«Основы бактериологической техники»

Голубь. — Красные кровяные тельца напоминают таковые у домашней птицы, и можно отметить аналогичные разновидности внешнего вида. Гранулы тех клеток, которые соответствуют полиморфноядерным лейкоцитам, палочковидные, но меньше и тоньше, чем у домашней птицы, и не имеют булавовидного вида. Ядро не полиморфное и лишь изредка разделено. Кокковидные гранулы эозинофильных клеток окрашиваются более глубоко оксифильно, чем таковые у соответствующих клеток домашней птицы.

Приготовление сухих мазков для этого гистологического исследования крови проводится следующим образом:

1. Небольшие образцы крови для приготовления мазков крови наиболее удобно получать из вен уха у большинства обычных лабораторных животных, а именно: обезьяны, козы, собаки, кошки, кролика, морской свинки; у голубя и домашней птицы следует пунктировать подмышечную вену; у крысы и мыши — либо вену в ухе, либо, предпочтительно, путем ранения кончика хвоста; у лягушки следует выбирать перепонку стопы.

2. Пунктируйте выбранную вену острой иглой. Для этой цели наиболее полезна плоская игла Хагедорна (размер № 8) с режущим краем. Если вену не удается расширить путем проксимального сдавления, желаемый эффект может дать энергичное трение кусочком сухой ветоши — или можно приложить к вене пробирку с водой при температуре около 40°C. Если эти методы не помогают, можно капнуть каплю или две ксилола на кожу прямо над веной, оставить на несколько секунд, а затем вытереть кусочком сухой ветоши.

3. Один из коротких концов предметного стекла 3 на 1 дюйм приводится в контакт с выступающей каплей крови, так чтобы он набрал небольшую каплю.

4. Затем предметное стекло опускают поперечно на поверхность второго стекла 3 на 1 дюйм, которое лежит на столе около одного конца под углом около 45°, и удерживают в этом положении в течение нескольких секунд, пока капля крови распределяется по всей линии контакта (см. также рис. 69).

5. Проведите первое стекло твердо и равномерно по всей длине нижнего стекла, оставляя тонкий регулярный мазок, который, вероятно, покажет клетки крови толщиной только в один слой.

6. Дайте мазку высохнуть на воздухе.

7. Окрасьте одним из полихромных красителей для крови (см. стр. 97).

8. Исследуйте под микроскопом.

b. Бактериологическое исследование крови направлено исключительно на демонстрацию присутствия в циркулирующей крови организмов, ранее введенных животному. Для этой цели следует взять несколько кубических сантиметров крови цельностеклянным шприцем из доступной вены, соответствующей одной из тех, что предложены в качестве места внутривенной инокуляции, — и при соблюдении аналогичных асептических мер предосторожности.

1. Стерилизуйте цельностеклянный шприц подходящего размера, и когда он остынет, наберите в шприц немного стерильного раствора цитрата натрия и смочите всю внутреннюю поверхность цилиндра; затем удалите весь раствор цитрата, если необходимо взять менее 5 куб. см крови; если требуется более 5 куб. см, оставьте около половины кубического сантиметра жидкости в шприце. Это предотвращает свертывание крови.

Раствор цитрата натрия готовят путем растворения:

Sodium citrate10 gramme. Sodium chloride0.75 grammes. In distilled water100 c.c.

Стерилизуйте кипячением.

2. Подготовьте животное, как для внутривенной инокуляции (см. стр. 363), и введите иглу шприца в просвет выбранной вены.

3. Медленно оттяните поршень шприца. Когда будет собрано достаточное количество крови, дайте ассистенту команду ослабить проксимальное сдавление вены; и извлеките иглу.

4. Снимите иглу с наконечника шприца и перенесите цитратную кровь в небольшую колбу Эрленмейера, содержащую около 250 куб. см питательного бульона.

5. Наклейте этикетку, инкубируйте и исследуйте ежедневно до появления роста или до истечения десяти дней.

c. Серологическое исследование крови направлено на демонстрацию присутствия определенных специфических антител в сыворотках экспериментально инфицированных животных и, в определенных пределах, на оценку их количества.

Основными из этих тел являются:

Antitoxin.

Agglutinin.

Precipitin.

Opsonin.

Immune body or Bacteriolysin.

Ни одно из этих веществ не может быть выделено в чистом виде отдельно от сыворотки крови, следовательно, были разработаны специальные методы, позволяющие их распознать. В каждом случае поведение сыворотки подопытного животного, которую можно назвать «специфической» сывороткой, изучается в сравнении с поведением сыворотки от неинокулированного животного того же вида, которая называется «нормальной» сывороткой. Ввиду незначительных различий в составе, проявляемых сывороткой различных особей одной и той же серии, обычно используют смесь сывороток, полученных от нескольких разных нормальных животных того же вида, что и инокулированное животное, под термином «пулированная сыворотка». Метод сбора крови (например, у кролика) для серологических тестов следующий:

Сбор сыворотки.

Необходимая аппаратура:

Razor.

Liquid soap.

Cotton-wool.

Lysol 2 per cent. solution, in drop bottle.

Ether in drop bottle.

Flat Hagedorn needles.

Blood pipettes (Fig. 16, page 12).

Centrifugal machine.

Centrifuge tubes.

Glass cutting knife.

Bunsen flame.

Writing diamond or grease pencil.

Метод.

1. Сбрейте шерсть на дорсальной поверхности уха по ходу задней ушной вены (см. рис. 192).

2. Стерилизуйте кожу, промыв ее лизолом.

Лизол следует наносить стерильной ватой, а ухо энергично растирать, не только чтобы удалить поверхностные чешуйки эпителия, но и чтобы вызвать гиперемию уха и сделать вену заметной.

3. Удалите лизол эфиром, капнутым из капельницы, и дайте эфиру испариться.

4. Пунктируйте вену стерильной иглой Хагедорна.

5. Возьмите небольшую пипетку для сбора крови (рис. 161) и держите ее под углом к уху, одним концом касаясь выступающей капли крови, а другой конец опустив вниз.

Кровь теперь будет поступать в пипетку сначала за счет капиллярности; позже в игру вступит и сила тяжести, и пипетку можно будет без труда заполнить на две трети.

6. Держите трубку за конец, содержащий кровь, чистым концом, направленным косо вверх — прогрейте этот конец в пламени горелки Бунзена, чтобы вытеснить часть содержащегося воздуха; затем запаяйте чистый кончик в пламени.

Fig. 192.—Collecting blood from rabbit.

7. Положите пипетку на холодную поверхность (например, предметное стекло). Быстрое охлаждение воздуха в чистом конце пипетки создает отрицательное давление, и кровь засасывается обратно в пипетку, оставляя загрязненный конец свободным от крови. Запаяйте этот конец в пламени горелки Бунзена.

8. Отметьте отличительное название образца (например, номер животного) на пипетке с помощью алмазного карандаша или воскового карандаша.

9. Когда запаянные концы остынут и кровь свернется, поместите пипетку в центрифугу чистым концом вниз; уравновесьте и тщательно отцентрифугируйте. При извлечении пипетки из центрифуги красные кровяные тельца будут собраны в плотную массу на одном конце, а над ними появится прозрачная сыворотка.

