантиметрах от наконечника сверла. Он снабжен поперечной рукояткой (регулируемой в любой точке по длине стержня с помощью винтовой гайки). Терминальные сантиметры толще остальной части стержня, и с одной стороны вырезана вертикальная полость глубиной около 0,5 см. Она закрыта фланцевой втулкой, пока бур ввинчивается в почву по часовой стрелке, и открывается для приема пробы почвы, когда достигнута требуемая глубина, путем изменения направления вращения, и снова закрывается перед извлечением бура из земли путем возобновления первоначального направления вращения. Его можно стерилизовать способом, аналогичным тому, что принят для совка, или путем многократного заполнения полости эфиром и его выжигания.

Количественное исследование.—Полное количественное бактериологическое исследование почвы включает четыре отдельных исследования:

1. Подсчет аэробных микроорганизмов.

2. Подсчет спор аэробов.

3. Подсчет анаэробных микроорганизмов (включая факультативные анаэробы).

4. Подсчет спор анаэробов.

Кроме того, путем объединения результатов первого и второго, а также третьего и четвертого из них, получается соотношение спор к вегетативным формам.

Необходимое оборудование:

Набор стерильных капсул (емкостью 25 куб. см).

Case of sterile graduated pipettes, 10 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).

Case of sterile graduated pipettes, 1 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).

Колба, содержащая 250 куб. см стерильного бульона.

Высокий цилиндр, содержащий 2-процентный раствор лизола.

Штатив для выравнивания чашек.

12 стерильных чашек.

Пробирки с питательным желатином.

Пробирки с сусло-желатином.

Пробирки с питательным агаром.

Пробирки с глюкозо-формиатным желатином.

Пробирки с глюкозо-формиатным агаром.

Водяная баня, отрегулированная на 42° C.

Горелка Бунзена.

Восковой карандаш.

Стерильная ступка и пестик (агатовые).

Стерильная коническая колба с широким горлышком (емкостью 500 куб. см).

Стерильная металлическая воронка с короткой трубкой с широким отверстием, чтобы как раз подходила к горлышку колбы.

Сплошная резиновая пробка, подходящая к колбе (стерилизованная кипячением).

Весы.

Противовес (рис. 107).

Стерильная металлическая (никелевая) ложка или шпатель.

Дробный стерилизатор (рис. 140).

Метод.—

1. Расставьте четыре стерильные капсулы, пронумерованные I, II, III и IV; пипеткой внесите 9 куб. см стерильного бульона в первую капсулу и 9,9 куб. см в каждую из оставшихся трех.

2. Пипеткой внесите 100 куб. см стерильного бульона в коническую колбу.

3. Удалите ватную пробку из колбы и замените ее стерильной воронкой.

4. Поместите колбу и воронку на одну чашку весов и точно уравновесьте.

5. Высыпьте пробу почвы в ступку и тщательно разотрите.

6. С помощью стерильного шпателя добавьте 10 граммов пробы земли в бульон в колбе.

Конечные результаты будут более надежными, если шаги 2, 3, 4 и 5 выполняются под вытяжным шкафом — для защиты от падающей пыли и т. д.

7. Снимите воронку с горлышка колбы; замените ее резиновой пробкой и энергично встряхните; затем дайте твердым частицам осесть в течение примерно тридцати минут. Один кубический сантиметр мутного бульона содержит смывы с 0,1 грамма почвы.

8. Отберите пипеткой 1 куб. см надосадочного бульона, называемого «почвенной водой», и добавьте его к содержимому капсулы I; тщательно перемешайте.

9. Удалите 0,1 куб. см зараженного бульона из капсулы I и добавьте его в капсулу II, перемешайте.

10. Таким же образом добавьте 0,1 куб. см содержимого капсулы II в капсулу III, а затем 0,1 куб. см содержимого капсулы III в капсулу IV.

Тогда 1 куб. см жидкости из капсулы I содержит почвенную воду из 0,01 г земли. Тогда 1 куб. см жидкости из капсулы II содержит почвенную воду из 0,0001 г земли. Тогда 1 куб. см жидкости из капсулы III содержит почвенную воду из 0,000001 г земли. Тогда 1 куб. см жидкости из капсулы IV содержит почвенную воду из 0,00000001 г земли.

(А) Аэробы (вегетативные формы и споры).—

11. Залейте набор желатиновых чашек из содержимого каждой капсулы — по две чашки в наборе, содержащих соответственно 0,1 куб. см и 0,4 куб. см разведенной почвенной воды. Промаркируйте и инкубируйте.

