«Основы бактериологической техники»

3. Добавьте 60 куб. см эмульсии к 140 куб. см физиологического раствора, содержащегося в подготовленной колбе Эрленмейера.

4. Поместите колбу в водяную баню с кипящей водой.

5. Соедините прямую трубку, предварительно удалив ватную пробку, с отводной трубкой парового котла; удалите пробку из вентиляционной трубки.

6. Когда термометр достигнет 100° C, откройте пружинный зажим на сифоне, слейте первый кубический сантиметр суспензии, который вытекает через сифон (т. е. содержимое сифонной трубки); соберите следующие 5 куб. см суспензии в стерильную градуированную пробирку, залейте чашки и подготовьте из них колбовые культуры, как в предыдущих экспериментах.

7. Повторяйте этот процесс с интервалами в двадцать пять минут пропаривания.

8. Наблюдайте за инокулированными чашками и колбами до завершения, при необходимости, семидневной инкубации.

9. Проконтролируйте эти эксперименты, но в данном случае отбирайте порции суспензии через сифон с интервалами от половины до одной минуты в течение пяти или десяти минут, предшествующих ранее определенной точке гибели.

Термическая точка гибели. —

Сухая — Вегетативные формы: Термическая точка гибели в этом случае — это температура, которая с уверенностью убивает тонкую пленку исследуемого организма после 10-минутного воздействия.

Необходимое оборудование:

Сухожаровой шкаф, снабженный терморегулятором.

Стерильные покровные стекла.

Колба, содержащая 250 куб. см стерильного физиологического раствора.

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).

Набор стерильных капсул.

Тигельные щипцы.

Метод. —

1. Подготовьте эмульсию из трех петель оптимальной культуры в 5 куб. см физиологического раствора в стерильной капсуле и исследуйте микроскопически, чтобы убедиться в отсутствии споровых форм.

2. Сделайте двенадцать мазков на стерильных покровных стеклах; поместите каждое в стерильную капсулу для высушивания.

3. Подвергайте каждую капсулу по очереди воздействию в сухожаровом шкафу в течение десяти минут при различной фиксированной температуре, варьирующейся на 5° C в диапазоне от 60° C до 120° C.

4. Извлекайте каждую капсулу из шкафа тигельными щипцами сразу после завершения десяти минут; извлеките покровное стекло изнутри стерильным пинцетом.

5. Поместите мазок в колбу, содержащую 200 куб. см питательного бульона.

6. Подготовьте пересевы из тех колб, которые показывают признаки роста, чтобы убедиться, что случайного загрязнения не произошло, а рост вызван именно тем организмом, который был изначально нанесен на мазок.

7. Проконтролируйте результат этих экспериментов.

Сухая — Споры: Термическая точка гибели в этом случае — это температура, которая с уверенностью убивает споры исследуемого организма, присутствующие в тонкой пленке, после 10-минутного воздействия.

Необходимое оборудование:

Как для вегетативных форм.

Метод. —

1. Подготовьте культуру на скошенном агаре и инкубируйте при оптимальных условиях для образования спор.

2. Пипеткой внесите 5 куб. см стерильного физиологического раствора в пробирку с культурой и эмульгируйте в нем весь поверхностный рост. Исследуйте микроскопически, чтобы определить наличие спор в большом количестве.

3. Распределите тонкие ровные мазки на двенадцати стерильных покровных стеклах и поместите каждое покровное стекло в отдельную стерильную капсулу.

4. Подвергайте каждую капсулу по очереди в течение десяти минут воздействию различной фиксированной температуры, варьирующейся на 5° C, в диапазоне от 100° C до 160° C.

5. Завершите исследование, как для вегетативных форм.

III. Реакция среды.

(А) Диапазон. —

1. Подготовьте бульонную культуру организма и инкубируйте при оптимальных условиях температуры и атмосферы в течение двадцати четырех часов.

2. Пипеткой внесите 0,1 куб. см культуры в стерильную капсулу; добавьте 9,9 куб. см стерильного бульона и тщательно перемешайте.

3. Подготовьте серию пробирок с питательным бульоном различной реакции, от +25 до -30 (см. стр. 155), а именно: +25, +20, +15, +10, +5, нейтральная, -5, -10, -15, -20, -25, -30.

4. Инокулируйте каждую из бульонных пробирок 0,1 куб. см разведенной культуры с помощью стерильной градуированной пипетки и инкубируйте при оптимальных условиях.

5. Осматривайте культуры с получасовыми интервалами с третьего по двенадцатый час. Отметьте реакцию пробирки или пробирок, в которых рост впервые виден макроскопически (вероятно, оптимальная реакция).

6. Продолжайте инкубацию до завершения, при необходимости, семи суток. Отметьте пределы кислотности и щелочности, при которых развился макроскопический рост (Диапазон реакции).

7. Проконтролируйте результат этих наблюдений.

(Б) Оптимальная реакция. — Оптимальная реакция уже была приблизительно определена при наблюдении диапазона. Ее можно зафиксировать в более узких пределах, инокулируя аналогичным образом серию пробирок с бульоном, которые представляют меньшие вариации реакции, чем использованные ранее (скажем, 1 вместо 5), для пяти точек по обе стороны от ранее наблюдаемого оптимума. Например, оптимальная реакция, наблюдаемая в серии экспериментов по определению диапазона, была +10. Теперь засейте пробирки с реакциями +15, +14, +13, +12, +11, +10, +9, +8, +7, +6, +5 и наблюдайте, как и прежде.

IV. Устойчивость к летальным агентам. —

(А) Высушивание. —

Необходимое оборудование:

Эксикатор Мюллера. Он состоит из стеклянного колокола, оснащенного вытяжной трубкой и краном (d), который можно закрепить на зеркальном стеклянном основании (c) с помощью воска или смазки. Он содержит цилиндрический сосуд из пористой глины (a), в верхнюю часть которого наливается чистая серная кислота, в то время как материал для высушивания помещается внутри его стенок на стеклянную полку (b). Воздух откачивается изнутри, и кислота быстро превращает глиняный сосуд в большую поглощающую поверхность (Рис. 157).

Вакуумный насос.

Чистая концентрированная серная кислота.

Стерильные покровные стекла.

Стерильный пинцет.

Колба с культурой, содержащая 200 куб. см питательного бульона.

Стерильная вентилируемая чашка Петри. Она готовится путем сгибания трех коротких отрезков алюминиевой проволоки в V-образную форму, подвешивания их на край нижней чашки и установки крышки на них (Рис. 158).

Метод. —

1. Подготовьте поверхностную культуру на питательном агаре во флаконе для культур и инкубируйте при оптимальных условиях в течение сорока восьми часов.

2. Исследуйте препараты из культуры микроскопически, чтобы убедиться в отсутствии спор.

3. Пипеткой внесите 5 куб. см стерильного физиологического раствора в колбу и суспендируйте в нем весь рост.

4. Распределите суспензию тонкими ровными мазками на стерильных покровных стеклах и поместите внутрь стерильных «чашек» для высушивания.