10. Отметив пипетку для крови выше уровня сыворотки ножом для резки стекла и отломив трубку в этой точке, сыворотка крови становится легкодоступной для целей тестирования.

Если требуется большее количество крови, животное после пункции вены следует перевернуть, ассистент должен держать его за ноги. Кровь объемом в несколько кубических сантиметров теперь будет капать из пунктированной вены, и ее следует собирать в сужающуюся центрифужную пробирку, пробирку перенести в инкубатор при 37° C на два часа, затем поместить в центробежную машину, уравновесить и тщательно отцентрифугировать. Три наиболее важных из упомянутых антител, которые можно продемонстрировать с определенной легкостью, — это агглютинин, опсонин и бактериолизин; и методы тестирования на эти тела будут рассмотрены далее.

АГГЛЮТИНИН.

Агглютинин — это название, данное веществу, присутствующему в сыворотке крови животного, которое успешно сопротивлялось инокуляции определенным микроорганизмом. Это вещество обладает способностью собирать вместе в комки и массы, или агглютинировать, водные суспензии этого конкретного микроба.

Разведение специфической сыворотки:

Необходимая аппаратура:

Sterile graduated capillary pipettes to contain 10 c. mm. (Fig. 17). Sterile graduated capillary pipettes to contain 90 c. mm. (Fig. 17). Small sterile test-tubes 5 × 0.5 cm. Normal saline solution in flask or test-tube. Pipette of specific serum. Glass cutting knife, or three-square file. Glass capsule, nearly full of dry silver sand, or roll of plasticine. Grease pencil.

Метод. —

1. Take three sterile test-tubes and number them 1, 2 and 3.

2. Пипеткой внесите 0,9 куб. см стерильного нормального физиологического раствора в каждую пробирку и поставьте пробирки вертикально в песок в капсуле или в пластилиновый блок.

3. Сделайте царапину ножом для резки стекла на пипетке для крови выше верхнего уровня прозрачной сыворотки, отломите и выбросьте пустую часть трубки.

4. Возьмите 0,1 куб. см сыворотки из трубки пипетки для крови и тщательно смешайте ее с жидкостью в пробирке № 1; и наклейте этикетку s.s. (специфическая сыворотка), 10 процентов.

5. Возьмите 0,1 куб. см раствора из пробирки № 1 с помощью свежей пипетки и смешайте его с содержимым пробирки № 2; и наклейте этикетку s.s., 1 процент.

6. Возьмите 0,1 куб. см раствора из пробирки № 2 с помощью свежей пипетки и смешайте его с содержимым пробирки № 3; и наклейте этикетку s.s., 0,1 процента.

Когда выход сыворотки из собранного или имеющегося образца крови невелик, вышеуказанный метод разведения непрактичен, и разведение следует проводить по методу Райта в капиллярной пипетке с резиновым баллоном.

Разведение сыворотки с помощью пипетки с резиновым баллоном.

Необходимые материалы:

Blood pipette containing sample of specific serum after centrifugalisation.

Capsule of diluting fluid—normal saline solution.

Supply of Pasteur pipettes (Fig. 13a).

India-rubber teats.

Small test-tubes.

A block of plasticine to act as a test-tube stand.

Grease pencil.

Метод:

1. Отметьте три небольшие пробирки как 10 процентов, 1 процент и 0,1 процента соответственно и поставьте их вертикально в пластилиновый блок.

2. Возьмите пипетку Пастера, надпилите капиллярный стебель чуть выше запаянного конца ножом для резки стекла и отломите запаянный конец быстрым движением так, чтобы излом был чистым и под прямым углом к длинной оси капиллярного стебля — фактически «квадратным» срезом. Подготовьте несколько, скажем, дюжину, таким образом.

3. Наденьте резиновый баллон на цилиндр каждой из пипеток.

4. Сделайте отметку восковым карандашом на стебле одной из пипеток на расстоянии около 2 или 3 см от открытого конца.

Fig. 193.—Filling the capillary teat pipette.

5. Сожмите баллон между пальцами (рис. 193) настолько, чтобы вытеснить большую часть содержащегося воздуха.

6. Поддерживая давление на баллон, пропустите стебель пипетки в капсулу с физиологическим раствором, пока открытый конец пипетки не окажется ниже уровня жидкости.

7. Теперь осторожно ослабьте давление на баллон и дайте жидкости войти в пипетку и подняться по стеблю до уровня отметки восковым карандашом. Как только эта точка будет достигнута, зафиксируйте движение столбика жидкости, поддерживая давление на баллон, не ослабляя и не увеличивая его.

8. Извлеките кончик пипетки из жидкости и снова очень слегка ослабьте давление на баллон. Столбик физиологического раствора поднимется выше по стеблю, и теперь в пипетку войдет столбик воздуха, который послужит индексом для отделения первого объема жидкости, набранного в стебель, от следующего за ним.

9. Снова введите конец пипетки в жидкость и наберите второй объем физиологического раствора до уровня отметки восковым карандашом, и следуйте за этим вторым воздушным индексом.

10. Таким же образом наберите еще семь равных объемов физиологического раствора и следующие за ними пузырьки воздуха. Теперь в пипетке девять равных объемов нормального физиологического раствора.

11. Теперь пропустите кончик пипетки в пробирку с кровью и окуните открытый конец ниже поверхности сыворотки. Действуя как прежде, аспирируйте объем сыворотки в капиллярный стебель до уровня отметки карандашом.

12. Вылейте содержимое пипетки в небольшую пробирку, отмеченную как 10 процентов, сжимая резиновый баллон между большим и указательным пальцами.

13. Очень тщательно смешайте один объем сыворотки с девятью объемами физиологического раствора, многократно набирая всю жидкость в пипетку и снова выливая ее в пробирку.

14. Now take a clean pipette and proceed precisely as before, 4 to 10.

15. Набрав девять равных объемов физиологического раствора во вторую пипетку, теперь наберите один аналогичный объем жидкости из «10-процентной пробирки».

16. Вылейте содержимое этой пипетки во вторую пробирку, отмеченную как 1 процент, и тщательно перемешайте, как прежде.

17. Аналогичным образом приготовьте 0,1-процентный раствор и перенесите в третью пробирку.

18. Дальнейшие разведения в кратных десяти можно приготовить таким же образом, и, варьируя количество объемов разбавляющей жидкости или сыворотки, можно сделать любое необходимое разведение (см. Приложение, Таблицы разведений).

Примечание. — Разбавляющую физиологическую жидкость всегда следует набирать в пипетку первой, иначе, если сыворотка содержит очень большое количество агглютинина, следы этой сыворотки, добавленные к физиологическому раствору, могут быть достаточными, чтобы полностью исказить последующие наблюдения — в то время как если из одного и того же физиологического раствора разбавляется более одного образца сыворотки, в эксперименты могут быть внесены серьезные ошибки.

Микроскопическая реакция:

Необходимая аппаратура:

Пять предметных стекол для висячей капли (или, предпочтительно, два стекла), с двумя ячейками, установленными бок о бок на каждом (рис. 62, a), и одно стекло только с одной ячейкой.

Вазелин.

Покровные стекла.

Платиновая петля.

Восковой карандаш.

Восемнадцати-двадцатичетырехчасовая бульонная культура тестируемого организма (например, Bacillus typhi abdominalis).

Конец пипетки с остатком специфической сыворотки, отмеченный s.s.

Пробирки, содержащие три раствора специфической сыворотки, 10, 1 и 0,1 процента соответственно.

Конец пипетки с пулированной нормальной сывороткой, отмеченный p.s.

Метод. —

1. Приготовьте пять препаратов висячей капли, таким образом:

(a) Одна петля бульонной культуры + одна петля пулированной сыворотки; наклейте этикетку «Контроль».

(b) Одна петля культуры + одна петля неразведенной специфической сыворотки; наклейте этикетку 50 процентов.

Установите эти два покровных стекла на двухъячеечное предметное стекло.

(c) Одна петля бульонной культуры + одна петля 10-процентной сыворотки; наклейте этикетку 5 процентов.

Установите это на одноячеечное предметное стекло.

(d) Одна петля бульонной культуры + одна петля 1-процентной сыворотки; наклейте этикетку 0,5 процента.

(e) Одна петля бульонной культуры + одна петля 0,1-процентной сыворотки; наклейте этикетку 0,05 процента.

Установите эти два покровных стекла на двухъячеечное предметное стекло.

2. Запишите время: Исследуйте контроль, чтобы убедиться, что бациллы подвижны и равномерно распределены по полю — не собраны в массы.

3. Затем исследуйте препарат с 50-процентной сывороткой.

Если агглютинин присутствует и тест дает положительную реакцию, бациллы будут собраны в крупные комки.

Если тест дает отрицательную реакцию, бациллы могут быть собраны в крупные комки из-за вязкости концентрированной сыворотки.

4. Исследуйте 5-процентный препарат микроскопически.

Если бациллы агрегированы в комки, положительная реакция.

Если бациллы не агрегированы в комки, наблюдайте до тридцати минут с момента приготовления, прежде чем записывать отрицательную реакцию.

5. Исследуйте препараты 0,5 и 0,05 процента.

Они могут показывать или не показывать агглютинацию, когда результат исследования 5-процентного препарата положителен, в зависимости от активности специфической сыворотки; и путем исследования серии разведений можно получить количественное сравнение валентности специфических сывороток из разных источников или сыворотки от одного и того же животного в разные периоды в течение курса активной иммунизации.

Примечание. — Градуированные пипетки, поставляемые с гематоцитометром Тома (предназначенные для сбора образца крови, необходимого для подсчета лейкоцитов), дающие разведение 1 к 10 — т. е. 10 процентов — могут быть заменены на вышеупомянутые градуированные капиллярные пипетки, если сосуд, в котором была отделена сыворотка, имеет достаточно большой диаметр, чтобы позволить их использование.

Макроскопическая реакция:

Стерильные градуированные капиллярные пипетки вместимостью 90 куб. мм.

Восемнадцати-двадцатичетырехчасовая бульонная культура тестируемого организма.

Три пробирки, содержащие 10-, 1- и 0,1-процентные растворы специфической сыворотки (остается около 90 куб. мм в каждой).

Пробирка, содержащая 50-процентный раствор пулированной сыворотки.

Пипетки для седиментации (см. стр. 17) или пипетки с резиновым баллоном.

Метод.

1. Внесите пипеткой 90 куб. мм бульонной культуры в каждую из пробирок, содержащих разведенную сыворотку; и такое же количество в пробирку, содержащую пулированную сыворотку.

2. Заполните седиментационную трубку (путем аспирации) или пипетку с баллоном содержимым каждой пробирки. Запаяйте нижние концы седиментационных трубок в пламени горелки Бунзена.

3. Наклейте на каждую трубку этикетку с указанием разведения сыворотки, которое она содержит — а именно: 5, 0,5 и 0,05 процента.

4. Поместите пипетки в вертикальном положении в стакан в инкубатор при 37°C на один или два часа.

5. Наблюдайте зернистый осадок, который выпадает при положительной реакции, и равномерную мутность при отрицательной реакции по сравнению с внешним видом в контрольной пулированной сыворотке.

ОПСОНИН.

Опсонин — это термин, примененный Райтом к веществу, присутствующему в сыворотке инокулированного животного, которое способно воздействовать на бактерии первоначально введенного вида или сенсибилизировать их, чтобы сделать их легкой добычей для фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов. В методе демонстрации опсонина, который будет описан далее, проводится сравнение между опсонической «силой» пулированной сыворотки и специфической сыворотки.

Аппаратура:

Небольшая центрифуга и пробирки для нее (изготовленные из цилиндров разбитых капиллярных пипеток путем запаивания конических концов в пламени горелки Бунзена).

Капиллярные пипетки Пастера.

Резиновые баллоны.

Восковой карандаш.

Горелка Бунзена с малым пламенем.

Электрические сигнальные часы (см. стр. 39), секундомер или часы.

Прямоугольный стеклянный ящик или лоток для хранения пипеток.

Инкубатор, отрегулированный на 37°C.

Предметные стекла 3 × 1 дюйм.

Кусочек легкой резиновой трубки.

Прямоугольный блок пластилина.

Колба с нормальным физиологическим раствором.

Колба с цитратом натрия (1,5 процента) в нормальном физиологическом растворе.

Необходимые материалы и их подготовка:

Небольшая пробирка с «отмытыми клетками» (красные кровяные диски и лейкоциты); человеческие клетки используются при оценке опсонизирующей силы сыворотки подопытных животных.

Небольшая пробирка с эмульсией бактерий того вида, который вызвал инфекцию у подопытного животного.

Пипетка для крови, содержащая специфическую сыворотку.

Пипетка для крови, содержащая «пулированную» сыворотку.

Отмытые клетки. —

1. Возьмите небольшую центрифужную пробирку и наполовину заполните ее раствором цитрата натрия. Отметьте восковым карандашом верхний предел жидкости.

2. Очистите кожу дистальной фаланги второго пальца левой руки над корнем ногтя ветошью и эфиром. Туго обмотайте резиновую трубку вокруг второй фаланги; пунктируйте стерильной иглой Хагедорна через очищенный участок кожи.

3. Наберите достаточное количество выступающей крови (больше или меньше в зависимости от количества проводимых тестов) пипеткой с баллоном, перенесите ее в пробирку с раствором цитрата и тщательно перемешайте. Сделайте вторую отметку на пробирке на верхнем уровне смешанного раствора цитрата и крови.

4. Поместите пробирку в центрифугу, точно уравновесьте и центрифугируйте, пока клетки крови не будут сброшены в компактную массу, занимающую примерно тот же объем, который заключен между двумя отметками карандашом.

Столбик жидкости в пробирке теперь показывает прозрачную надосадочную жидкость (раствор цитрата и плазма крови), отделенную от четко очерченной верхней поверхности красного осадка корпускул узким сероватым слоем лейкоцитов.

5. Удалите надосадочный столбик раствора цитрата с помощью пипетки с баллоном, наполните пробирку нормальным физиологическим раствором до верхней отметки карандашом и распределите клетки крови по всему физиологическому раствору с помощью пипетки с баллоном. Центрифугируйте, как прежде.

6. Снова удалите надосадочную жидкость, залейте свежую порцию физиологического раствора и центрифугируйте еще раз.

7. Удалите надосадочную физиологическую жидкость как можно ближе к уровню лейкоцитов, насколько это можно сделать безопасно, не удаляя при этом сами лейкоциты.

8. Затем равномерно распределите лейкоциты по всей массе эритроцитов, вращая пробирку между ладонями — точно так же, как это делается с пробиркой с разжиженной средой перед заливкой чашки.

9. Установите пробирку вертикально в пластилиновый блок ближе к одному из его краев.

Бактериальная эмульсия.

1. Возьмите 18–24-часовую культуру необходимой бактерии (например, Diplococcus pneumoniæ), выращенную на скошенном кровяном агаре при 37° C. Налейте на поверхность среды около 5 см³ нормального физиологического раствора.

2. Платиновой петлей эмульгируйте рост с поверхности среды в физиологическом растворе как можно более равномерно.

3. Дайте пробирке постоять несколько минут, чтобы крупные массы роста могли осесть; перенесите верхнюю часть физиологической суспензии в центрифужную пробирку и тщательно отцентрифугируйте.

4. Микроскопически исследуйте каплю надосадочной опалесцирующей эмульсии, чтобы убедиться в отсутствии комков и масс. Если результат неудовлетворительный, приготовьте другую эмульсию, на этот раз соскабливая поверхностный рост платиновым шпателем, перенося его в агатовой ступке и растирая с последовательными небольшими количествами нормального физиологического раствора. Если результат удовлетворительный, вставьте пробирку в пластилиновый блок рядом с той, которая содержит отмытые клетки.

Специфическая сыворотка.

Смешанная сыворотка.

Эти сыворотки собирают и обрабатывают, как описано ранее (см. стр. 379), а части кровяных пипеток, содержащие их, размещают в оставшемся пространстве пластилинового блока.

Fig. 194.—Plasticine block with materials arranged for opsonin estimations.

Теперь пластилиновый блок имеет вид, показанный на рис. 194.

Метод определения опсонического индекса.

1. Возьмите капиллярную пипетку с резиновым баллоном, обрежьте дистальный конец под прямым углом и сделайте карандашную отметку примерно в 2 см от конца.

2. Наберите в пипетку один объем отмытых клеток, воздушный индекс, один объем бактериальной эмульсии, воздушный индекс и один объем специфической сыворотки (см. рис. 195).

Fig. 195. Opsonin pipette.

3. Тщательно перемешайте на предметном стекле 3 на 1 дюйм, сжимая баллон и выталкивая содержимое пипетки на поверхность стекла, затем ослабляя давление и снова втягивая жидкость в пипетку. Эти два процесса следует повторить несколько раз; наконец, наберите смесь в виде непрерывного столбика в центральную часть капиллярного стебля.

4. Запаяйте кончик пипетки в пламени горелки Бунзена и снимите баллон.

5. Отметьте пипетку (восковым карандашом) отличительным номером сыворотки и поместите ее в стеклянную коробку или лоток.

6. Возьмите другую аналогично подготовленную пипетку и наберите в нее равные объемы отмытых клеток, бактериальной эмульсии и смешанной сыворотки. Обработайте точно так же, как в пунктах 3 и 4, пометьте ее как «контроль» или «N.S.» (нормальная сыворотка) и поместите в коробку рядом с препаратом специфической сыворотки.

7. Поместите коробку с пипетками в инкубатор и установите сигнальные часы на 15 минут (или запустите секундомер).

8. По истечении времени инкубации извлеките пипетки из инкубатора.

9. Отрежьте запаянный конец препарата специфической сыворотки. Тщательно перемешайте его содержимое, как в пункте 3, а затем разделите смесь между двумя предметными стеклами 3 на 1 дюйм и аккуратно сделайте мазок крови (см. стр. 376) на каждом из них таким образом, чтобы только половина поверхности каждого стекла была покрыта кровью — свободный край мазка крови должен приближаться к продольной оси стекла.

Дайте мазкам высохнуть и подпишите стекла алмазным карандашом.

10. Аналогичным образом обработайте содержимое контрольной пипетки.

11. Выберите лучший мазок из каждой пары для фиксации и окрашивания.

12. Фиксация и окрашивание должны проводиться в строго сопоставимых условиях, и для этой цели стекла лучше всего обрабатывать, помещая их в стеклянную подставку для окрашивания, которую можно поочередно опускать в каждый из серии стеклянных кювет, содержащих различные реагенты (рис. 196). Поместите подставку в первую кювету, содержащую спиртовой раствор красителя Лейшмана, на две минуты для фиксации.

Перенесите во вторую кювету, содержащую разбавленный краситель, на десять минут.

Перенесите в третью кювету, содержащую дистиллированную воду, и, держа кювету над раковиной, пустите струю дистиллированной воды до завершения промывки. Извлеките стекла из подставки и высушите.

Краситель Лейшмана лучше всего подходит для рутинной работы со всеми бактериями, кроме B. tuberculosis. Мазки, содержащие туберкулезные палочки, конечно, должны быть окрашены по методу Циль-Нильсена.

Fig. 196. Glass staining trough for blood films.

13. Исследуйте стекло со специфической сывороткой микроскопически с масляной иммерсией 1/12 дюйма. Найдите край мазка крови — вдоль него будет собрана основная масса лейкоцитов. Начиная с одного конца мазка, медленно перемещайте стекло по предметному столику микроскопа и по мере появления каждого лейкоцита подсчитывайте и записывайте количество поглощенных бактерий. Сумма содержимого первых 50 встреченных полиморфноядерных лейкоцитов записывается. (Среднее число бацилл, поглощенных одним лейкоцитом = «фагоцитарный индекс».)

14. Точно таким же образом подсчитайте бактерии, присутствующие в первых 50 клетках контрольного препарата. Это число записывается как знаменатель простой дроби, числителем которой является число, записанное для специфической сыворотки. Эта дробь, выраженная в процентах от единицы = опсонический индекс.

ИММУННОЕ ТЕЛО.

Иммунное тело, или амбоцептор, — это название, данное веществу, присутствующему в сыворотке инфицированного животного, которое успешно противостояло инокуляции каким-либо конкретным микроорганизмом и которое обладает способностью связывать комплемент, обычно присутствующий в сыворотке, с бактериями вида, использованного в качестве антигена, таким образом, что микроорганизмы становятся безвредными и в конечном итоге уничтожаются. Присутствие иммунного тела в сыворотке может быть продемонстрировано in vitro с помощью реакции, разработанной Борде и Жангу, известной как реакция связывания комплемента, причем существование или отсутствие феномена связывания комплемента становится очевидным макроскопически по отсутствию или наличию гемолиза при последующем добавлении «сенсибилизированных» эритроцитов (например, смеси эритроцитарного раствора и соответствующего гемолизина — двух из трех основных компонентов гемолитической системы, см. стр. 326).

Необходимая аппаратура:

Стерильные пипетки 1 см³ (градуированные в десятых долях).

Пробирки 16 × 2 см.

Пробирки 9 × 1 см.

Штативы для пробирок каждого размера.

Необходимые реагенты:

Нормальный физиологический раствор.

Эритроцитарный раствор (эритроциты человека, стр. 329) = E.

Гемолитическая сыворотка (для клеток человека) = H.S.

Комплемент (свежая сыворотка морской свинки) = C.

Специфическая сыворотка от инокулированного животного, инактивированная = S.S.

Контрольная смешанная сыворотка от нормальных животных того же вида, инактивированная = P.S.

Антиген (культура на твердой среде организма (например, B. typhosus), который уже служил антигеном при инокуляции экспериментального животного) = A.

Для подготовки антигена к использованию эмульгируйте весь бактериальный рост в 5 см³ нормального физиологического раствора.

Встряхните эмульсию в пробирке со стерилизованными стеклянными бусинами для обеспечения гомогенности эмульсии и стерилизуйте нагреванием до 60° C на водяной бане в течение одного часа.

Метод.

1. Возьмите пять маленьких пробирок и пронумеруйте их от 1 до 5 восковым карандашом.

2. Into tubes Nos. 1, 3, 4 and 5 pipette 0.1 c.c. of complement.

3. В пробирки № 1 и № 2 отпипетируйте 0,2 см³ исследуемой сыворотки.

4. В пробирку № 4 отпипетируйте 0,2 см³ контрольной сыворотки.

5. Into tubes Nos. 1, 2, 3 and 4 pipette 1 c.c. of the bacterial emulsion which forms the antigen.

6. Поместите весь набор пробирок в инкубатор при 37° C на один час.

7. Извлеките пробирки из инкубатора и отпипетируйте 1 см³ эритроцитарного раствора и 4 минимальные гемолитические дозы соответствующего гемолизина в каждую пробирку.

8. Тщательно перемешайте и верните пробирки в инкубатор при 37° C еще на один час.

9. По истечении этого времени перенесите пробирки в ледяной шкаф и дайте им постоять три часа.

10. Исследуйте пробирки.

Tubes 3, 4 and 5 should show complete hæmolysis; tube 2 should give no evidence whatever of hæmolysis.

Эти пробирки являются контрольными для первой пробирки, содержащей исследуемую сыворотку.

В пробирке № 1 отсутствие гемолиза указывает на наличие в сыворотке инокулированного животного специфического антитела к микроорганизму, использованному при инокуляциях; поскольку это показывает, что комплемент был связан иммунным телом с бактериальным антигеном и ни один из них не остался свободным для вступления в гемолитическую систему; с другой стороны, наличие гемолиза показало бы, что значительное количество антител еще не образовалось в ответ на инокуляции. Другими словами, инфекция отсутствует, так как комплемент остался несвязанным во время добавления эритроцитарного раствора и гемолитической сыворотки и был готов соединиться с этими реагентами для завершения гемолитической системы.

Метод может быть представлен схематически, как показано ниже, с использованием уже указанных символов.

Примечание. — Иногда удобнее сенсибилизировать эритроциты непосредственно перед их использованием. Это делается через сорок пять минут после начала эксперимента (стр. 394, шаг 6), то есть до завершения первого периода инкубации, следующим образом:

1. Отмерьте в стерильную пробирку (или колбу) пять см³ эритроцитарного раствора.

2. Отмерьте двадцать минимальных гемолитических доз гемолизина, добавьте к эритроцитарному раствору в пробирке.

3. Дайте эритроцитам и гемолизину оставаться в контакте в течение пятнадцати минут при комнатной температуре. Эритроциты затем сенсибилизированы и готовы к использованию.

4. Когда пробирки извлекаются из инкубатора в конце первого часа (т. е. шаг 7), добавьте 1 см³ сенсибилизированных эритроцитов в каждую пробирку с помощью градуированной пипетки.

5. Тщательно перемешайте, верните пробирки в инкубатор при 37° C и завершите эксперимент, как описано ранее (шаги 8 и далее).

XIX. ПОСМЕРТНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ.

Посмертное исследование следует проводить как можно скорее после смерти животного, так как необходимо помнить, что даже в холодную погоду ткани быстро заселяются многочисленными бактериями, происходящими из пищеварительного тракта или полостей тела, а также из внешних источников.

Следующие пункты относятся к полному и исчерпывающему вскрытию, и при рутинной работе исследование редко требует проведения в полном объеме.

Примечание. — На протяжении всего вскрытия необходимо широко использовать прижигающие инструменты, и следует помнить, что один инструмент должен использоваться только для захвата или разрезания одной структуры. После этого он должен считаться загрязненным, и для следующего шага следует взять свежий инструмент.

Необходимая аппаратура:

Водяной стерилизатор.

{ Scalpels. Surgical instruments:{ Scissors. { Forceps. { Bone forceps.

Копьевидный платиновый шпатель (рис. 199).

Прижигающие инструменты (рис. 198).

Пробирки со средами — бульон и скошенный агар.

Поверхностные чашки в чашках Петри (с агаром или одним из его производных).

Платиновая петля.

Алюминиевый «распределитель».

Восковой карандаш.

Стерильные капиллярные пипетки (рис. 13, а).

Стерильные стеклянные капсулы, большие и маленькие.

Покровные стекла или предметные стекла.

Флаконы с фиксирующей жидкостью (см. стр. 114) для кусочков ткани, предназначенных для изготовления срезов.

1. Поместите различные инструменты, пинцеты, ножницы, скальпели и т. д., необходимые для вскрытия, внутрь стерилизатора и стерилизуйте кипячением в течение десяти минут; затем откройте стерилизатор, поднимите лоток изнутри и положите его поперек краев.

2. Нагрейте прижигающие инструменты докрасна на отдельной газовой плите.

Fig. 197.—Apparatus for post-mortem examination, animal on board.

3. Обильно смочите мех (или перья) 2-процентным раствором лизола. Это служит двойной цели: предотвращает разлетание волос и их попадание в полости тела во время вскрытия, а также делает безвредными любых паразитов, которые могут присутствовать на животном.

Fig. 198.—Searing iron.

4. Внимательно осмотрите труп. Помните, что лабораторные животные не всегда выносливы; смерть может быть вызвана воздействием тепла или холода, голоданием, чрезмерным или неправильным кормлением или нападением крыс, а не бактериальной инфекцией.

5. Закрепите тело животного брюшной поверхностью вверх (если нет особой причины оставлять спину открытой) на доске с помощью медных гвоздей, вбитых через конечности.

6. Стерильными пинцетом и скальпелем сделайте разрез кожи по средней линии от верхушки грудины до лобка. Сделайте другие разрезы под прямым углом к первому до подмышек и паха и откиньте кожу двумя боковыми лоскутами. (Положите теперь инфицированные инструменты на доску рядом с телом или поддержите их на фарфоровой подставке для ножей.)

Место инокуляции.

7. Осмотрите место инокуляции. Если виден какой-либо местный очаг поражения, прижгите его открытую поверхность и платиновой петлей удалите материал из более глубоких частей для приготовления посевов в пробирках и на поверхностных чашках, а также мазков.

Соберите образцы гноя или другого экссудата в капиллярные пипетки для последующего исследования.

8. Осмотрите соседние лимфатические узлы и попытайтесь проследить путь вируса.

9. Прижгите всю открытую поверхность грудной клетки прижигающими инструментами.

Плевральная полость.

10. Разрежьте ребра с обеих сторон грудины и удалите прямоугольную часть передней стенки грудной клетки стерильными ножницами и свежей парой пинцетов, обнажив сердце. Положите инфицированные инструменты рядом с первым набором.

11. Наблюдайте состояние передних средостенных узлов, тимуса и легких. Соберите количество плеврального выпота, если таковой имеется, в пипетку для дальнейшего исследования позже.

12. Поднимите перикардиальный мешок свежей парой пинцетов и прожгите эту структуру прижигающим инструментом.

Соберите образец перикардиальной жидкости в пипетку для микроскопического и культурального исследования.

13. Захватите верхушку сердца пинцетом и прижгите поверхность правого желудочка.

14. Погрузите открытый кончик капиллярной пипетки через прижженную область в желудочек и наполните кровью.

Сделайте посевы и мазки сердечной крови.

15. Соберите дополнительный образец крови или сыворотки для последующего исследования на наличие антител.

Брюшная полость.

16. Прижгите широкую полосу по средней линии брюшной стенки; вскройте брюшную полость разрезом в центре прижженной линии. Наблюдайте состояние сальника, брыжейки, внутренних органов и брюшинной поверхности кишечника.

17. Соберите образец перитонеальной жидкости (или гноя, если таковой имеется) в капиллярную пипетку. Сделайте посевы в пробирки и на поверхностные чашки, а также мазки из этого места.

18. Соберите образец мочи из переполненного мочевого пузыря в большую пипетку (способом, указанным для сердечной крови) для дальнейшего исследования путем посевов, микроскопических препаратов и химического анализа.

19. Соберите образец желчи из желчного пузыря аналогичным образом.

20. Извлеките селезенку и поместите ее в стерильную капсулу. Позже прижгите поверхность этого органа; погрузите копьевидный шпатель в центр прижженной области, поверните его между пальцами и извлеките из органа. Достаточное количество материала будет извлечено в ушке на его конце для приготовления посевов. Повторение процесса даст материал для мазков.

21. Захватите один конец селезенки стерильным пинцетом. Прижгите узкую полоску ткани вокруг всего органа и разрежьте селезенку в этом месте ножницами. Удерживая кусочек селезенки пинцетом, приложите срезанную поверхность к поверхностной чашке в нескольких разных местах.

22. Аналогичным образом исследуйте другие органы — печень, легкие, почки, лимфатические узлы (брыжеечные, печеночные, поясничные и т. д.) и т. д. Подготовьте посевы и мазки.

23. Препарируйте длинную кость из одной верхней и одной нижней конечности и одно из самых больших ребер. В каждом случае приготовьте культуры из костного мозга. Отложите эти кости для последующего приготовления мазков костного мозга.

24. Мазки костного мозга лучше всего делать по методу Прайс-Джонса. Захватите кость плоскогубцами и выдавите немного костного мозга; примите его на платиновую петлю и перенесите в часовое стекло с диссоциирующей жидкостью и эмульгируйте. Диссоциирующая жидкость представляет собой нейтральный 10-процентный раствор глицерина, приготовленный следующим образом:

Отмерьте 10 см³ лучшего глицерина Прайса и 90 см³ стерильной дистиллированной воды, не содержащей аммиака. Смешайте. Титруйте раствором едкого натра n/10, используя фенолфталеин в качестве индикатора. Начальная реакция обычно составляет + 0,1 до + 0,5; добавьте рассчитанное количество раствора едкого натра n/10 для нейтрализации.

25. Поместите петлю свежей диссоциирующей жидкости на предметное стекло 3 × 1 дюйм; добавьте аналогичную петлю эмульсии костного мозга и очень осторожно распределите по поверхности стекла.

26. Дайте мазку высохнуть на воздухе (защищенном от пыли) без нагревания.

27. Окрасьте полихромным красителем Дженнера (стр. 97) в течение двух с половиной минут.

28. Промойте дистиллированной водой, не содержащей аммиака, тщательно высушите и заключите в ксилоловый бальзам.

Черепная и спинномозговая полости.

29. В некоторых случаях может потребоваться (например, экспериментальная инокуляция бешенства) исследовать черепную полость или извлечь спинной мозг. Верните внутренние органы в брюшную полость; стяните лоскуты кожи вместе и закрепите стальными зажимами Мишеля. Вытащите медные гвозди, крепящие конечности к доске, переверните животное и снова прибейте конечности — теперь тело лежит спиной вверх.

30. Сделайте продольный разрез по средней линии от морды до корня хвоста и четыре поперечных разреза — один, соединяющий корни двух ушей, один поперек тела на уровне остистых отростков лопаток, другой на уровне реберного края и последний поперек верхнего уровня таза. Откиньте эти лоскуты кожи.

31. Пинцетом и скальпелем препарируйте мышцы, лежащие в борозде с обеих сторон остистых отростков.

32. Перережьте основания поперечных отростков костными кусачками. Срежьте свод черепа, перережьте корни нервов и извлеките головной и спинной мозг, поместите в большую стеклянную чашку для исследования. Подготовьте посевы из спинномозговой жидкости. Извлечение головного и спинного мозга — утомительный процесс, и во время препарирования трудно избежать повреждения этих структур.

Операция, однако, выполняется очень быстро и аккуратно с помощью хирургического двигателя (см. стр. 361). К наконечнику крепится маленькая циркулярная пила. Кости черепа прорезаются, и весь свод удаляется, обнажая всю верхнюю часть мозга. Аналогичным образом все остистые отростки могут быть удалены в один ряд, проведя пилой сначала по одной стороне позвоночника, а затем по другой. Таким образом, получается достаточно места для удаления нервных тканей с минимумом усилий.

33. Завершив подготовку культур, не спеша извлеките небольшие части различных органов и поместите каждую в отдельные флаконы с фиксирующей жидкостью для будущего изготовления срезов. Наклейте на каждый флакон этикетку с указанием всех необходимых деталей о его содержимом.

34. При необходимости извлеките части органов для сохранения и демонстрации в качестве музейных экспонатов (см. стр. 404).

35. Соберите все инфицированные инструменты, верните их в стерилизатор и продезинфицируйте кипячением в течение десяти минут.

Fig. 199.—Spear-headed platinum spatula (actual size.)

36. Насыпьте сухие опилки в открытые полости тела, чтобы впитать кровь и жидкость. Накройте тело промокательной или фильтровальной бумагой, смоченной 2-процентным раствором лизола. Поместите в оцинкованное железное ведро с крышкой, готовое к транспортировке в крематорий.

37. Кремируйте труп вместе с доской, на которой он закреплен.

38. Окрасьте мазки подходящими методами и исследуйте микроскопически.

39. Инкубируйте посевы и внимательно осматривайте их изо дня в день.

40. Сделайте полные записи о состоянии различных полостей тела и внутренних органов сразу после завершения вскрытия; и добавьте результат микроскопического и культурального исследования, когда он будет доступен.

Как часть картотечной системы, используемой в лаборатории автора, о которой уже упоминалось (см. стр. 335), существует специальная желтая карточка для записей о вскрытии. На лицевой стороне карточки напечатаны заголовки для различных данных — некоторые из которых иногда непреднамеренно опускаются, — а на обороте есть схематический рисунок, который можно использовать для указания положения основных поражений на трупе любого из лабораторных животных.

Fig. 200.—Front of post-mortem card.

41. Наконец, результаты действия выделенного организма или организмов могут быть соотнесены с симптомами, наблюдавшимися при жизни, и наблюдения суммированы под следующими заголовками:

Тканевые изменения:

1. Local—i. e., produced in the neighbourhood of the bacteria. Position: (a) At primary lesion. (b) At secondary foci. Character: (a) Vascular changes and tissue reactions.}Acute or chronic. (b) Degeneration and necrosis.} 2. General (i. e., produced at a distance from the bacteria, by absorption of toxins): (a) In special tissues—e. g., nerve cells and fibres, secreting cells, vessel walls, etc. (b) General effects of malnutrition, etc. Symptoms: (a) Associated with known tissue changes. (b) Without known tissue changes.

Fig. 201.—Back of post-mortem card.

Постоянные препараты — музейные экспонаты.

I. Ткани. — Внешний вид пораженных тканей можно сохранить следующим методом:

1. Извлеките ткань или орган из трупа как можно скорее после смерти, соблюдая большую осторожность, чтобы избежать деформации или повреждения.

2. Поместите его в широкогорлую банку с пробкой, достаточно большую, чтобы удобно его разместить, на подкладку из ваты, и расположите в том положении, которое он должен занимать (но если предполагается показать срез ткани или органа, пока не разрезайте его).

3. Залейте фиксирующим раствором Кайзерлинга и закройте банку пробкой; оставьте ткани в этом растворе на срок от сорока восьми часов до семи дней (в зависимости от размера) для фиксации. Сделайте любые необходимые срезы.

Модифицированный раствор Кайзерлинга готовится следующим образом:

Отвесьте

Potassium acetate30 grammes. Potassium nitrate15 grammes.

и растворите в

Distilled water1000 c.c.

затем добавьте

Formalin150 c.c.

Отфильтруйте.

Этот фиксирующий раствор можно использовать многократно, пока он остается прозрачным. Даже когда он стал мутным, если простой фильтрации достаточно, чтобы сделать его прозрачным, фильтрат можно использовать снова.

4. Перенесите ткань в ванну с метилированным спиртом (95 процентов) на срок от тридцати минут до одного часа.

5. Перенесите в свежую ванну со спиртом и внимательно наблюдайте. Когда естественные цвета проявятся в своих первоначальных оттенках, среднее время от трех до шести часов, извлеките ткани из спиртовой ванны, высушите спирт с разрезанных поверхностей, промокнув мягкой тканью, затем перенесите в монтирующий раствор.

Монтирующий раствор Жора (модифицированный) состоит из

Glycerine500 c.c. Distilled water750 c.c. Formalin2 c.c.

Столь же хорош, но гораздо дешевле монтирующий раствор Фроста:

Potassium acetate160 grammes. Sodium fluoride80 grammes. Chloral hydrate80 grammes. Cane sugar (Tate's cubes)3,500 grammes. Saturated thymol water8,000 c.c.

6. Через двадцать четыре часа в этом растворе, или как только ткань осядет, перенесите в музейную банку, наполните свежим монтирующим раствором и запечатайте.

6a. Или перенесите в музейную банку и наполните разжиженным желатином, в который добавлено 1 процент формалина. Накройте банку и дайте желатину застыть. Когда он станет твердым, запечатайте крышку банки на месте.

7. Чтобы запечатать музейный препарат, сначала нагрейте стеклянную пластину, которая служит крышкой. Это удобнее всего сделать, поместив очищенную и отполированную покровную пластину на кусок асбестового картона над пламенем горелки Бунзена, убавленным до минимума.

8. Нанесите ровный слой горячего цемента на фланец банки. Цемент готовится следующим образом:

Отвесьте и смешайте в железном ковше

Gutta percha (pure)4 parts. Asphaltum5 parts.

и расплавьте вместе над пламенем горелки Бунзена, помешивая железным стержнем до полного растворения.

9. Переверните стеклянную пластину над банкой и плотно прижмите к цементу. Положите сверху кусок асбестового картона и на него установите подходящий груз, пока цемент не остынет и полностью не затвердеет.

10. Обрежьте выступающие куски цемента старым ножом, загладьте шов между банкой и крышкой горячим гладким куском металла (например, прижигающим инструментом).

11. Нанесите узкую полоску японского черного лака для отделки вокруг шва, перекрывая крышку.

II. Культуры бактерий в пробирках. — При демонстрации типичного внешнего вида их можно сохранить, если не постоянно, то по крайней мере на многие годы, в качестве музейных экспонатов следующим методом:

1. Возьмите большую стеклянную банку высотой 25 см и диаметром 18 см с прочным основанием и широким фланцем, тщательно отшлифованным вокруг горлышка. Банка должна быть снабжена диском из листового стекла, отшлифованным с одной стороны, чтобы служить крышкой.

2. Нанесите толстый слой смоляной мази (Британская фармакопея) на фланец вокруг горлышка банки.

3. Покройте дно банки слоем ваты и пропитайте ее формалином.

4. Удалите ватную пробку из пробирок с культурами и поместите их горлышком вверх внутрь банки. (Если в какой-либо из пробирок с культурами присутствует конденсат, его следует удалить с помощью капиллярной пипетки перед помещением пробирок в формалиновую камеру.)

5. Установите стеклянный диск отшлифованной стороной вниз на горлышко банки и закрепите его, плотно прижав к мази вращательным движением.

6. Извлеките пробирки из формалиновой камеры по прошествии недели и высушите каждую снаружи.

Fig. 202.—Bulloch's tubes.

7. Запечатайте открытое горлышко каждой пробирки в пламени паяльной трубки и наклейте этикетку.

Если культуры предназначены для музейных целей с момента их первого посева, удобнее использовать пробирки Буллока. Они немного длиннее обычных пробирок и снабжены сужением примерно на 2 см ниже горлышка (рис. 202) — особенность, которая делает запечатывание в пламени паяльной трубки легким делом.

XX. ИЗУЧЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ.

Студент, добросовестно отработавший методы и т. д., рассмотренные ранее, находится в положении, позволяющем делать точные наблюдения и писать точные описания результатов таких наблюдений. Поэтому ему теперь доверяют чистые культуры различных патогенных бактерий, чтобы он мог изучить жизненный цикл каждой из них и записать результаты своих собственных наблюдений — которые впоследствии будут исправлены или дополнены демонстратором. Таким образом, он становится независимым от описаний в учебниках, утверждения в которых он в противном случае слишком склонен принимать на веру, не пытаясь лично проверить их точность.