12. Залейте аналогичные наборы чашек с сусло-желатином из содержимого капсул II и III, промаркируйте и инкубируйте при 20° C.

13. Залейте аналогичные наборы агаровых чашек из содержимого капсул II и III; промаркируйте и инкубируйте при 37° C.

14. Отвесьте вторую пробу почвы — 10 граммов — высушите на водяной бане до постоянного веса и рассчитайте соотношение

wet soil weight

———————

dry soil weight

15. «Подсчитайте» чашки после инкубации в течение трех, четырех или пяти дней и, скорректировав полученные таким образом цифры с помощью соотношения «влажной» к «сухой» почве, оцените—

(а) Количество аэробных микроорганизмов, присутствующих в одном грамме почвы.

(б) Количество дрожжей и плесневых грибов, присутствующих в одном грамме почвы.

(в) Количество аэробных микроорганизмов, «растущих при 37° C», присутствующих в одном грамме почвы.

(Б) Анаэробы (вегетативные формы и споры).—

16. Залейте аналогичные наборы чашек с глюкозо-формиатным желатином и агаром и инкубируйте в анаэробном аппарате Буллока.

(В) Аэробы и анаэробы (только споры).—

17. Пипеткой внесите 5 куб. см почвенной воды в стерильную пробирку.

18. Поместите в дифференциальный стерилизатор при 80° C на десять минут.

19. Залейте два набора из четырех желатиновых чашек, содержащих соответственно 0,1, 0,2, 0,5 и 1 куб. см почвенной воды; промаркируйте и инкубируйте при 20° C, один набор в аэробных условиях, другой в анаэробных в аппарате Буллока.

20. «Подсчитайте» чашки (отложите подсчет как можно дольше) и оцените количество спор аэробов и анаэробов, присутствующих соответственно в одном грамме почвы.

21. Рассчитайте соотношение, существующее между спорами и спорами + вегетативными формами в каждой из двух групп, аэробных и анаэробных микроорганизмов.

Качественное исследование.—Качественное исследование почвы обычно направлено на обнаружение одного или нескольких из следующих микроорганизмов:

Представители группы кишечной палочки-тифа.

Стрептококки.

Bacillus anthracis.

Bacillus tetani.

Bacillus œdematis maligni.

Нитрифицирующие микроорганизмы (нитритные).

Нитрифицирующие микроорганизмы (нитратные).

1. Перенесите остаток почвенной воды (88 куб. см) в стерильную коническую колбу с помощью стерильного сифона.

2. Установите фильтрующее устройство, как для качественного исследования воды, и отфильтруйте почвенную воду.

3. Суспендируйте бактериальный осадок в 5 куб. см стерильного бульона (техника аналогична описанной для пробы воды, см. стр. 434–436).

Каждый кубический сантиметр суспензии теперь содержит почвенную воду почти из 1 грамма земли.

Методы до этого момента идентичны, независимо от того, какой микроорганизм или группу микроорганизмов желательно выделить; но с этого этапа процесс немного варьируется для каждой конкретной бактерии.

I. Группа кишечной палочки-тифа.—

II. Стрептококки.—

III. Bacillus anthracis.—

IV. Bacillus tetani.—

Методы, принятые для выделения этих микроорганизмов, идентичны тем, что уже описаны в разделе «Вода» (стр. 437 и далее).

V. Bacillus œdematis maligni.—Метод точно такой же, как применяемый для B. tetani.

VI. Нитритные микроорганизмы.—

1. Возьмите десять пробирок с раствором Виноградского № I (см. стр. 198) и пронумеруйте их последовательно от 1 до 10.

2. Инокулируйте каждую пробирку различными количествами материала следующим образом:

To tube No. 1 add 1.0 c.c. of the soil water.

To tube No. 2 add 0.1 c.c. of the soil water.

To tube No. 3 add 1.0 c.c. from Capsule I.

To tube No. 4 add 0.1 c.c. from Capsule I.

To tube No. 5 add 1.0 c.c. from Capsule II.

To tube No. 6 add 0.1 c.c. from Capsule II.

To tube No. 7 add 1.0 c.c. from Capsule III.

To tube No. 8 add 0.1 c.c. from Capsule III.

To tube No. 9 add 1.0 c.c. from Capsule IV.

To tube No. 10 add 0.1 c.c. from Capsule IV.

Промаркируйте и инкубируйте при 30° C.

VII. Нитратные микроорганизмы.—

3. Возьмите десять пробирок с раствором Виноградского № II, пронумеруйте их последовательно от 1 до 10 и инокулируйте количествами почвенной воды, аналогичными тем, что перечислены в разделе VI, шаг 2. Промаркируйте и инкубируйте при 30° C.