5. Как только они высохнут, перенесите мазки на покровных стеклах в вентилируемую чашку Петри с помощью стерильного пинцета.

Fig. 157.—Mueller's desiccator.

6. Поместите чашку Петри внутрь эксикатора Мюллера; заполните верхнюю камеру чистой серной кислотой, накройте стеклянным колоколом и откачайте воздух изнутри. Десять минут спустя соедините эксикатор с промывной склянкой с серной кислотой, установив воздушный фильтр, чтобы внутрь поступал только сухой стерильный воздух.

Fig. 158.—Petri dish for drying cultivations.

7. С интервалом в пять часов открывайте аппарат, извлекайте один из мазков на покровном стекле из чашки Петри и переносите его внутрь колбы с культурой, соблюдая все меры предосторожности против загрязнения. Снова загерметизируйте эксикатор и снова откачайте воздух, а затем впустите сухой стерильный воздух, как и прежде.

8. Инкубируйте колбу с культурой при оптимальных условиях до завершения семи суток, при необходимости; и определите время воздействия, при котором наступает гибель.

9. Залейте чашки из тех колб с культурой, в которых наблюдается рост, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения.

10. Повторите эти наблюдения с часовыми интервалами в течение пяти часов до и после времени гибели, определенного в первой серии экспериментов.

(Б) Свет. —

(а) Рассеянный дневной свет:

1. Подготовьте пробирочную культуру в питательном бульоне и инкубируйте при оптимальных условиях в течение сорока восьми часов.

Fig. 159.—Plate with star for testing effect of light.

2. Залейте двадцать чашечных культур, десять на питательном желатине и десять на питательном агаре, каждая из которых содержит 0,1 куб. см бульонной культуры.

3. Поместите одну агаровую чашку и одну желатиновую чашку в горячий и холодный термостаты соответственно в качестве контроля.

4. Прикрепите кусочек черной бумаги, вырезанный в форме креста или звезды, в центре крышки каждой из оставшихся чашек (Рис. 159).

5. Подвергните эти чашки воздействию рассеянного дневного света (не прямых солнечных лучей) в лаборатории в течение одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, восьми, десяти, двенадцати часов.

6. После воздействия света инкубируйте при оптимальных условиях.

7. Осмотрите чашечные культуры после двадцати четырех и сорока восьми часов инкубации и сравните с двумя контрольными образцами. Запишите результаты. Если рост отсутствует на той части чашки, которая не была защищена черной бумагой, продолжайте инкубацию и ежедневное наблюдение до конца семи суток.

8. Проконтролируйте результаты.

(б) Прямой солнечный свет:

1. Подготовьте чашечные культуры точно так же, как в предыдущих экспериментах, и поместите два контрольных образца в термостаты.

2. Расположите оставшиеся чашки на платформе под прямыми лучами солнца.

3. Сверху на каждую чашку поставьте небольшую стеклянную посуду диаметром 14 см и глубиной 5 см.

4. Налейте раствор алюмокалиевых квасцов (2% в дистиллированной воде) в каждую посуду до глубины 2 см, чтобы поглотить тепло солнечных лучей и тем самым исключить возможное влияние температуры на культуры.

5. После воздействия в течение периодов, аналогичных тем, что использовались в предыдущем эксперименте, инкубируйте и завершите наблюдение, как указано выше.

(в) Основные цвета: Каждый цвет — фиолетовый, синий, зеленый и красный — должен быть протестирован отдельно.

1. Подготовьте чашечные культуры, как в предыдущих «световых» экспериментах, и инкубируйте контрольные образцы.

2. Fasten a strip of black paper, 3 cm. wide, across one diameter of the cover of each plate.

3. Покройте остальную часть поверхности крышки пленкой из чистого фотографического коллодия, содержащего 2% любого из следующих анилиновых красителей, по мере необходимости:

Chrysoidin (for red).

Malachite green (for green).

Eosin, bluish (for blue).

Methyl violet (for violet).

4. Подвергните чашки, подготовленные таким образом, воздействию яркого дневного света (но не прямых солнечных лучей) в течение различных периодов времени и завершите наблюдения, как в предыдущих экспериментах. Бактерицидное действие света, по-видимому, зависит от более преломляемых лучей фиолетового конца спектра и отмечается независимо от того, пропускаются ли красно-желтые лучи.

5. Проконтролируйте результаты.

Примечание. — Ультрафиолетовые лучи, полученные от кварцевой ртутной лампы, с большой скоростью уничтожают бактериальную жизнь в лабораторных условиях.

(в) Нагревание. — (См. Термическая точка гибели, стр. 298.)

(г) Антисептики и дезинфицирующие средства. — Устойчивость, проявляемая любой данной бактерией по отношению к любому указанному дезинфицирующему средству или гермициду, должна исследоваться со ссылкой на следующие пункты:

(А) Коэффициент ингибирования — т. е. тот процент дезинфицирующего средства, присутствующий в питательной среде, который достаточен для предотвращения роста и размножения бактерии.

(Б) Нижний летальный коэффициент — т. е. время воздействия, необходимое для уничтожения вегетативных форм бактерии, суспендированных в воде при 20°–25° C, в которой дезинфицирующее средство присутствует в средней концентрации (концентрация недостаточна для вызова плазмолиза). И если бактерия является спорообразующей,

(В) Верхний летальный коэффициент — т. е. время воздействия, необходимое для уничтожения спор бактерии в условиях, аналогичных тем, что указаны в Б.

Пример, подробно описанный здесь, относится только к некоторым дезинфицирующим средствам:

viz:—Bichloride of mercury;

Formaldehyde;

Carbolic acid;

исследованным в отношении B. anthracis, но техника практически одинакова для всех других химических дезинфицирующих средств.

Коэффициент ингибирования. —

Необходимое оборудование:

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths).

Case of sterile pipettes, 1 c.c. (in tenths).

Стерильные пробирки или капсулы для разведений.

Пробирки с питательным бульоном, каждая из которых содержит отмеренные 10 куб. см среды.

Двадцатичетырехчасовая агаровая культура недавно выделенной B. Anthracis.

Гермициды:

1. Пятипроцентный водный раствор карболовой кислоты.

2. Однопроцентный водный раствор сулемы (перхлорида ртути).

3. Однодесятипроцентный водный раствор формальдегида.

Метод. —

1. Пронумеруйте шесть бульонных пробирок по порядку от 1 до 6. Инокулируйте каждую из исходной культуры B. anthracis и сразу добавьте различное количество [10] раствора карболовой кислоты, а именно:

To tube 1 add 2.0 c.c. (= 1:100)

To tube 2 add 1.0 c.c. (= 1:200)

To tube 3 add 0.6 c.c. (= 1:300)

To tube 4 add 0.5 c.c. (= 1:400)

To tube 5 add 0.4 c.c. (= 1:500)

To tube 6 add 0.2 c.c. (= 1:1,000)

2. Подготовьте аналогичную серию пробирочных культур, пронумерованных по порядку от 7 до 12, и добавьте различное количество раствора сулемы, а именно:

To tube 7 add 0.1 (= 1:1,000)

To tube 8 add 0.05 (= 1:2,000)

To tube 9 add 0.03 (= 1:3,000)

To tube 10 add 0.025 (= 1:4,000)

To tube 11 add 0.02 (= 1:5,000)

To tube 12 add 0.01 (= 1:10,000)

3. Подготовьте аналогичную серию пробирочных культур, пронумерованных по порядку от 13 до 18, и добавьте различное количество раствора формальдегида, а именно:

To tube No. 13 add 1.0 c.c. (= 1:1,000)

To tube No. 14 add 0.4 c.c. (= 1:2,500)

To tube No. 15 add 0.2 c.c. (= 1:5,000)

To tube No. 16 add 0.1 c.c. (= 1:10,000)

To tube No. 17 add 0.075 c.c. (= 1:15,000)

To tube No. 18 add 0.05 c.c. (= 1:20,000)

4. Инкубируйте все три серии культур при оптимальных условиях температуры и атмосферы.

5. Осматривайте каждую из пробирок с культурой изо дня в день до завершения семи суток и отметьте те пробирки, если таковые имеются, в которых происходит рост.

6. Из тех пробирок, в которых наблюдается рост, подготовьте пересевы на подходящие среды и убедитесь, что организм, вызывающий рост, является тем самым, который изначально использовался в тесте, а не случайным загрязнением.

Нижний летальный коэффициент. —

Необходимое оборудование:

Высококонцентрированные растворы дезинфицирующих средств.

Стерильные пробирки для приготовления разведений из концентрированных растворов дезинфицирующих средств.

Предметные стекла для висячей капли.

Покровные стекла.

Колба Эрленмейера, содержащая 100 куб. см стерильной дистиллированной воды.

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).

Case of sterile pipettes, 1 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).

Метод. —

1. Подготовьте поверхностную культуру «тестового» организма B. anthracis на питательном агаре во флаконе для культур и инкубируйте при оптимальных условиях в течение двадцати четырех часов; затем исследуйте культуру микроскопически, чтобы убедиться в отсутствии спор.

2. Подготовьте растворы различных процентных концентраций каждого дезинфицирующего средства.

3. Сделайте серию препаратов «висячая капля» из агаровой культуры, используя петлю раствора дезинфицирующего средства различных процентных концентраций для приготовления эмульсии на каждом покровном стекле.

4. Исследуйте микроскопически и отметьте самый сильный раствор, который не вызывает плазмолиза, и самый слабый раствор, который вызывает плазмолиз организма.

5. Сделайте контрольные препараты этих двух растворов и определите процентную концентрацию для тестирования.

6. Пипеткой внесите 10 куб. см стерильной воды во флакон для культур и суспендируйте в нем весь поверхностный рост.

7. Перенесите суспензию в колбу Эрленмейера и смешайте ее с 90 куб. см стерильной воды, оставшейся в колбе.

8. Пипеткой внесите 10 куб. см разведенной суспензии в каждую из десяти стерильных пробирок.

9. Промаркируйте одну из пробирок «Контроль» и поместите ее в термостат при 18° C.

10. Добавьте в каждую из оставшихся пробирок достаточное количество [11] концентрированного раствора дезинфицирующего средства для получения ранее определенной процентной концентрации (см. шаг 5).

11. Инкубируйте пробирки при 18°–20° C.

12. С часовыми интервалами извлекайте контрольную пробирку и одну из пробирок с добавленным дезинфицирующим средством из термостата.

13. Сделайте пересев как из контрольной, так и из тестовой суспензии на поверхность питательного агара; инкубируйте при оптимальных условиях.

14. Осматривайте эти пробирки с культурой изо дня в день до завершения семи суток и определите кратчайшее время воздействия, необходимое для гибели вегетативных форм.

Верхний летальный коэффициент. —

1. Подготовьте поверхностные культуры «тестовых» организмов на питательном агаре во флаконе для культур и инкубируйте при оптимальных условиях в течение трех дней для образования их спор.

2. Перенесите эмульсию в стерильную пробирку и нагревайте в дифференциальном стерилизаторе в течение десяти минут при 80° C для уничтожения всех вегетативных форм.

3. Используя тот процентный раствор дезинфицирующего средства, который был определен в предыдущем эксперименте, завершите исследования, как подробно описано в нем, шаги 7–14, увеличивая интервал между посевами до двух, трех или пяти часов, если это считается целесообразным.

Примечание. — Там, где необходимо оставить организмы в контакте с сильным раствором дезинфицирующего средства на длительные периоды, необходимо принять меры для удаления каждого следа дезинфицирующего средства с бактерий перед переносом их на свежие питательные среды; в противном случае, хотя они и не будут фактически убиты, присутствие дезинфицирующего средства может предотвратить их развитие и тем самым привести к ошибочному выводу. Следовательно, во всех гермицидных экспериментах важно прежде всего определить коэффициент ингибирования используемого гермицида. В обстоятельствах, упомянутых выше, обычно достаточно подготовить пересевы в таком объеме жидкой питательной среды, которого было бы достаточно для снижения концентрации гермицида примерно до одной сотой процента ингибирования, предполагая, что весь объем инокулята состоял из той концентрации гермицида, которая использовалась в тесте. В некоторых случаях просто нейтрализовать гермицид и сделать его инертным путем промывания организмов в каком-либо негермицидном растворе (например, в сульфиде аммония при использовании солей ртути в качестве гермицида). Однако, когда желательно удалить последние следы гермицида, действуйте следующим образом:

1. Перенесите суспензию бактерий в стерильные центрифужные пробирки; добавьте необходимое количество дезинфицирующего средства и оставьте его в контакте с бактериями на необходимый период.

2. Тщательно центрифугируйте, слейте пипеткой надосадочную жидкость; заполните пробирку стерильной водой и равномерно распределите осадок по всей жидкости.

3. Снова центрифугируйте, слейте пипеткой надосадочную жидкость; заполните пробирку стерильной водой; равномерно распределите осадок по всей жидкости и перенесите суспензию в литровую колбу.

4. Доведите до литра добавлением стерильной воды; профильтруйте суспензию через стерильную фарфоровую свечу.

5. Эмульгируйте бактериальный остаток с 5 куб. см стерильного бульона.

6. Подготовьте необходимые пересевы из этой эмульсии.

ПАТОГЕНЕЗ.

Живые бактерии. —

(а) Психрофильные бактерии: Когда организм растет только при 18°–20° C или ниже,

1. Подготовьте культуры в питательном бульоне и инкубируйте при оптимальных условиях.

2. После семидневной инкубации введите то количество культуры, которое соответствует 1% от массы тела здоровой лягушки, в спинной лимфатический мешок рептилии.

3. Наблюдайте до наступления смерти или, в случае отрицательного результата, до завершения двадцати восьми суток (см. Глава XVIII).

4. Если и когда наступит смерть, проведите тщательное вскрытие (см. Глава XIX).

(б) Мезофильные бактерии: Когда организм растет при 35°–37° C,

1. Приготовьте культуры в питательном бульоне и инкубируйте при оптимальных условиях в течение сорока восьми часов.