В ходе этой работы внимание также должно быть направлено, по мере возникновения необходимости, на другие бактерии, патогенные или сапрофитные, которые связаны с конкретными организмами, находящимися под наблюдением, или настолько напоминают их, что становятся возможными источниками ошибок, путем их проработки параллельными методами — другими словами, различные бактерии следует изучать «группами». На следующих страницах принята группировка, используемая в элементарных классах автора для студентов-медиков и стоматологов, а также для кандидатов на службу общественного здравоохранения, поскольку довольно длительный опыт полностью подтвердил ценность и полезность этого расположения, и с его помощью получается фонд информации относительно сходств и различий, морфологических и культуральных, большого числа бактерий. Тот факт, что некоторые бактерии появляются более чем в одной из этих групп, отнюдь не является недостатком, а является положительным приобретением для студента, поскольку только при повторении будет приобретено необходимое знакомство с культуральными характеристиками важных бактерий. Изучение различных групп, конечно, будет варьироваться в деталях у отдельных демонстраторов и в зависимости от требований студента — общее направление, которое оно должно принять, кратко указано в связи только с первой группой (стр. 410-411). Этот раздел следует тщательно проработать, прежде чем студент приступит к изучению бактериоскопического анализа.

Принято начинать изучение патогенных бактерий с организмов нагноения. Это большая группа, так как все патогенные бактерии обладают способностью при определенных условиях инициировать чисто гнойные процессы вместо или в дополнение к своим специфическим поражениям (например, Bacillus tuberculosis, Streptococcus lanceolatus, Bacillus typhosus и т. д.). Существует, однако, определенное количество организмов, которые обычно проявляют свою патогенность в образовании гноя. Их обычно группируют вместе под названием «пиогенные бактерии», в отличие от тех, которые лишь изредка выполняют пиогенную роль.

Организмы, включенные в эту группу:

1. Staphylococcus pyogenes albus.

2. Staphylococcus pyogenes aureus.

3. Staphylococcus pyogenes citreus.

4. Streptococcus pyogenes longus.

5. Micrococcus tetragenus.

6. Bacillus pyocyaneus.

7. Bacillus pneumoniæ.

и в некоторых специальных тканях

8. Micrococcus gonorrhϾ.

9. Micrococcus intracellularis meningitidis (Meningococcus).

10. Micrococcus catarrhalis.

11. Bacillus ægypticus (Koch-Weeks Bacillus).

Группу можно с преимуществом подразделить, как указано на следующих страницах:

I. Пиогенные кокки.

Staphylococcus pyogenes albus.

Staphylococcus pyogenes aureus.

Staphylococcus pyogenes citreus.

to contrast with

Micrococcus candicans.

Micrococcus agilis.

1. Подготовьте субкультуры из каждой:

Bouillon, }

Agar streak, }

Blood serum, }

Litmus milk. } and incubate at 37°C.

Agar streak, }

Gelatine stab, }

Potato. } and incubate at 20°C.

Сравните внешний вид культур изо дня в день. Отметьте, что M. agilis отказывается расти при 37° C.

2. Сделайте препараты «висячая капля» из бульонных и агаровых культур после двадцати четырех часов инкубации. Исследуйте микроскопически и сравните. Отметьте локомоторную активность M. agilis и броуновское движение остальных микрококков.

3. Подготовьте мазки из агаровых культур после двадцати четырех часов инкубации. Окрасьте на жгутики модифицированным методом Питфилда. Отметьте, что M. agilis — единственный микрококк, показывающий жгутики.

4. Сделайте микроскопические препараты каждого из всех различных сред после двадцати четырех, сорока восьми часов и трех дней инкубации. Окрасьте карболовым метиленовым синим, карболовым фуксином и по методу Грама. Исследуйте мазки микроскопически и сравните. Отметьте в препарате по Граму грамотрицательный характер некоторых отдельных кокков в каждом мазке, приготовленном из трехдневного роста — такие кокки мертвы.

5. Окрасьте срез ткани почки (показывающий образование абсцесса Staphylococcus aureus) по методу Грама и докрасьте эозином.

6. Окрасьте мазок гноя из абсцесса (содержащий Staphylococcus pyogenes aureus) карболовым метиленовым синим, а также по методу Грама, докрашенному эозином.

7. Инокулируйте [15] белую мышь подкожно тремя петлями сорокавосьмичасовой агаровой культуры Staphylococcus aureus, эмульгированной в 0,2 см³ стерильного бульона.

Внимательно наблюдайте при жизни, а когда наступит смерть, проведите тщательное посмертное исследование.

II. Пиогенные кокки.

Micrococcus gonorrhϾ.

Micrococcus intracellularis meningitidis (meningococcus).

Micrococcus catarrhalis.

Micrococcus tetragenus.

Micrococcus paratetragenus.

III. Пиогенные кокки.

Streptococcus pyogenes longus.

Streptococcus of bovine mastitis.

Streptococcus lanceolatus (Diplococcus pneumoniæ or pneumococcus).

to contrast with

Streptococcus brevis.

Streptococcus lebensis.

IV. Пиогенные бациллы.

Bacillus pneumoniæ (Friedlaender).

Bacillus rhinoscleromatis.

Bacillus lactis aerogenes.

V. Пиогенные бациллы.

Bacillus pyocyaneus.

to contrast with

Bacillus fluorescens liquefaciens.

Bacillus fluorescens non-liquefaciens.

VI. Группа пневмонии.

Streptococcus lanceolatus (pneumococcus).

Bacillus pneumoniæ (Friedlaender).

Streptococcus pyogenes longus.

VII. Дифтероидная группа.

Bacillus diphtheriæ (Klebs-Lœffler).

Bacillus Hoffmanni.

Bacillus xerosis.

Bacillus septus.

VIII. Группа кишечной палочки-тифа.

B. typhi abdominalis (B. typhosus).

B. coli communis.

B. enteritidis (Gaertner).

to contrast with

B. aquatilis sulcatus.

IX. Группа Эшериха.

B. coli communis (Escherich).

B. coli communior.

B. lactis aerogenes.

B. cloacæ.

X. Группа Гертнера.

Bacillus enteritidis (Gaertner).

B. paratyphosus A.

B. paratyphosus B.

Bacillus choleræ suum (Hog Cholera).

B. psittacosis.

XI. Группа Эберта.

B. typhosus (Eberth).

B. dysenteriæ (Shiga).

B. dysenteriæ (Flexner).

B. fæcalis alcaligines.

XII. Группа спирилл.

Vibrio choleræ.

Vibrio metschnikovi.

to contrast with

Vibrio proteus (Finkler and Prior).

Spirillum rubrum.

Spirillum rugula.

XIII. Группа сибирской язвы.

Bacillus anthracis.

to contrast with

Bacillus subtilis.

Bacillus mycoides.

Bacillus mesentericus fuscus.

XIV. Кислотоустойчивая группа.

Bacillus tuberculosis (human).

" " (bovine).

" " (avian).

" " (fish).

to contrast with

Bacillus phlei (Timothy grass bacillus).

Butter bacillus of Rabinowitch.

XV. Группа чумы.

Bacillus pestis.

B. septicæmiæ hæmorrhagicæ.

B. suipestifer.

XVI. Группа гриппа.

B. influenzæ.

Bacillus ægypticus (Koch-Weeks).

Bacillus pertussis.

XVII. Разное.

Bacillus lepræ.

Bacillus mallei.

Micrococcus melitensis.

XVIII. Группа стрептотриксов.

Streptothrix actinomycotica.

Streptothrix maduræ.

to contrast with

Cladothrix nivea.