4. Исследуйте после двадцати четырех и сорока восьми часов инкубации. Из тех пробирок, которые показывают признаки роста, сделайте пересевы в свежие пробирки с той же средой и инкубируйте при 30° C.

5. Сделайте дальнейшие пересевы из тех пробирок, которые показывают рост, и снова инкубируйте.

6. Если в этих пересевах происходит рост, сделайте поверхностные мазки на чашках с силикатным желе Виноградского (см. стр. 198).

7. Отберите колонии, которые появляются, и пересейте на каждую из этих двух сред.

ИСПЫТАНИЕ ФИЛЬТРОВ.

Фарфоровые фильтрующие свечи исследуются на предмет их способности задерживать все микроорганизмы, взвешенные в жидкостях, которые фильтруются через них, и пропускать только стерильные фильтраты. Чтобы определить отсутствие в фильтре дефектов и трещин, которые позволили бы бактериям пройти, независимо от того, насколько совершенна общая структура свечи, свечу необходимо сначала прикрепить с помощью длинного куска напорной трубки к мощному насосу, такому как ножной велосипедный насос, оснащенный манометром. Затем свечу погружают в банку с водой и держат полностью погруженной, пока внутреннее давление постепенно не повышается до двух атмосфер действием насоса. Любая трещина или дефект сразу станут очевидными из-за потока пузырьков воздуха, выходящих из них.

Исследование на проницаемость проводится следующим образом:

Необходимое оборудование:

Фильтрующее устройство: используемая фильтрующая свеча должна быть той самой, которую предполагается испытать, и должна быть предварительно тщательно стерилизована; устройство аппарата, естественно, будет варьироваться в зависимости от каждой формы фильтра, одной из тех, что уже описаны (см. стр. 42–48).

Штатив для выравнивания чашек.

Набор стерильных чашек.

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths).

Case of sterile pipettes, 1 c.c. (in tenths).

Пробирки с питательным желатином.

Колба, содержащая стерильный физиологический раствор.

Sterile measuring flask, 1000 c.c. capacity.

Метод.—

1. Приготовьте поверхностные культуры Bacillus mycoides на питательном агаре в культуральной бутыли и инкубируйте при 20° C в течение сорока восьми часов.

2. Пипеткой внесите 5 куб. см стерильного физиологического раствора в культуральную бутыль и эмульгируйте в нем весь поверхностный рост.

3. Пипеткой перенесите эмульсию в стерильную мерную колбу и доведите до 1000 куб. см добавлением стерильной воды.

4. Залейте эмульсию в резервуар фильтра и начните фильтрацию.

5. Когда фильтрация завершена, залейте шесть агаровых чашек, каждая из которых содержит 1 куб. см фильтрата.

6. Инкубируйте при 37° C до завершения семи дней, если это необходимо.

7. Если фильтрат не стерилен, пересейте прошедший микроорганизм и определите его идентичность с тест-бактерией, прежде чем выбраковывать фильтр — поскольку фильтрат мог быть случайно загрязнен.

8. Если фильтрат стерилен, рестерилизуйте свечу и повторите тест, теперь заменив его культурой B. prodigiosus — бациллы меньшего размера.

9. Если второй тест удовлетворительный, испытайте свечу против культуры очень маленького кокка, например Micrococcus melitensis, аналогичным образом; в этом случае продолжая инкубацию культур из фильтрата в течение четырнадцати дней.

ИСПЫТАНИЕ ДЕЗИНФЕКТАНТОВ.

Методы уже были подробно описаны (стр. 310) с целью изучения жизненной устойчивости микроорганизмов к летальному эффекту гермицидов. Но часто случается, что бактериологу приходится определять относительную эффективность «дезинфектантов» с точки зрения санитарии и коммерции, а не с точки зрения исследователя. При проведении этого направления исследований удобно сравнивать эффективность предлагаемого дезинфектанта в лабораторных условиях с эффективностью какого-либо стандартного гермицида, такого как чистый фенол. При этом, и для того чтобы можно было сравнивать работу разных наблюдателей, следует стремиться к максимально единообразным условиям. Описанный метод — это метод, который использовался автором в течение многих лет, недавно модифицированный принятием некоторых рекомендаций Комиссии Ланцета по стандартизации дезинфектантов — особенно расчета для определения фенольного коэффициента.

Этот метод имеет много общего с той модификацией «капельного» метода, которая известна как тест Риделя-Уокера.

Общие соображения.—

Их можно сгруппировать под тремя заголовками: Тестовый микроб, Гермицид и Окружающая среда.