2. Выберите двух белых мышей, по возможности одного возраста, размера и веса.

3. Инокулируйте первую мышь подкожно в корень хвоста количеством культуры, эквивалентным 1 проценту от массы ее тела.

4. Инокулируйте вторую мышь внутрибрюшинно аналогичной дозой.

5. Наблюдайте тщательно до наступления смерти или до истечения двадцати восьми дней.

6. Если инокулированные животные погибают, проведите полное патологоанатомическое вскрытие.

Если смерть наступает вскоре после инъекции бактериальных культур, эксперименты по инокуляции следует повторить два или три раза. Затем, если исследуемый микроорганизм неизменно проявляет патогенные эффекты, следует принять меры для установления, по возможности, минимальной летальной дозы (см. ниже) роста на твердых средах для лягушки или белой мыши соответственно. Других подопытных животных — например, белую крысу, морскую свинку и кролика — следует затем протестировать аналогичным образом.

7. Если инокулированные мыши остаются здоровыми, проверьте действие данного микроорганизма на белых крысах, морских свинках, кроликах и т. д.

Минимальная летальная доза (м. л. д.); если целью инокуляции является определение минимальной летальной дозы, необходимо следовать несколько иной процедуре. Для этого и других точных экспериментов изготавливается специальная платиновая петля размером около 2,5 мм на 0,75 мм с параллельными сторонами, откалиброванная путем тщательного взвешивания для определения приблизительного количества влажного бактериального роста, которое удерживает петля при заполнении.

1. Культура должна быть приготовлена на твердой среде с оптимальной реакцией, инкубирована при оптимальной температуре и введена в период наибольшей активности и жизнеспособности конкретного микроорганизма, который требуется протестировать.

2. Расставьте четыре стерильные капсулы в ряд и промаркируйте их I, II, III и IV. В первую внесите 10 куб. см стерильного бульона с помощью стерильной градуированной пипетки; а в каждую из оставшихся трех — по 9,9 куб. см.

3. Возьмите одну петлю бактериального роста с поверхности среды в пробирке с культурой, соблюдая обычные меры предосторожности против загрязнения, и равномерно эмульгируйте ее с бульоном в первой капсуле. Каждый кубический сантиметр эмульсии теперь будет содержать одну десятую часть микроорганизмов, содержавшихся в исходной петле (кратко записывается как 0,1 петли).

4. Возьмите 0,1 куб. см эмульсии из первой капсулы с помощью стерильной градуированной пипетки, перенесите ее во вторую капсулу и тщательно перемешайте. Опустите использованную пипетку в банку с раствором лизола. Это доводит объем жидкости во второй капсуле до 10 куб. см, и, следовательно, каждый кубический сантиметр бульона в капсуле II содержит 0,001 петли.

5. Аналогичным образом 0,1 куб. см смеси переносится из капсулы II в капсулу III (1 куб. см бульона в капсуле III содержит 0,00001 петли), а затем из капсулы III в капсулу IV (1 куб. см бульона в капсуле IV содержит 0,0000001 петли).

Приготовленные таким образом разведения можно свести в таблицу;

Capsule I = 1 loopful + 10 c.c. water ∴ 1 c.c.=0.1 loop.

Capsule II = 0.1 c.c. capsule I + 9.9 c.c. water ∴ 1 c.c.=0.001 loop.

Capsule III = 0.1 c.c. capsule II + 9.9 c.c. water ∴ 1 c.c.=0.00001 loop.

Capsule IV = 0.1 c.c. capsule III + 9.9 c.c. water ∴ 1 c.c. = 0.0000001 loop.

6. С помощью стерильных градуированных пипеток возьмите необходимое количество бульона, соответствующее различным десятичным долям петли, из соответствующих капсул, перенесите каждую «дозу» в отдельную стерильную капсулу и промаркируйте; а в те дозы, которые имеют малый объем, добавьте необходимое количество стерильного бульона, чтобы довести его до 1 куб. см.

7. Кратные петли готовятся путем эмульгирования 1, 2, 5 или 10 петель, каждая с 1 куб. см стерильного бульона в отдельных стерильных капсулах.

8. Инокулируйте серию животных этими измеренными дозами, наполняя шприц сначала из той капсулы, которая содержит наименьшую дозу, затем из капсулы, содержащей следующую по величине дозу, и так далее. При соблюдении осторожности не возникнет необходимости стерилизовать шприц во время серии инокуляций.

9. Засейте пробирки с желатином или агаром, разжиженным нагреванием, из каждого из более высоких разведений, скажем, от 0,0000001 петли до 0,01 петли; залейте чашки и инкубируйте. Когда рост станет видимым, подсчитайте количество присутствующих микроорганизмов, вычислите среднее значение и определите количество бактерий, присутствующих в одной петле инокулята.

10. Наименьшая доза, вызывающая инфекцию и смерть инокулированного животного, отмечается как минимальная летальная доза.

Токсины. —

Приготовьте колбовые культуры исследуемого микроорганизма в глюкозо-формиатном бульоне и инкубируйте в течение четырнадцати дней при оптимальных условиях.

(а) Внутриклеточные или нерастворимые токсины:

1. Нагрейте жидкую культуру на водяной бане при 60° C в течение тридцати минут. (Полученная стерильная мутная жидкость часто называется «убитой» культурой.)

2. Инокулируйте пробирку со стерильным бульоном таким же количеством и инкубируйте при оптимальных условиях. Этот «контроль» затем служит для демонстрации отсутствия в токсине живых бактерий.

Fig. 160.—Apparatus arrange for toxin filtration.

3. Введите внутривенно количество культуры, соответствующее 1 проценту от массы тела выбранного животного, обычно одного из мелких грызунов.

4. Наблюдайте в течение жизни или до завершения двадцати восьми дней, и в случае смерти, наступившей в этот период, проведите полное патологоанатомическое вскрытие.

5. Повторите эксперимент по крайней мере один раз. В случае положительного результата оцените минимальную летальную дозу «убитой» культуры для каждого из видов подопытных животных.

(б) Внеклеточные или растворимые токсины:

1. Отфильтруйте культуру через фарфоровую фильтровальную свечу (Беркефельд) в стерильную фильтровальную колбу, расположив аппарат, как показано на прилагаемом рисунке (Рис. 160).

2. Инокулируйте мышей, крыс, морских свинок и кроликов подкожно таким количеством токсина, которое соответствует 1 проценту от массы тела каждого из них соответственно, и наблюдайте, при необходимости, до истечения одного месяца.

3. Инокулируйте «контрольную» пробирку с бульоном таким же количеством и инкубируйте, чтобы определить отсутствие в отфильтрованном токсине живых бактерий.

4. В случае летального исхода проведите полное и тщательное патологоанатомическое вскрытие.

5. Повторите эксперименты и, если результаты положительные, установите минимальную летальную дозу токсина для каждого из восприимчивых животных.

Оценка м. л. д. токсина проводится по принципам, аналогичным тем, что установлены для живых бактерий (см. стр. 316), просто заменяя 1 куб. см токсина в качестве единицы измерения вместо единицы «петля» живой культуры.

Часто случается, что в ходе случайных исследований имеется бульонная пробирочная культура для теста на токсин, в то время как колбовой культуры нет. В таких случаях неоценима маленькая фильтровальная свеча и трубка Мартена (Рис. 161), специально разработанная для фильтрации небольших количеств жидкости. Она состоит из узкой фильтровальной колбы, достаточно большой, чтобы вместить обычную пробирку размером 18 × 2 см. Горлышко трубчатой свечи Шамберлана размером 15 × 1,5 см закрыто перфорированной резиновой пробкой, в которую вставляется конец ножки воронки с чертополоховой головкой, в то время как непосредственно под основанием воронки расположена резиновая пробка для закрытия горлышка фильтровальной колбы. Когда аппарат зафиксирован в нужном положении и подключен к вытяжному насосу, культура наливается в головку воронки, и благодаря относительно большой фильтрующей поверхности свободный от микробов фильтрат быстро втягивается в приемную пробирку.

Повышение вирулентности микроорганизма. — Если желательно повысить или «экзальтировать» вирулентность слабопатогенного микроорганизма, необходимы специальные методы инокуляции, тщательно адаптированные к требованиям каждого отдельного случая. Среди наиболее важных — следующие:

1. Пассаж вируса. — Инокуляция чистых культур микроорганизма высоковосприимчивым животным и пассирование его как можно быстрее от животного к животному, всегда выбирая тот метод инокуляции — например, внутрибрюшинный, — который создает для микроорганизма наиболее благоприятные условия для роста и размножения.

Fig. 161—Martin's filtering apparatus for small quantities of fluid.

2. Вирус плюс вирулентные микроорганизмы. — Инокуляция чистых культур микроорганизма вместе с чистыми культурами какого-либо другого микроба, который сам по себе достаточно вирулентен, чтобы обеспечить смерть подопытного животного, либо в то же самое место, либо в другую часть тела. Благодаря такой ассоциации микроорганизм с низкой вирулентностью часто приобретает более высокую степень вирулентности, которая может быть еще больше повышена с помощью «пассажей» (см. выше).

3. Вирус плюс токсины. — Инокуляция чистых культур микроорганизма в какое-либо выбранное место вместе с подкожной, внутрибрюшинной или внутривенной инъекцией токсина — например, одного из тех, что вырабатываются группой Proteus — одновременно с инъекцией слабого вируса, до нее или сразу после нее. Таким образом естественная резистентность животного снижается, и инокулированный микроорганизм получает возможность размножаться и производить свой патогенный эффект, а его вирулентность впоследствии повышается с помощью «пассажей».

Аттенуация вирулентности микроорганизма. — Аттенуация или снижение вирулентности патогенного микроба обычно достигается с гораздо меньшими трудностями, чем экзальтация его вирулентности, и, как правило, осуществляется путем изменения среды обитания культур, как, например:

1. Культивирование в таких средах, которые непригодны по причине их (а) состава или (б) реакции.

2. Культивирование в подходящих средах, но при неподходящей температуре.

3. Культивирование в подходящих средах, но в неподходящей атмосфере.

4. Культивирование в подходящих средах, но в неблагоприятных условиях в отношении света, движения и т. д.

Аттенуация вируса также может быть достигнута путем

5. Пассажа через естественно резистентных животных.

6. Воздействия высушивания.

7. Воздействия газообразных дезинфицирующих средств.

8. Комбинации двух или более вышеуказанных методов.

ИММУНИЗАЦИЯ.

Дальнейшее изучение патогенетических свойств любой конкретной бактерии включает активную иммунизацию одного или нескольких ранее нормальных животных. Эта цель может быть достигнута различными средствами; но следует помнить, что иммунизация не проводится по какому-либо жесткому правилу или только одним методом, а обычно комбинацией методов, адаптированных к требованиям каждого конкретного случая. Обычные методы включают:

А. Активная иммунизация.

I. Инокуляция мертвыми бактериями (т. е. бактериями, убитыми нагреванием; действием ультрафиолетовых лучей, химических бактерицидных средств или аутолизом).

II. Инокуляция аттенуированными штаммами бактерий.

III. Инокуляция живыми вирулентными бактериями (при необходимости с повышенной вирулентностью).

Б. Комбинированная активная и пассивная иммунизация:

IV. Инокуляция смесями токсин-антитоксин.

АКТИВНАЯ ИММУНИЗАЦИЯ.

Иммунизация кролика против Diplococcus pneumoniæ может служить примером общих методов иммунизации лабораторных животных.

1. Возьмите взрослого кролика весом не менее 1200–1500 граммов (крупные кролики весом 2000 граммов и более наиболее подходят для экспериментов по иммунизации). Тщательно следите за весом и температурой в течение нескольких дней, занятых следующими этапами.

2. Инокулируйте небольшого кролика внутрибрюшинно одной или двумя петлями двадцатичетырехчасовой культуры вирулентного штамма Diplococcus pneumoniæ на кровяном агаре.

Смерть должна наступить в течение двадцати четырех часов, и в любом случае она не задержится дольше сорока восьми часов.

3. При соблюдении асептических мер предосторожности во время вскрытия перенесите петлю крови из сердца в колбу Эрленмейера, содержащую 50 куб. см стерильного питательного бульона. Инкубируйте при 37° C в течение двадцати четырех часов.

4. Приготовьте также несколько культур на кровяном агаре из крови сердца кролика, промаркируйте их все как O.C. (исходная культура). После двадцати четырех часов инкубации при 37° C наденьте резиновый колпачок на закрытое пробкой горлышко пробирки всех культур, кроме одной, и покройте колпачок канадским бальзамом или шеллачным лаком, высушите и верните в термостат.

Это предотвратит испарение, и культуры, запечатанные таким образом, будут сохранять неизменную вирулентность в течение значительного времени.

5. Сделайте свежий пересев на кровяной агар из незапечатанной культуры O.C. и после двадцати четырех часов инкубации при 37° C определите минимальную летальную дозу этого штамма на серии мышей (см. стр. 316).

6. Поместите колбу, содержащую двадцатичетырехчасовую бульонную культуру (этап 3), на водяную баню при 60° C на один час. Быстро охладите колбу под струей холодной воды.

7. Определите стерильность этой (?) убитой культуры, перенеся один кубический сантиметр в каждую из нескольких пробирок с питательным бульоном, и инкубируйте при 37° C в течение двадцати четырех часов. Если происходит рост Diplococcus pneumoniæ, снова нагрейте культуру на водяной бане при 60° C в течение одного часа и снова проверьте на стерильность.

8. Введите выбранному кролику внутривенно (см. стр. 363) 2 куб. см убитой культуры и введите еще 10 куб. см в брюшную полость.

В течение следующих нескольких дней животное потеряет немного в весе и, возможно, проявит некоторую степень пирексии.

9. Когда температура и вес снова вернутся к норме — обычно примерно через семь дней после инокуляции — снова введите убитую культуру, на этот раз дав дозу 5 куб. см внутривенно и 20 куб. см внутрибрюшинно. Вероятно, будет наблюдаться температурная и весовая реакция, аналогичная той, что была после первой инъекции, но менее выраженная, но примерно через неделю животное будет готово к следующей инъекции.

10. Когда будете готовы сделать третью инъекцию, приготовьте свежий пересев на кровяной агар из другой пробирки O.C. и после двадцати четырех часов инкубации приготовьте минимальную летальную дозу (как определено в п. 5) и введите ее подкожно в брюшную стенку кролика.

Вероятно, будет наблюдаться легкая местная реакция, а также реакции веса и температуры.

11. Через неделю-десять дней введите аналогичную минимальную летальную дозу в брюшную полость.

12. Очень внимательно наблюдайте за весом и температурой кролика и, регулируя даты инокуляции в зависимости от общего состояния животного, продолжайте вводить живые культуры пневмококка в брюшную полость, постепенно увеличивая дозу кратными десяти.

13. С интервалами в два месяца можно собирать образцы крови из задней ушной вены и проверять сыворотку на наличие специфических антител.

14. При благоприятных условиях после шести месяцев постоянной работы будет обнаружено, что кролику можно вводить внутрибрюшинно целую культуру на кровяном агаре без каких-либо видимых вредных последствий; и эта характеристика — устойчивость к летальным эффектам больших доз вируса — является единственным критерием иммунитета. Более того, сыворотка, отделенная от крови, взятой у животного примерно через неделю после инъекции, при использовании в дозах 0,01 куб. см защитит мышь от летальных эффектов по крайней мере десяти минимальных летальных доз живых пневмококков.

В предыдущей иллюстрации предполагалось, что подопытному кролику был придан полный приобретенный активный иммунитет вследствие образования антител, специфичных к diplococcus pneumoniæ, в количестве, достаточном для обеспечения разрушения огромных доз живых кокков — антигеном (то есть веществом, введенным в ответ на которое было выработано антитело) в данном конкретном случае является бактериальная протоплазма пневмококка с его эндотоксинами.

Но при условии, что смерть не наступает немедленно после инъекции антигена, специфическое антитело всегда образуется в большем или меньшем количестве; и в экспериментальной работе достаточное количество любого необходимого антитела часто можно получить, не доводя процесс иммунизации до его логического завершения.

Например, если иммунизация кролика против Bacillus typhosus начинается по уже изложенным принципам, часто будет обнаружено, после нескольких инъекций «убитой» культуры, что сыворотка крови животного (даже при разведении в несколько сотен раз ее объема нормальным физиологическим раствором) содержит специфический агглютинин для B. typhosus — и если единственной целью эксперимента была подготовка агглютинина, инокуляции вполне можно прекратить на этом этапе, хотя животное еще не является иммунным в строгом смысле этого слова.

Опять же, антитела могут образовываться в ответ на антигены, отличные от инфекционных частиц — таким образом, инъекция подходящим животным чужеродных белков, таких как яичный альбумин, гетерологичные сыворотки крови или эритроциты крови от другого вида животного, приведет к образованию специфических антител, обладающих определенным сродством к их соответствующим антигенам.

Наиболее важным антителом этого последнего типа является гемолизин, вещество, которое появляется в сыворотке крови животного, предварительно инъецированного отмытыми клетками крови от животного другого вида. Сыворотка такого животного обладает способностью разрушать эритроциты того вида, который использовался в качестве антигена, и вызывать высвобождение содержащегося в них гемоглобина, и является специфической в своем действии до такой степени, что не оказывает никакого вредного воздействия на эритроциты любого другого вида животных.

Действие этой сыворотки обусловлено присутствием двух различных тел: комплемента и гемолизина.

Комплемент (или алексин) — это термолабильное, легко окисляющееся тело, присутствующее в переменном, но неизменном количестве в нормальной сыворотке каждого животного. Это вещество, которое оказывает литическое действие на все чужеродные вещества, введенные в кровь или ткани; но само по себе является сравнительно инертным телом и способно оказывать свое максимальное литическое действие только в присутствии и в сочетании со специфическим антителом, или иммунным телом.

Комплемент получают (не смешанным с антителом) путем сбора свежей сыворотки крови от любого здорового нормального (то есть неинокулированного) животного. Сыворотка морских свинок наиболее часто используется для экспериментальной работы.

Гемолизин (иммунное тело, копула, сенсибилизирующее тело, амбоцептор) — это термостабильное антитело, образующееся в ответ на инъекцию эритроцитов, которое, хотя само по себе инертно, способно связывать комплемент, присутствующий в нормальной сыворотке, с эритроцитами того вида, который использовался в качестве антигена, — комбинация, приводящая к гемолизу.

Гемолизин получают путем сбора свежей сыворотки крови от соответствующим образом инокулированного животного и подвергания ее воздействию температуры 56° C (для разрушения термолабильного комплемента) в течение 15–30 минут перед использованием. Затем он называется инактивированным и реактивируется добавлением свежей нормальной сыворотки — то есть сыворотки, содержащей комплемент.

Гемолизин важен в академическом плане благодаря тому, что многие проблемы иммунитета были прояснены с его помощью; но его нынешнее практическое значение заключается в применении гемолитической системы (то есть гемолизина, соответствующего эритроцитарного раствора и комплемента) к определенным лабораторным методам, имеющим своей целью либо идентификацию инфекционного агента, либо диагностику наличия инфекции.

Для использования в этих лабораторных методах диагностики наиболее удобно готовить гемолитическую сыворотку, специфичную для человеческой крови — независимо от того, является ли лаборатория изолированной или прикрепленной к большой больнице. Однако вместо нее можно использовать бычью, овечью или козью кровь, если она легко доступна, и, хотя следующий метод направлен на приготовление человеческого гемолизина, та же процедура применима во всех случаях.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ.

Необходимый аппарат:

Small centrifuge, preferably electrically driven, with two receptacles

for tubes, and enclosed in a safety shield (Fig. 162).

Sterile centrifuge tubes (10 c.c. capacity), Fig. 163.

Sterile pipettes (10 c.c. graduated) in case.

Sterile glass capsules (in case).

Sterile test-tubes.

Sterile all glass syringe (5 c.c. or 10 c.c. capacity)

and needle.

Fig. 162.—Small electrical centrifuge.

Fig. 163.—Centrifuge tube.

Необходимые реагенты:

Normal saline solution.

10 per cent. sodium citrate solution in normal saline.

Human blood (vide infra).

Метод. —

1. Выберите здорового взрослого кролика весом не менее 2500 граммов в соответствии с уже данными указаниями (стр. 322) и подготовьте его к внутрибрюшинной инокуляции.

2. Отмерьте 2 куб. см цитратной человеческой крови (собранной при хирургической операции или венесекции, или взятой путем венепункции из срединной локтевой или срединной головной вены нормального взрослого человека) в центрифужную пробирку и тщательно отцентрифугируйте.

3. Промойте тремя сменами нормального физиологического раствора (см. также стр. 388).

4. Перенесите отмытые клетки в стерильную капсулу с помощью стерильной пипетки. Добавьте 5 куб. см нормального физиологического раствора и тщательно перемешайте.

5. Наберите смесь клеток и физиологического раствора в цельностеклянный шприц и введите в брюшную полость кролика.

6. Семь дней спустя введите внутрибрюшинно отмытые клетки из 5 куб. см человеческой крови, смешанные с 5 куб. см нормального физиологического раствора.

7. Семь дней спустя введите отмытые клетки из 10 куб. см человеческой крови, смешанные с 5 куб. см нормального физиологического раствора.

8. После дальнейшего интервала в семь дней повторите инъекцию отмытых клеток из 10 куб. см человеческой крови, смешанных с 5 куб. см нормального физиологического раствора.

Примечание. — Лучшие результаты получаются, если вторая и последующие инъекции делаются внутривенно, даже если используются меньшие количества отмытых эритроцитов. Если, однако, выбран внутривенный путь, необходимо соблюдать чрезвычайную осторожность, чтобы избежать попадания воздуха в вену — несчастный случай, за которым в течение нескольких минут следует смерть кролика от легочной эмболии.

9. Дайте пройти пяти дням, затем возьмите предварительный образец крови, скажем, около 2 куб. см, из уха кролика. Дайте ей свернуться, отделите сыворотку и перенесите в стерильную пробирку. Поместите пробирку на водяную баню при 56° C на пятнадцать минут (для инактивации) и протестируйте сыворотку количественно на гемолитические свойства следующим образом:

ТИТРОВАНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ.

Необходимый аппарат:

Electrical centrifuge.

Sterile centrifuge tubes.

Water-bath regulated at 56°C.

Sterilised pipettes 10 c.c. graduated in tenths.

Sterilised pipettes 1 c.c. graduated in tenths.

Sterile test-tubes, 16 × 2 cm.

Small sterile test-tubes, 9 × 1 cm.

Small test-tube rack, or roll of plasticine.

Capillary teat pipettes.

Stout rubber band or length of small rubber tubing.

Необходимые реагенты и метод приготовления:

1. Нормальный физиологический раствор.

2. Гемолитическая сыворотка, инактивированная предварительным нагреванием до 56° C в течение 15 минут (см. выше) в пробирке с маркировкой H. S.

3. Комплемент. Свежая сыворотка морской свинки в пробирке с маркировкой C.

Убейте нормальную морскую свинку парами хлороформа.

Вскройте грудную клетку со всеми асептическими мерами предосторожности и соберите как можно больше крови из сердца с помощью стерильной пипетки Пастера.

Перенесите ее в стерильную центрифужную пробирку и поместите пробирку в термостат при 37° C. Два часа спустя отделите сгусток от стенок пробирки и тщательно отцентрифугируйте.

Пипеткой отберите прозрачную сыворотку в чистую стерилизованную пробирку.

4. Эритроцитарный раствор, в пробирке с маркировкой E.

Соберите и отмойте человеческие эритроциты (см. стр. 388, 1–8). Измерьте объем доступных эритроцитов и приготовьте 2-процентную суспензию в нормальном физиологическом растворе.

Метод. —

1. Возьмите две пробирки, пронумеруйте их 1 и 2 и внесите пипеткой в каждую по 9 куб. см нормального физиологического раствора.

2. Добавьте 1 куб. см гемолитической кроличьей сыворотки в пробирку № 1 и тщательно перемешайте: наберите 1 куб. см смеси и добавьте его в пробирку № 2; тщательно перемешайте.

3. Установите десять маленьких пробирок в штатив для пробирок или в рулон пластилина и пронумеруйте от 1 до 10.

4. Pipette into tube No. 1 0.5 c.c. = 0.5 c.c. hæmolytic serum} From tube H. S. Pipette into tube No. 2 0.1 c.c. = 0.1 c.c. hæmolytic serum} Pipette into tube No. 3 0.5 c.c. = 0.05 c.c. hæmolytic serum} From tube 1. Pipette into tube No. 4 0.3 c.c. = 0.03 c.c. hæmolytic serum} Pipette into tube No. 5 0.2 c.c. = 0.02 c.c. hæmolytic serum} pipette into tube No. 6 0.1 c.c. = 0.01 c.c. hæmolytic serum}

Pipette into tube No. 7 0.5 c.c. = 0.005 c.c. hæmolytic serum} From tube 2. Pipette into tube No. 8 0.3 c.c. = 0.003 c.c. hæmolytic serum} Pipette into tube No. 9 0.2 c.c. = 0.002 c.c. hæmolytic serum} Pipette into tube No. 10 0.1 c.c. = 0.001 c.c. hæmolytic serum}

5. В каждую пробирку добавьте 1 куб. см эритроцитарного раствора.

6. При необходимости (то есть в пробирках 2, 4, 5, 6, 8, 9 и 10) добавьте нормальный физиологический раствор к смеси в пробирках, пока столбик жидкости в каждой не достигнет одного и того же уровня.

7. Встряхните каждую пробирку по очереди, чтобы тщательно перемешать ее содержимое. Закройте горлышко каждой пробирки ватой и поместите весь набор в термостат при 37° C на один час.

8. Выньте пробирки из термостата и в каждую пробирку внесите пипеткой 0,1 куб. см комплемента (сыворотки морской свинки) и верните пробирки в термостат при 37° C на дополнительный период в один час.

9. Выньте пробирки из термостата, и если полный гемолиз не произошел в каждой пробирке, отставьте в сторону, желательно в ледяной шкаф, на час.

10. Затем осмотрите пробирки.

Полный гемолиз обозначается прозрачным красным раствором без осадка эритроцитов на дне пробирки.

Отсутствие гемолиза обозначается прозрачной или мутной бесцветной жидкостью с осадком эритроцитов на дне пробирок.

Наименьшее количество гемолитической сыворотки, вызвавшее полный гемолиз, известно как минимальная гемолитическая доза (М. Г. Д.), и если гемолиз произошел во всех пробирках до № 7, то м. г. д. этой конкретной сыворотки составляет 0,005 куб. см = 200 минимальных гемолитических доз на кубический сантиметр. Такая сыворотка достаточно сильна для экспериментальной работы; действительно, для многих целей полный гемолиз до пробирки 6 будет указывать на сыворотку достаточной силы (= 100 м. г. д. на кубический сантиметр). Если, однако, полностью гемолизированы только первые одна или две пробирки, это является показателем того, что кролик должен получить дополнительные инъекции, чтобы повысить гемолитическую силу до достаточно высокого уровня.

ХРАНЕНИЕ ГЕМОЛИЗИНА.

Если и когда содержание гемолизина в сыворотке кролика окажется достаточным, умертвите животное парами хлороформа.

Удалите как можно больше крови из сердца при соблюдении асептических мер предосторожности в стерилизованные центрифужные пробирки.

Перенесите пробирки с кровью в термостат при 37° C на два часа — затем тщательно отцентрифугируйте.

Пипеткой отберите прозрачную сыворотку и разлейте ее количествами по 1 куб. см в маленькие стеклянные ампулы или пипетки и герметично запаяйте в пламени горелки, стараясь избежать подгорания сыворотки.

Поместите ампулы, когда они наполнены сывороткой и запаяны, на водяную баню при 56° C на 30 минут. Это разрушает комплемент, т. е. инактивирует сыворотку, и в то же время, при условии, что различные операции проводились при соблюдении асептических мер предосторожности, обеспечивает ее стерильность. Более длительное воздействие снижает гемолитическую силу.

Поместите ампулы в закрытую металлическую коробку и храните в ледяном шкафу для будущего использования.

СНОСКИ:

[10] Приведенные здесь количества не являются абсолютно точными. Если важна точность, студент должен рассчитать необходимое количество с помощью Формулы процентов, Приложение, стр. 496.

[11] См. Формулу процентов, Приложение, стр. 496.

XVII. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ИНОКУЛЯЦИЯ ЖИВОТНЫХ.

Использование живых животных для экспериментов по инокуляции может стать необходимой процедурой в бактериологической лаборатории по одной или нескольким из следующих причин:

А. Определение патогенетических свойств бактерий, уже выделенных в чистую культуру (см. стр. 315).

Точное изучение условий, влияющих на вирулентность (включая ее поддержание, экзальтацию и аттенуацию) микроорганизма, и точные наблюдения за патогенными эффектами, вызванными его проникновением в ткани организма и размножением в них, очевидно, могут быть проведены только с помощью экспериментальной инокуляции; в то время как многие вопросы, касающиеся жизнеспособности, долголетия и т. д., могут быть наиболее легко прояснены с помощью таких экспериментов.

Б. Выделение патогенных бактерий.

Некоторые высокопаразитарные бактерии (которые с трудом растут на искусственных средах лаборатории) могут быть выделены с большим трудом из ассоциированных сапрофитных бактерий, когда используются только культуральные методы; но если смесь паразита и сапрофитов вводится животному, восприимчивому к действию первого, патогенный микроорганизм может быть легко выделен из тканей инфицированного животного. Пневмококк, например, встречается в мокроте пациентов, страдающих острым лобарным воспалением легких, но обычно в ассоциации с различными сапрофитами, происходящими из полости рта и глотки. Оптимальная среда для роста пневмококка, кровяной агар, также является отличным питательным субстратом для сапрофитов полости рта, и чашечные культуры быстро зарастают ими, что приводит к гибели более нежного пневмококка. Но инокулируйте часть мокроты под кожу мыши, и через три или четыре дня пневмококк попадет в кровоток (оставив сапрофиты в месте инокуляции) и убьет животное. Культуры, сделанные при вскрытии (см. стр. 398) из крови сердца мыши, дадут чистый рост пневмококка.

В. Идентификация патогенных бактерий.

Сходства, морфологические и культуральные, существующие между некоторыми патогенными бактериями, в некоторых случаях настолько велики, что полностью подавляют различия; опять же, одна и та же бактерия может при различных условиях принимать вид, настолько отличающийся от тех, что считаются типичными или нормальными, что вызывает сомнения в ее идентичности. В каждом случае простой эксперимент по инокуляции может сразу решить этот вопрос. В качестве конкретного примера можно привести вскрытие животного, умершего от неизвестной инфекции. Культуры из крови сердца дали чистый рост типичного (капсулированного) пневмококка. Культуры из печени дали чистый рост того, что казалось типичным (некапсулированным) Streptococcus pyogenes longus. Последний, инокулированный кролику, вызвал смерть животного от пневмококкового сепсиса, а культуры из крови кролика дали чистый рост типичного (капсулированного) пневмококка.

Г. Изучение проблем иммунитета.

Только путем тщательного и детального изучения поведения животной клетки и жидкостей организма по отношению к инфицирующей бактерии становится возможным пролить свет на сложную проблему, посредством которой клетка противопоставляет успешное сопротивление диффузии вторгающегося микроба или преуспевает в изгнании микроба после возникновения этой диффузии.

В данный момент, однако, наше внимание направлено на первый из этих широких заголовков, ибо именно применением знаний, приобретенных в его преследовании, мы способны справляться с проблемами, возникающими в рамках любого из остальных.

Для какой бы цели ни проводилась инокуляция, важно, чтобы эксперимент был спланирован так, чтобы обеспечить максимальное количество информации и минимум дискомфорта для используемого животного. Поэтому необходимо проявлять всяческую осторожность, чтобы гарантировать, что вирус вводится точно в выбранную ткань или орган; и сама операция должна выполняться с мастерством и быстротой, и в строго асептических условиях.

В ходе исследований инокуляции будет встречено много случаев естественного иммунитета, как расового, так и индивидуального; но следует помнить, что естественный иммунитет является лишь относительным и никогда не бывает абсолютным, и следует проявлять осторожность, чтобы не маркировать микроорганизм как непатогенный, пока не будет выполнено много различных методов инокуляции на различных видах животных, в сочетании при необходимости с различными процедурами, рассчитанными на преодоление любого кажущегося иммунитета, и они неизменно давали отрицательные результаты.

В некоторых странах эксперименты на животных разрешены только по прямой лицензии правительства и только в помещениях, специально лицензированных для этой цели. В Англии эта лицензия выдается министром внутренних дел и дает разрешение на эксперименты на животных под общей анестезией при условии, что после завершения эксперимента животное должно быть умерщвлено до того, как придет в сознание. Если предполагается проведение простых подкожных инокуляций и поверхностных венесекций, необходимо получить Сертификат А, предоставляющий это конкретное разрешение и освобождающий от необходимости общей анестезии, в дополнение к лицензии; в то время как если инокуляция влечет за собой более обширные оперативные процедуры и необходимо наблюдать за последующим течением инфекции, если таковая возникнет, лицензия должна быть дополнена Сертификатом B — поскольку этот сертификат снимает обязательство умерщвлять животное, пока оно находится под анестезией. Дальнейшие специальные сертификаты и комбинации сертификатов требуются, если объектами эксперимента должны быть кошки, собаки, лошади, ослы или крупный рогатый скот. По каждому сертификату прямо оговорено, что если животное проявляет признаки боли, оно должно быть немедленно умерщвлено.

Животные, обычно используемые при изучении патогенных свойств различных микроорганизмов, — это:

Cold Blooded.Warm Blooded.Hot Blooded. Frog.Mouse.Fowl. Toad.Rat.Pigeon. Lizard.Guinea pig. Rabbit. Monkey.

Подготовка. — Перед инокуляцией подопытных животных следует тщательно осмотреть, чтобы избежать риска использования уже больных: поскольку следует помнить, что в естественном состоянии, так же как и в неволе, животные, используемые для лабораторных инокуляций, подвержены инфекции различными животными и растительными паразитами, и в некоторых случаях такая инфекция не проявляет симптомов, очевидных при случайном осмотре; следует отметить пол, записать вес и измерить ректальную температуру. Остальными важными пунктами являются время инокуляции, материал, который инокулируется, метод инокуляции и, наконец, под чьим руководством проводится эксперимент. В лаборатории автора эти данные заносятся на розовую карточку, которая является частью картотечной системы. Карточка также предоставляет место для заметок о ходе результирующей инфекции и содержит на обороте график веса и температуры (Рис. 164 и 165).