XIX. Группа столбняка.
Bacillus tetani.
Bacillus œdematis maligni.
Bacillus chauvei (symptomatic anthrax).
XX. Группа Enteritidis sporogenes.
Bacillus enteritidis sporogenes.
B. botulinus.
B. butyricus.
B. cadaveris.
СНОСКИ:
[15] См. примечание о лицензии на вивисекцию, стр. 334.
XXI. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ АНАЛИЗЫ.
Каждый бактериологический или бактериоскопический анализ воздуха, земли, сточных вод, различных пищевых продуктов и т. д. включает, как правило, два отдельных исследования, дающих результаты очень неравной ценности:
1. Quantitative.
2. Qualitative.
Первое является чисто количественным и как таковое имеет второстепенное значение, поскольку оно направлено просто на подсчет (приблизительный) общего количества бактерий, присутствующих в любой данной единице объема, независимо от природы и характера отдельных организмов.
Второе и более важное исследование носит как качественный, так и количественный характер, поскольку оно направлено на то, чтобы точно идентифицировать такие патогенные бактерии, которые могут присутствовать, в то время как, попутно, рекомендуемые методы рассчитаны на то, чтобы с достаточной степенью точности указать числовую частоту таких бактерий в образце, находящемся под исследованием.
Общие принципы, лежащие в основе бактериологических анализов воды, сточных вод, воздуха и пыли, почвы, молока, мороженого, мяса и других консервированных продуктов, как это показано методами, используемыми автором, указаны на следующих страницах, вместе с методами тестирования фильтров и химических бактерицидов; и техника, изложенная там, окажется способной к расширению и адаптации к любым обстоятельствам или набору обстоятельств, с которыми может столкнуться студент.
Контроли. — Необходимость существования адекватных контролей во всей экспериментальной работе не может быть слишком настойчиво подчеркнута. Каждая партия чашек, которая заливается, должна включать по крайней мере одну с предположительно «стерильной» средой; чашечные или пробирочные культуры должны быть сделаны из различных разбавляющих жидкостей; каждая пробирка с углеводной средой, которая инокулируется, должна поступать в инкубатор в компании с аналогичной, но неинокулированной пробиркой, и так далее.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ.
Бактерии, присутствующие в воде, могут включать не только разновидности, которые имеют свою нормальную среду обитания в воде и, следовательно, будут развиваться при 20° C, но также, если вода была загрязнена экскрементами, разновидности, которые произошли из организма животного или являются патогенными для него и которые будут хорошо развиваться только при температуре 37° C. Чтобы продемонстрировать присутствие каждого из этих классов, необходимо будет инкубировать различные культуры при каждой из этих температур.
Далее, образец воды может содержать плесень, дрожжи или торулы, и развитие их будет лучше всего обеспечено путем посева в сусло-желатин и инкубации при 20° C.
1. Количественный.
Сбор образца. — Наиболее подходящими сосудами для приема образца воды являются небольшие стеклянные бутылки емкостью 60 см³ с узкими горлышками и нависающими стеклянными пробками (для предотвращения загрязнения горлышек бутылок падающей пылью). Они должны быть тщательно стерилизованы в стерилизаторе горячим воздухом (см. стр. 31).
(a) Если образец получен из крана или трубы, включите воду и дайте ей течь в течение нескольких минут. Удалите пробку из бутылки и удерживайте ее в руке, пока вода течет в бутылку и заполняет ее на три четверти. Замените пробку и привяжите ее, но не запечатывайте.
(b) Если образец получен из ручья, резервуара или водохранилища, закрепите кусок прочной проволоки вокруг горлышка бутылки, удалите пробку и удерживайте ее в руке. Затем, используя проволоку в качестве ручки, погрузите бутылку в воду горлышком вниз, пока она не окажется глубоко под поверхностью; затем переверните ее, дайте наполниться и извлеките из воды. Вылейте несколько кубических сантиметров воды из бутылки, замените пробку и привяжите ее.
Fig. 203.—Esmarch's collecting bottle for water samples.
(c) Если образец получен из озера, реки или моря; или когда желательно сравнить образцы, взятые на разной глубине, используется аппарат, разработанный фон Эсмархом (рис. 203). В нем стерилизованная бутылка заключена в утяжеленную металлическую клетку, которую можно опустить с помощью градуированной линии до достижения необходимой глубины. В этой точке бутылка открывается тонким проволочным шнуром, прикрепленным к пробке; когда бутылка полна (судя по прекращению подъема пузырьков воздуха), натяжение шнура ослабляется, и напряжение спиральной пружины над пробкой снова вдавливает ее в горлышко бутылки. Когда аппарат вынимают из воды, маленькие бутылки наполняют из него и упаковывают в ледяной ящик, упомянутый ниже.
Недорогую замену бутылке Эсмарха можно сделать в лаборатории следующим образом:
Выберите широкогорлую стеклянную бутылку с притертой пробкой емкостью около 500 см³ (около 20 см в высоту и 8 см в диаметре).
Удалите стеклянную пробку и вставьте на ее место резиновую пробку с двумя отверстиями.
Через одно отверстие пропустите кусок стеклянной трубки длиной около 5 см, а через другое — кусок длиной 22 см, достигающий почти дна бутылки, причем каждая трубка выступает примерно на 2,5 см над резиновой пробкой. Заткните открытые концы трубок ватой. Закрепите пробку на месте тонкой медной проволокой.
Fig. 204.—Thresh's deep water sampling bottle.
Стерилизуйте подготовленную бутыль в автоклаве. Удалите ватные пробки и соедините выступающие трубки отрезком свободно прилегающей прочной резиновой трубки длиной около 5 см, предварительно простерилизованной кипячением.
Возьмите отрезок прочного резинового шнура длиной около 33 см и диаметром 10 мм (такой, как используется для дверных пружин), наденьте на него стальное разрезное кольцо и плотно закрепите свободные концы на горлышке бутыли с помощью шнура или кетгута.
Прикрепите шнур, используемый для опускания бутыли в воду, к разрезному кольцу на резиновом подвесе. Лучшим материалом для этой цели является изолированный хлопчатобумажной оплеткой электрический провод, завязанный узлом через каждый метр.
Соедините разрезное кольцо также с коротким отрезком резиновой трубки, объединяющей две стеклянные трубки, с помощью кетгута (или тонкой медной проволоки) такой длины, чтобы при подвешивании бутыли резиновая трубка не натягивалась, но при этом легко соскакивала при резком рывке за подвесной шнур.
Теперь оберните тяжелую свинцовую трубку диаметром около 1 см вокруг верхней части бутыли, начиная от горлышка чуть выше плечиков. Это обеспечивает погружение бутыли в вертикальном положении (рис. 204).
Подготовленный аппарат опускают на требуемую глубину, затем делают резкий рывок за подвесной шнур, который отсоединяет резиновую трубку и тем самым открывает две стеклянные трубки. Вода поступает через более длинную трубку, а воздух вытесняется через более короткую. Пузырьки воздуха можно видеть или слышать, как они поднимаются через воду, пока бутыль не заполнится почти полностью, при этом в горлышке бутыли остается небольшой объем сжатого воздуха.
По мере подъема аппарата заключенный в нем воздух расширяется и предотвращает поступление дополнительного количества воды с меньшей глубины.
Fig. 205.—Ice-box for transmission of water samples, etc.
Транспортировка пробы. — Если исследование пробы нельзя начать немедленно, необходимо принять меры для предотвращения размножения бактерий, содержащихся в воде, в течение времени, затраченного на транспортировку от места сбора до лаборатории. Для этой цели необходим ледник, подобный показанному (на рис. 205). Он состоит из металлического цилиндра с двойными стенками, в который вставляется цилиндрическая камера достаточной вместимости для размещения четырех бутылей по 60 см³; она, в свою очередь, закрывается металлическим диском — все три части скрепляются винтами с накатанной головкой через выступающие фланцы. При использовании поместите бутыли, обернутые ватой, в центральную камеру, заполните пространство между стенками дробленым льдом, надежно закройте металлическую коробку, завинтив барашковые гайки, и поместите ее в деревянный ящик с войлочной подкладкой. (Было показано, что, хотя бактерии выживают при воздействии температуры тающего льда, практически ни одна из них не размножается при этой температуре.)
По прибытии в лабораторию метод исследования заключается в добавлении отмеренных количеств пробы воды в несколько пробирок с питательными средами, предварительно разжиженными нагреванием, приготовлении чашечных культур из каждой из этих пробирок, инкубации при подходящей температуре и, наконец, подсчете колоний, появившихся на чашках.
Необходимая аппаратура:
Plate-levelling stand.
Case of sterile plates.
Case of sterile pipettes, 1 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).
Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).
Case of sterile capsules, 25 c.c. capacity.
Tubes of nutrient gelatine.
Tubes of nutrient agar.
Tubes of wort gelatine.
One 250 c.c. flask of sterile distilled water.
Tall cylinder containing 2 per cent. lysol solution.
Bunsen burner.
Grease pencil.
Water-bath regulated at 42° C.
Метод. —
1. Установите платформу для выравнивания чашек, заполнив ее водяной отсек водой при температуре 45° C.
2. Пронумеруйте пробирки с агаром последовательно от 1 до 6; пробирки с желатином — от 1 до 6, а пробирки с суслом — 1, 2 и 3. Прокалите пробки и убедитесь, что они не прилипли к краям пробирок.
3. Поместите пробирки с агаром в кипящую воду до расплавления среды, затем перенесите их на водяную баню, отрегулированную на 42° C. Разжижьте питательный желатин и желатин на сусле в пробирках, погрузив их на ту же водяную баню.
4. Выньте бутыль с пробой воды из ледника, равномерно распределите бактериальное содержимое по всему объему воды путем встряхивания, разрежьте шнурок, удерживающий пробку, и ослабьте пробку, но не вынимайте ее.
Fig. 206.—Withdrawing water from water sample bottle.
5. Возьмите одну из пипеток объемом 1 см³ из футляра, держа ее за гладкую часть трубки. Дважды проведите градуированную часть через пламя горелки Бунзена. Наклоните бутыль с пробой воды на столе, удерживая горлышко между средним и безымянным пальцами левой руки; захватите головку пробки указательным и большим пальцами и выньте ее из бутыли.
6. Введите пипетку в горлышко бутыли, удерживая ее кончик значительно ниже поверхности воды (рис. 206). Наберите в пипетку чуть больше 1 см³ и дайте ей вытечь; это увлажнит внутреннюю поверхность пипетки и сделает возможным точное измерение. Теперь наберите в пипетку ровно 1 см³. Выньте пипетку из бутыли, верните пробку на место и поставьте бутыль вертикально.
7. Возьмите первую расплавленную пробирку с агаром в левую руку, удалите ватную пробку и добавьте в ее содержимое 0,5 см³ пробы воды из пипетки; снова закройте пробирку пробкой и верните ее на водяную баню. Аналогичным образом добавьте 0,3 см³ воды в содержимое второй пробирки и 0,2 см³ — в содержимое третьей.
8. Аналогичным образом добавьте 1 см³ пробы в содержимое четвертой пробирки.
9. Аналогично добавьте 0,5 см³ и 0,1 см³ соответственно в содержимое пятой и шестой пробирок.
10. Опустите пипетку в цилиндр с раствором лизола.
11. Смешайте пробу воды со средой в каждой пробирке способом, описанным в разделе «Чашечные культуры»; залейте чашку из каждой пробирки. Наклейте на каждую чашку этикетку с указанием (а) отличительного номера пробы, (b) количества содержащейся в ней пробы воды и (c) даты.
12. Вылейте содержимое пробирки с расплавленным агаром — без инокуляции — в чашку Петри в качестве контроля для демонстрации стерильности используемой партии агара.
13. Дайте чашкам застыть и инкубируйте при 37° C.
14. Опорожните водяной отсек выравнивающего аппарата и наполните его ледяной водой.
15. С помощью стерильной пипетки объемом 10 см³ внесите 9,9 см³ стерильной дистиллированной воды в стерильную стеклянную капсулу.
16. Добавьте 0,1 см³ пробы воды к 9,9 см³ стерильной воды в капсуле. Это даст разведение 1 к 100.
17. Засейте шесть пробирок с питательным желатином следующим образом: в первую пробирку добавьте 0,5 см³ пробы воды непосредственно из бутыли; во вторую — 0,3 см³; в третью — 0,2 см³; и залейте чашку из каждой пробирки. В четвертую пробирку добавьте 0,5 см³ разведенной пробы воды из капсулы; в пятую — 0,3 см³; в шестую — 0,2 см³; и залейте чашку из каждой.
18. Наклейте на каждую чашку этикетку с указанием количества содержащейся в ней пробы воды — то есть 0,5 см³, 0,3 см³, 0,2 см³, 0,005 см³, 0,003 см³ и 0,002 см³.
19. Залейте контрольную (неинокулированную) чашку с желатином.
20. Дайте чашкам застыть и инкубируйте при 20° C.
21. В первую пробирку с расплавленным желатином на сусле добавьте 0,5 см³ пробы воды; во вторую — 0,3 см³; в третью — 0,2 см³.
22. Наклейте этикетки на чашки, дайте им застыть и инкубируйте при 20° C.
23. Подсчитайте и запишите количество колоний, развившихся на агаре при 37° C после сорока восьми часов инкубации.
24. Отметьте количество колоний, присутствующих на каждой из чашек с желатином и желатином на сусле после сорока восьми часов инкубации.
25. Верните чашки с желатином и желатином на сусле в инкубатор; наблюдайте снова через три, четыре и пять дней.
26. Рассчитайте и запишите количество организмов, присутствующих в одном кубическом сантиметре исходной воды, исходя из среднего значения по шести чашкам с желатином на максимально поздний срок до семи дней — наличие разжижающих бактерий может сделать расчет необходимым на более раннем сроке, отсюда важность ежедневных наблюдений.
Метод подсчета. — Наиболее точным методом подсчета колоний на каждой из чашек является использование счетного диска Джеффри или Пейкса. Каждый из этих дисков представляет собой кусок бумаги, на котором напечатан абсолютно черный диск, разделенный концентрическими окружностями и радиусами, напечатанными белым цветом. В счетчике Джеффри (рис. 207) каждое подразделение имеет площадь 1 квадратный сантиметр; в счетчике Пейкса (рис. 208) радиусы делят круг на шестнадцать равных секторов, а подсчет облегчается концентрическими окружностями, равноудаленными от центра.
Fig. 207.—Jeffery's disc, reduced.
Fig. 208.—Pakes' disc, reduced.
(а) При окончательном подсчете каждой чашки поместите чашку поверх счетного диска и отцентрируйте ее, если возможно, совместив ее периферию с той или иной концентрической окружностью.
(b) Снимите крышку чашки и с помощью ручной лупы подсчитайте колонии, появляющиеся в каждом из секторов по очереди. Сделайте пометку о количестве, присутствующем в каждом из них.
(c) Если колоний менее 500, следует подсчитать всю чашку целиком. Если же их число превышает это значение, подсчитайте половину или четверть чашки, или подсчитайте сектор здесь и там, и на основе этих цифр оцените количество колоний, присутствующих на всей чашке. На практике обнаружится, что диск Пейкса более подходит для первого класса чашек; диск Джеффри — для второго. Однако следует помнить, что если чашки не были тщательно выровнены и среда не имеет одинаковой толщины по всей поверхности, бесполезно пытаться выводить среднее значение по малым площадям, поскольку там, где среда толстая, будут развиваться все бактерии, а там, где слой тонкий, лишь немногие бактерии найдут достаточно питательного субстрата для образования видимых колоний.
Следует отметить, что количества воды, выбранные для добавления в каждый набор пробирок с питательными средами, были тщательно подобраны для получения пригодных для работы результатов даже при работе с сильно различающимися пробами. Чашки, приготовленные на агаре с 0,1 см³ и на желатине с 0,02 см³, можно подсчитать даже при наличии в пробе большого количества бактерий; тогда как если микроорганизмов относительно мало, агаровая чашка № 4 и желатиновая чашка № 1 дадут наиболее надежные результаты подсчета. Кроме того, результаты подсчета чашек в некоторой степени контролируют друг друга; например, вторая и третья чашки каждой серии с желатином должны вместе содержать столько же колоний, сколько первая, а вторая должна содержать примерно вдвое больше, чем третья, и так далее.
2. Качественный анализ. —
Сбор пробы. — Проба воды, необходимая для рутинного исследования, которое удобно рассмотреть в первую очередь, составляет около 110 см³. Ее собирают способом, описанным ранее (см. стр. 416); используются аналогичные бутыли, и если заполнить четыре из них, то суммарное содержимое, составляющее около 240 см³, обеспечит достаточный материал как для качественного, так и для количественного анализа. Если исследование не может быть начато немедленно, необходимо использовать ледник, иначе водные бактерии и другие сапрофиты, вероятно, будут размножаться за счет микробов, указывающих на загрязнение, и тем самым увеличат трудности исследования.
При рутинном исследовании водоснабжения принято ограничивать качественный анализ поиском
A. B. coli и ее близких родственников.
B. Стрептококков,
организмов, которых часто называют индикаторными микробами, так как их присутствие считается доказательством загрязнения воды материалом, происходящим из пищеварительного тракта млекопитающих, и, таким образом, представляет собой сигнал опасности.
C. Некоторые исследователи до сих пор придают значение присутствию B. enteritidis sporogenes, но поскольку поиск этой бактерии (относительно редкой в воде) требует сбора довольно большого количества воды, она обычно не включается в рутинное исследование.
В случае проб воды, исследуемых во время эпидемии, новых источников водоснабжения и неизвестных вод, поиск расширяется, охватывая других представителей группы кишечной палочки — тифа; и иногда может потребоваться исследование вопроса о присутствии или отсутствии Vibrio choleræ или (реже) таких бактерий, как B. anthracis или B. tetani.
Когда в воде присутствуют патогенные или экскрементальные бактерии, их количество относительно невелико из-за разбавления, которому они подверглись, и при начале исследования обычно принято применять один из следующих методов:
A. Обогащение, при котором безвредные непатогенные бактерии могут быть уничтожены или их рост подавлен, в то время как рост паразитических бактерий поощряется.
Это достигается путем такой организации среды (т. е. среды, температуры инкубации и атмосферы), чтобы способствовать росту патогенных организмов за счет безвредных сапрофитов.