1. Тестовый микроб.—B. coli.

Поскольку дезинфектанты тестируются для санитарных целей, очевидно, что в качестве тестового микроба следует выбирать представителя группы кишечной палочки-тифа. B. coli выбирается из-за его относительной непатогенности, легкости, с которой он может быть выделен и идентифицирован разными наблюдателями в разных частях мира, стабильности его фундаментальных характеристик и равномерности его устойчивости при использовании для этих тестов; наконец, поскольку кишечная палочка — это микроорганизм, который немного более устойчив к летальному действию гермицидов, чем более патогенные представители этой группы, в тест вводится запас прочности, который, безусловно, повышает его ценность.

B. coli должен быть недавно выделен из нормального стула и высеян на чашки не менее двух раз, чтобы обеспечить чистоту штамма; и должна быть приготовлена исходная агаровая культура, которая должна использоваться на протяжении любого конкретного теста. Для любого конкретного эксперимента приготовьте мазковую культуру на агаре и инкубируйте при 37° C в течение 24 часов в анаэробных условиях. Затем эмульгируйте весь поверхностный рост в 10 куб. см стерильной воды. Перенесите эмульсию в стерильную пробирку с несколькими стерильными стеклянными бусинами и тщательно встряхните, чтобы обеспечить гомогенную эмульсию. Перенесите в центрифужную пробирку и центрифугируйте эмульсию, чтобы осадить любые массы бактерий, которые могли избежать дезинтегрирующего действия бусин. Пипеткой отберите надосадочную эмульсию для использования в тесте.

2. Гермицид.—

а. Дезинфектант, подлежащий тестированию.—

Первым важным моментом является тестирование неизвестного дезинфектанта, который можно назвать гермицидом-x, по принципам, изложенным на стр. 311, для определения его коэффициента ингибирования.

После того как эта константа установлена, приготовьте различные растворы гермицида-x со стерилизованной дистиллированной водой точными объемными методами, начиная с раствора, несколько более сильного, чем тот, который представляет коэффициент ингибирования. Растворы должны быть приготовлены в довольно большом объеме, при этом для приготовления любого процентного раствора используется не менее 5 куб. см дезинфектанта.

б. Стандартный контроль.—Фенол.

Стандартный гермицид, используемый для сравнения, должен быть таким, который не подвержен изменениям в своем химическом составе, и тем, который получил почти универсальное применение, является фенол.

Следующая таблица показывает влияние различных процентных концентраций карболовой кислоты на B. coli при различном времени контакта, составленная на основе эксперимента, проведенного в стандартных условиях, упомянутых в разделе «Окружающая среда». Результаты тесно соответствуют тем, что были зарегистрированы Комиссией Ланцета по дезинфектантам в 1909 году.

Percentage of phenol Contact time in minutes. 2-1/2 510 15 20 25 30 35 1.20 - - - - - - - - 1.10 - - - - - - - - 1.0 + - - - - - - - 0.9 + - - - - - - - 0.85 + + - - - - - - 0.80 + + + - - - - - 0.75 + + + + + - - - 0.7 + + + + + + - - 0.65 + + + + + + + -

- = Нет роста, т. е. бактерии убиты. + = Рост, т. е. бактерии все еще живы.

Из этого видно, что необходимо будет приготовить следующие процентные растворы, а именно: 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,75%, 0,7% в качестве контроля для каждого эксперимента.

Приготовьте растворы различной процентной концентрации, отвесив количество карболовой кислоты, необходимое для каждого, и растворив в 100 куб. см чистой дистиллированной воды в точно стандартизированной мерной колбе. Растворы должны готовиться свежими по мере необходимости каждый день.

Окружающая среда.—

а. Общие положения.—

Закройте окна и двери лаборатории, в которой проводится исследование, чтобы избежать сквозняков. Промойте рабочий стол и прилегающий пол раствором сулемы 1:1000. Предупредите ассистента, если таковой имеется, чтобы он избегал ненужных движений или разговоров.

б. Температура контакта, 15–18° C.—

Это температура, при которой происходит контакт между гермицидом и тестовым микробом, и она важна, поскольку некоторые гермициды (например, фенол) кажутся более мощными при высоких температурах. 18° C — практически обычная комнатная температура — это температура, при которой размножение B. coli является сравнительно медленным процессом, но отклонение на градус выше этой температуры или на два-три градуса ниже не имеет значения. Если комнатная температура ниже 15° C во время проведения экспериментов, установите водяную баню, отрегулированную на 18° C, для размещения пробирок, содержащих смесь микроба и гермицида; если выше 19° C, погрузите пробирки в холодную воду, в которую время от времени добавляются небольшие кусочки льда, чтобы предотвратить повышение температуры выше 18° C.

в. Относительный пропорциональный объем тестового микроба и гермицида, 50:1.—

Пять кубических сантиметров — это удобное количество гермицидного раствора для использования, и к нему следует добавить 0,1 куб. см эмульсии тестового микроба.

г. Объем пробы, удаляемой из смеси микроба и гермицида в каждый из периодов времени, 0,1 куб. см.—

Этого достаточно, чтобы получить справедливую пробу микробного содержания смеси, и в то же время недостаточно, чтобы оказать какое-либо ингибирующее действие при переносе в среду для пересева.

д. Среда для пересева. Бульон с желчными солями.—

Жидкая среда необходима для получения немедленного разведения перенесенного гермицида; в то же время выгодно использовать селективную среду, которая благоприятствует росту тестового микроба, исключая организмы, способные загрязнить препарат, и, если возможно, такую, которая дает характерные культурные признаки.

Бульон с желчными солями (стр. 180) сочетает в себе эти пожелания; он позволяет расти только кишечным бактериям, в то время как образование кислой реакции и выделение газа в пересевах, приготовленных из смеси микроба и гермицида, является довольно полным доказательством присутствия живых B. coli.

Количество среды, присутствующей в каждой пробирке, является важным вопросом, поскольку среда не только обеспечивает питание для тестового микроба, но также действует как разбавитель для гермицида, чтобы снизить его концентрацию ниже коэффициента ингибирования. Для рутинной работы каждая пробирка для пересева содержит 10 куб. см среды, но очевидно, что если гермицид-x обладает коэффициентом ингибирования 0,1%, добавление 0,1 куб. см 10-процентного раствора к 10 куб. см среды эффективно предотвратило бы последующий рост тестового микроба после периода контакта, недостаточного для уничтожения его жизнеспособности. Следовательно, предварительные тесты могут в некоторых случаях указывать на необходимость присутствия 12 куб. см, 15 куб. см или более жидкой среды в культуральных пробирках.

е. Температура инкубации, 37° C.—

ж. Период наблюдения за пересевами, семь дней.—

Чтобы определить, были ли уничтожены тестовые микробы, наблюдения должны всегда продолжаться — когда рост кажется отсутствующим — до конца семи дней, прежде чем записывать «нет роста».

з. Идентификация организмов, развивающихся в пересевах после контакта в растворе микроба и гермицида.—

Это основано на видимых невооруженным глазом характеристиках роста в бульоне с желчными солями, дополненных при необходимости методами посева на чашки, дальнейшими пересевами на углеводные среды и реакциями агглютинации. Знак (+) используется для обозначения того, что рост тестового организма произошел в пересевах, а знак (-) — для обозначения того, что тестовые микробы были уничтожены и последующего роста не произошло.

Метод.—

Необходимое оборудование:

Стерильные пробирки (узкие, диаметром не более 1,3 см).

Штатив для пробирок (рис. 219).

Sterile graduated pipettes in case, 1 c.c. (in tenths).

Sterile graduated pipettes in case, 5 c.c. (in c.c.).

Круглые резиновые шайбы диаметром 2,5 см с центральным отверстием, стерилизованные кипячением непосредственно перед использованием, затем перенесенные в стерилизованную стеклянную двойную чашку.

Электрические сигнальные часы или секундомер.

Стерильный пинцет.

Стерилизованные стеклянные бусины.

Аппарат для встряхивания.

Восковой карандаш.

Необходимые материалы:

Процентные растворы гермицида-x (см. стр. 481).

Процентные растворы чистого фенола (см. стр. 482).

Водная эмульсия B. coli (см. стр. 481).

Пробирки с бульоном с желчными солями.

Предварительные тесты.—

а. Коэффициент ингибирования.—

Определите самый низкий процент гермицида-x, который ингибирует рост B. coli в бульоне с желчными солями, и самый высокий процент, который не ингибирует (стр. 311). На основе результата этого эксперимента определите объем среды, необходимый в пробирках для пересева, и процентные растворы, которые будут использоваться в пробном прогоне. Предполагая, что коэффициент ингибирования составляет 1:1000, будет вполне безопасно использовать обычные культуральные пробирки, содержащие 10 куб. см среды в последующих экспериментах.

б. Пробный прогон.—

Определите летальный эффект серии из пяти растворов гермицида-x (скажем, 1:100, 1:250, 1:300, 1:500, 1:600) при времени контакта 2,5, 5, 25 и 30 минут следующим образом: