«Основы бактериологической техники»

Пробирочные культуры обычно помещают в инкубатор в небольших жестяных цилиндрах, подобных тем, в которых продаются американские сигареты, или в квадратных жестяных коробках. Для той же цели можно использовать стаканы или бокалы, но они хрупкие и поэтому менее удобны. Металлические штативы для пробирок, достаточно длинные, чтобы поместиться внутри инкубатора, и вмещающие по два ряда пробирок каждый, также чрезвычайно полезны.

АЭРОБНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ.

Приготовление пробирочных культур.

Приготовление пробирочной культуры состоит из:

(a) Инокуляции пробирки со стерильной питательной средой порцией исследуемого материала.

(b) Инкубации инокулированной пробирки при подходящей температуре.

Детали первого из этих процессов должны несколько варьироваться в зависимости от того, инокулируются ли пробирки с питательными средами или «засеваются» из —

1. Существующих культур.

2. Ранее собранного патологического материала (см. стр. 373).

3. Жидкостей, тканей и т. д. или непосредственно из организма животного.

Метод приготовления пробирочных культур из существующих культур следующий:

Fig. 117.—Inoculating tubes, seen from the front.

1. Жидкие среды (например, питательный бульон). —

1. Прокалите ватную пробку пробирки, содержащей культуру, а также пробку пробирки со стерильным бульоном.

2. Удерживайте обе пробирки рядом между большим пальцем и указательным и безымянным пальцами левой руки, позволяя закрытым концам опираться на тыльную сторону кисти, и разделяя горлышки пробирок (направленные вправо) кончиком среднего пальца. Держите пробирки как можно более горизонтально, не допуская, чтобы жидкость в бульонной пробирке коснулась ватной пробки (рис. 117).

3. Стерилизуйте платиновую петлю и дайте ей остыть. [8]

4. Захватите пробку пробирки с культурой мизинцем и ладонью и извлеките ее из пробирки.

5. Захватите пробку бульонной пробирки безымянным пальцем и основанием большого пальца и извлеките ее из пробирки.

6. Введите платиновую петлю в пробирку с культурой — не позволяйте петле касаться стенок пробирки, а держателю — касаться среды — и возьмите небольшую порцию роста; извлеките петлю из пробирки, удерживая инфицированную сторону петли обращенной вниз.

7. Введите петлю в бульонную пробирку почти до уровня жидкости, переверните петлю так, чтобы инфицированная сторона была обращена вверх, и эмульгируйте порцию роста во влаге, прилипшей к стенке пробирки, которая находится сверху. Извлеките петлю.

8. Снова закройте обе пробирки пробками.

9. Стерилизуйте платиновую петлю.

10. Наклейте на бульонную пробирку этикетку с указанием (a) названия организма и (b) даты инокуляции.

11. Инкубируйте.

2. Твердые среды. — Твердые среды хранятся в пробирках одним из двух способов:

1. Скошенная пробирка (рис. 118), в которой среде дали застыть, пока пробирка находилась в наклонном положении, образуя обширную поверхность среды, простирающуюся от дна пробирки почти до ее горлышка.

Этот метод используется для «штриховых» культур (Strichcultur).

2. Прямая пробирка (рис. 119), в которой среда образует цилиндрическую массу в нижней части пробирки и имеет верхнюю поверхность, расположенную под прямым углом к длинной оси пробирки.

Этот метод используется для «укольных» культур (Stichcultur) или, путем инокуляции среды в жидком состоянии и последующего застывания в этом положении, для «трясущихся» культур.

Штриховая культура. —

1. Прокалите пробки, стерилизуйте платиновую петлю (или шпатель). Откройте пробирки и наберите инокулят, как при предыдущей инокуляции.

2. Введите инфицированную петлю до дна пробирки, которую нужно инокулировать, и проведите ею как можно легче вдоль центра поверхности среды, заканчивая «штрих» над тонким слоем среды возле горлышка пробирки.

3. Снова закройте пробирки пробками, стерилизуйте платиновую петлю.

4. Наклейте этикетку на свежеинокулированную пробирку и инкубируйте.

Культура мазком. — Действуйте в целом так же, как при штриховой культуре, но распределите инфицированную петлю по всей поверхности среды, вместо того чтобы ограничивать инокуляцию узкой линией.

Примечание. — Желатиновые и агаровые скошенные пробирки следует «скашивать» непосредственно перед использованием.

Укольная культура. —

1. Прокалите пробки, откройте пробирки, стерилизуйте платиновую иглу и зарядите ее инокулятом, как в предыдущих культурах.

2. Введите платиновую иглу в пробирку, которую нужно инокулировать, пока она не коснется центра поверхности среды. Теперь глубоко введите ее в толщу среды, стараясь держать иглу как можно ближе к оси цилиндра среды. Затем извлеките иглу.

3. Снова закройте пробирки пробками. Стерилизуйте платиновую иглу.

4. Наклейте этикетку на свежезасеянную пробирку и инкубируйте.

Примечание. — Когда желатин хранится некоторое время, верхняя поверхность цилиндра становится вогнутой из-за испарения. Пробирки с таким видом следует расплавить и снова дать им застыть перед использованием для укольной культуры, иначе при введении иглы в среду поверхностное натяжение приведет к раскалыванию желатинового цилиндра.

Fig. 118.—Sloped or slanted medium for streak or smear culture.

Fig. 119.—Straight tube.

Трясущаяся культура. —

1. Расплавьте пробирку с питательным желатином (или агаром, или другой подобной средой) путем нагревания на водяной бане (рис. 121).

2. Инокулируйте расплавленную среду и наклейте этикетку и т. д. точно так же, как при работе с пробиркой бульона.

3. Поместите свежезасеянную пробирку в вертикальное положение (например, в штатив для пробирок) и дайте ей застыть.

4. Наклейте этикетку на пробирку; когда среда застынет, инкубируйте.

Культивирование методом вращения по Эсмарху. —

1. Расплавьте три пробирки с желатином путем нагревания.

2. Приготовьте три разведения инокулята (как описано для пластинчатых культур, стр. 228, шаги 4–7).

3. Вращайте пробирки, удерживая их почти горизонтально, в желобке, сделанном в блоке льда, пока желатин не застынет тонкой пленкой на внутренней поверхности пробирки (рис. 120); или под струей холодной воды из-под крана.

Fig. 120. Esmarch's roll culture on block of ice.

Чтобы среда прочно прилипала к стеклу, в агар, используемый для культивирования методом вращения, перед стерилизацией следует добавить 1% желатина или 1% гуммиарабика.

Культуры методом вращения, которые служили важнейшей цели во времена до введения чашек Петри для пластинчатых культур, в современных лабораториях устарели и упоминаются лишь для пользы студентов, поскольку экзаменаторы, интересующиеся академическими и историческими аспектами бактериологии, иногда ожидают, что кандидаты будут знакомы с методом их приготовления.

Приготовление пластинчатых культур.

Если небольшое количество бактерий суспендировано в расплавленном желатине, агаре или другой подобной среде, и инфицированная среда распределена ровным слоем по плоской поверхности и оставлена для застывания, каждый отдельный микроорганизм фиксируется в определенной точке, и его дальнейшее развитие ограничивается окрестностями этой точки. Через некоторое время рост этого организма становится видимым невооруженным глазом как «колония». Это принцип, на котором основан метод пластинчатого культивирования, и его применение позволяет бактериологу изучать особый способ развития, характерный для каждого вида микробов при росте (a) беспрепятственно на поверхности среды, (b) в глубине среды. Сам метод заключается в следующем:

Необходимое оборудование. —

1. Штатив-тренога для выравнивания.

2. Большая мелкая стеклянная чашка с квадратным листом листового стекла для накрывания.

3. Ватерпас (уровень).

4. Набор стерильных чашек Петри.

5. Пробирки со стерильными питательными средами, желатином (или агаром), предварительно расплавленными путем нагревания на водяной бане и охлажденными до 42°C, иначе тепло среды уничтожит многие, если не все, внесенные бактерии.

6. Пробирка с культурой для посева.

7. Платиновая петля.

8. Бунзеновская горелка.

9. Стеклограф (карандаш по стеклу).

Fig. 121.—Handy form of water-bath for melting tubes of agar and gelatine previous to slanting them; or to making shake cultures or pouring plates.

Метод «заливки» пластин. —

1. Поместите стеклянную чашку на выравнивающую треногу (рис. 122, 123); если нужно залить желатиновые пластины, наполните чашку ледяной водой — желатин застывает так медленно, что необходимо ускорить процесс; если используется агар, наполните водой при 50°C — агар застывает почти мгновенно при комнатной температуре, и небольшое замедление процесса позволяет избежать комковатости; накройте чашку квадратным листом стекла.

2. Поместите ватерпас на лист стекла и с помощью выравнивающих винтов установите поверхность стекла горизонтально.

Это выравнивание является важным делом, поскольку развитие колонии в некоторой степени пропорционально запасу питательной среды, доступной для ее питания. Так, в «мазке» на скошенной пробирке колонии в верхней части среды stunted и малы, но увеличиваются в размере и пышности роста по мере приближения к дну пробирки, где находится наибольшая толщина среды.

Fig. 122.—Plate-levelling stand.

3. Поместите три стерильные чашки Петри в ряд на поверхность стеклянной пластины и пронумеруйте их 1, 2 и 3 слева направо.

Fig. 123.—Plate-levelling stand, side view.

4. Пронумеруйте предварительно расплавленные пробирки с питательными средами 1, 2 и 3. Прокалите пробки и убедитесь, что каждая пробка легко извлекается из горлышка своей пробирки.

5. Добавьте одну петлю инокулята в пробирку № 1, обращаясь с расплавленной средой как с бульоном. После того как снова закроете пробкой, захватите пробирку возле горлышка большим и указательным пальцами правой руки и равномерным круговым движением всей руки распределите инокулят по всей среде; избегайте резких движений, так как они вызывают образование пузырьков воздуха в среде.

Fig. 124.—Mixing emulsion for plates.

Искусство равномерного перемешивания без образования пузырьков воздуха не всегда легко дается этим методом. Альтернативный план — держать инокулированную пробирку вертикально между сложенными ладонями и вращать ее между ними быстрыми движениями обеих рук вперед и назад (рис. 124).

Fig. 125.—Pouring plates.

6. Стерилизуйте платиновую петлю, добавьте две петли разбавленного инокулята в пробирку № 2 и перемешайте, как прежде.

7. Подобным образом перенесите три петли расплавленной среды из пробирки № 2 в пробирку № 3 и тщательно перемешайте.

8. Прокалите пробку пробирки № 1, извлеките ее, затем прокалите края пробирки; слегка приподнимите крышку чашки Петри № 1, введите горлышко пробирки; затем, приподнимая дно пробирки, вылейте расплавленную среду в чашку Петри, чтобы образовался тонкий слой. Извлеките горлышко пробирки и закройте «пластину». Если среда не растеклась ровно по дну чашки, приподнимите чашку с выравнивающей платформы и, наклоняя в разных направлениях, исправьте ошибку.

9. Залейте пластины № 2 и № 3 подобным образом из пробирок № 2 и № 3.

10. Наклейте на пластины этикетки с отличительным названием или номером инокулята, а также датой; номер разведения должен быть указан заранее (шаг 3).

11. Поместите в холодный инкубатор на три или более дней, по мере необходимости.

Таким образом можно получить колонии, совершенно чистые и отделенные друг от друга.

На пластине № 1, вероятно, колонии будут настолько многочисленны и скученны, а следовательно, настолько малы, что это сделает ее бесполезной. На пластине № 2 они будут более широко разделены, но обычно пластина № 3 резервируется для тщательного изучения, так как на ней колонии обычно широко разделены, немногочисленны и велики по размеру.

Агаровые пластины заливаются подобным образом, но агар должен быть расплавлен в кипящей воде, а затем охлажден до 45°C или 42°C на тщательно отрегулированной водяной бане перед инокуляцией, и весь процесс должен выполняться очень быстро, иначе агар застынет до завершения операции.

Примечание. — При заливке пластин, поскольку пробирка № 1 (для первого разведения) редко дает пластину, имеющую какую-либо практическую ценность, ее часто заменяют пробиркой с бульоном или стерильным солевым раствором, и в таком случае пластина № 1 не заливается.

Поверхностные пластины. —

Этот метод заливки так называемых «цельных» пластин (поскольку колонии могут появляться как на поверхности, так и в глубине среды) необходим для точного изучения формирования колоний при различных условиях, но когда основной целью разделения бактерий является получение субкультур из ряда отдельных бактерий, необходимо готовить «поверхностные» пластины, так как здесь формирование колоний ограничено поверхностью среды. Используемый метод немного варьируется в зависимости от того, является ли используемая среда желатином или агаром, или одним из производных или вариантов последнего.

(a) Желатиновые поверхностные пластины. —

1. Расплавьте три пробирки с питательным желатином.

2. Вылейте содержимое каждой пробирки в отдельную чашку Петри и дайте застыть. Затем переверните каждую пластину и ее крышку вверх дном.

Fig. 126.—Surface plate spreader.

3. Когда они полностью остынут, приподнимите дно пластины 1, переверните ее и нанесите каплю инокулята (будь то жидкая культура или эмульсия из твердой культуры) на поверхность желатина платиновой петлей — близко к одной стороне пластины; верните нижнюю половину чашки Петри в ее крышку.

4. Возьмите кусок тонкой стеклянной палочки, толстой платиновой проволоки или, что лучше всего, кусок алюминиевой проволоки (скажем, 2 мм в диаметре) длиной около 28 см. Согните конечные 4 см под прямым углом к остальной части, сделав L-образную палочку (рис. 126). Стерилизуйте короткое плечо и прилегающую часть длинного плеча в пламени Бунзена и дайте остыть.

5. Теперь приподнимите дно чашки Петри левой рукой, оставив крышку на лабораторном столе, и, удерживая ее вертикально, размажьте каплю инокулята по всей поверхности желатина коротким плечом распределителя вращательным движением (рис. 127). Верните чашку в крышку.

6. Приподнимите дно пластины 2 и разотрите инфицированный распределитель по всей поверхности желатина — затем продолжайте подобным образом для третьей пластины в серии.

7. Стерилизуйте распределитель.

8. Наклейте этикетки и инкубируйте пластины.

Fig. 127.—Spreading surface plate.

После инкубации пластина № 1, вероятно, даст огромное количество колоний; пластина 2 покажет меньше колоний, так как на ее поверхность будут нанесены только те бактерии, которые прилипли к палочке после растирания по пластине 1, и к тому времени, когда палочка достигнет пластины 3, на ней должно остаться очень мало организмов. Так что третья пластина, как правило, покажет лишь очень немногие разбросанные колонии, в высшей степени подходящие для детального изучения.

(b) Агаровые поверхностные пластины. —

1. Расплавьте три пробирки с питательным агаром — нутрозным агаром или подобным.

2. Вылейте содержимое каждой пробирки в отдельную чашку Петри и дайте застыть.

3. Когда они полностью застынут, переверните каждую чашку, приподнимите нижнюю половину и установите ее наклонно на перевернутую крышку (рис. 128) и поместите в таком положении в инкубатор при 60°C на сорок пять минут (или в инкубатор при 42°C на два часа). Это испаряет конденсат и придает среде твердую, сухую поверхность.

4. После извлечения пластин из инкубатора закройте каждую чашку и поместите ее — все еще вверх дном — на лабораторный стол.

Fig. 128.—Drying surface plate of agar.

5. Инокулируйте пластины сериями по три, как описано для желатиновых поверхностных пластин 3–8.

Культивирование в висячей капле.

Apparatus Required.—

Hanging-drop slides.

Cover-slips.

Section rack (Fig. 75).

Blotting paper.

Bell glass to cover slides.

Original culture.

Tubes of broth, or liquefied gelatine or agar.

Forceps.

Platinum loop.

Bunsen burner.

Grease pencil.

Sterile vaseline.

Lysol.

(a) Жидкие среды. —

1. Приготовьте первое и второе разведения инокулята, как указано для пластинчатых культур (см. стр. 228–229, разделы 4–6), заменив пробирки с расплавленным желатином пробирками с питательным бульоном.

2. Стерилизуйте предметное стекло для висячей капли, тщательно промыв его в воде и высушив, затем погрузив в стакан с абсолютным спиртом, слив большую часть спирта, захватив стекло пинцетом и выжечь остатки спирта в пламени.

3. Поместите предметное стекло для висячей капли на кусок промокательной бумаги, смоченной 2% раствором лизола, и накройте его небольшим стеклянным колпаком, который был ополоснут тем же раствором и не высушен.

4. Слегка приподнимите колпак и смажьте стерильным вазелином края металлической ячейки с помощью стерильного шпателя из толстой платиновой проволоки.

5. Извлеките чистое покровное стекло из спиртовки стерильным пинцетом и выжгите спирт; снова приподнимите колпак и поместите стерильное покровное стекло на промокательную бумагу рядом с предметным стеклом для висячей капли.

6. Возьмите каплю бульона из пробирки второго разведения большой платиновой петлей; приподнимите колпак и нанесите каплю в центр покровного стекла. Стерилизуйте петлю.

7. Приподнимите колпак настолько, чтобы можно было захватить покровное стекло пинцетом, перевернуть его и установить над ячейкой предметного стекла для висячей капли. Полностью снимите колпак и плотно прижмите покровное стекло к ячейке.

8. Либо инкубируйте и исследуйте через определенные промежутки времени, либо наблюдайте непрерывно под микроскопом, используя при необходимости подогреваемый столик (рис. 53).

(b) Твердые среды. — Соблюдая точно такую же технику, несколько капель расплавленного желатина или агара из пробирки второго разведения можно распределить по поверхности стерильного покровного стекла и тем самым приготовить пластинчатую культуру в висячей капле.

Этот метод чрезвычайно полезен при изучении дрожжей, когда круглую ячейку на предметном стекле для висячей капли следует заменить прямоугольной ячейкой размером около 38 на 19 мм, а желатин распределить по покровному стеклу аналогичного размера. После герметизации препарата верхнюю поверхность покровного стекла можно расчертить на квадраты с помощью стеклографа или алмазного карандаша и пронумеровать, чтобы облегчить последующую идентификацию колоний, которые, как наблюдается, развиваются из одиночных микробов.

Культура в висячем блоке (Хилл). —

Необходимое оборудование: Как для культивирования в висячей капле, с добавлением скальпеля.

Выполняйте метод насколько возможно под прикрытием колпака, чтобы избежать загрязнения из воздуха.

1. Расплавьте пробирку с питательным агаром (или желатином) и вылейте в чашку Петри слоем около 4 мм и дайте застыть.

2. Острым скальпелем вырежьте блок размером около 8 мм из всей толщины агарового слоя.

3. Поднимите агаровый блок на лезвии скальпеля и перенесите его нижней стороной вниз в центр стерильного предметного стекла.

4. Распределите каплю жидкой культуры (или эмульсии роста с твердой среды) по верхней поверхности агарового блока, как если бы делали мазок на покровном стекле.

5. Поместите предметное стекло с блоком, накрытое колпаком, в инкубатор при 37°C на десять минут для легкого подсушивания.

6. Возьмите чистое сухое стерильное покровное стекло пинцетом и с помощью второго пинцета осторожно опустите его на инокулированную поверхность агара (избегая пузырьков воздуха), так чтобы остался чистый край покровного стекла, перекрывающий агаровый блок.

7. Переверните препарат и лезвием скальпеля отделите предметное стекло от агарового блока.

8. Платиновой петлей нанесите каплю или две расплавленного агара вокруг краев блока. Он сразу застывает и герметизирует блок на покровном стекле.

9. Подготовьте стерильное предметное стекло для висячей капли и смажьте края металлической ячейки твердым вазелином или расплавленным белым воском.

10. Переверните покровное стекло с прикрепленным блоком на предметное стекло для висячей капли и плотно загерметизируйте покровное стекло на месте.

11. Наблюдайте, как при культивировании в висячей капле.

АНАЭРОБНЫЕ КУЛЬТУРЫ.

Было разработано множество методов культивирования анаэробных бактерий, большинство из которых требуют использования специального оборудования. Принцип, на котором основан любой метод и от которого зависит его успех, подпадает под один из следующих заголовков:

(a) Исключение воздуха из культуры.

(b) Удаление воздуха из сосуда, содержащего культуру, с помощью воздушного насоса — т. е. культивирование в вакууме.

(c) Поглощение кислорода из воздуха, контактирующего с культурой, с помощью пирогалловой кислоты, подщелоченной каустической содой — т. е. культивирование в атмосфере азота.

(d) Вытеснение воздуха инертным газом, таким как водород или светильный газ — т. е. культивирование в атмосфере водорода.

(e) Комбинация двух или более из вышеперечисленных методов.

Здесь приведена подборка наиболее простых и наиболее общеприменимых методов.

Всякий раз, когда это возможно, питательные среды, используемые в любом из процессов, должны содержать какое-либо легко окисляющееся вещество, такое как формиат натрия (0,4%) или сульфиндиготат натрия (0,1%), которые поглотят весь доступный кислород, удерживаемый в растворе средой. Дополнительное добавление глюкозы (2%) способствует росту анаэробных бактерий (см. стр. 189–190).

Кроме того, рекомендуется герметизировать все соединения между резиновыми пробками и тубусами или горлышками пробирок расплавленным парафином; стеклянные пробки и краны следует смазывать смоляной мазью или смесью из 1 части пчелиного воска и 4 частей оливкового масла.

(A) Метод I (Метод Гессе). —

1. Сделайте укольную культуру в желатине или агаре, выбрав для этой цели прямую пробирку, содержащую глубокий столбик среды, и вводя инокулирующую иглу до дна пробирки.

2. Pour a layer of sterilised oil (olive oil, vaseline, or petroleum), 1 or 2 cm. deep, upon the surface of the medium.

3. Инкубируйте.

Метод II. — Этот метод доступен только при работе с чистыми культурами.

1. Расплавьте пробирку с желатином (или агаром) путем нагревания, вылейте ее в чашку Петри и дайте застыть.

2. Инокулируйте поверхность среды только в одном месте.

3. Извлеките покровное стекло из сосуда с абсолютным спиртом стерильным пинцетом; выжгите спирт в газовом пламени.

4. Осторожно опустите теперь стерильное покровное стекло на инокулированную поверхность среды, тщательно исключая пузырьки воздуха, и плотно прижмите его кончиками пинцета. (Стерильный диск из слюды можно заменить покровным стеклом.)

5. Инкубируйте.

Метод III (Физический метод Ру). —

1. Подготовьте пробирочные культуры жидких сред (или твердых сред, переведенных в жидкое состояние нагреванием) обычным способом.

2. Аспирируйте часть инокулированных сред в капиллярные пипетки.

3. Запаяйте оба конца каждой пипетки в пламени горелки.

4. Инкубируйте.

Метод IV (Биологический метод Ру). —

1. Сделайте глубокий укол, как в методе I.

2. Налейте слой бульонной культуры энергичного аэроба — например, B. aquatilis sulcatus или B. prodigiosus — глубиной 1 или 2 см на поверхность среды; или такой же слой расплавленного желатина, который затем инокулируется аэробным организмом.

3. Инкубируйте.

Рост аэроба поглотит весь кислород, который до него доходит, и не позволит ему проникнуть к среде внизу, которая, следовательно, останется в анаэробном состоянии.

(B) Метод V. —

1. Подготовьте пробирочные или колбовые культуры обычным способом.

2. Замените ватную пробку резиновой пробкой с одним отверстием, в которое вставлен отрезок стеклянной трубки, имеющий сужение примерно на 3 см выше пробки и затем согнутый под прямым углом (рис. 129). Пробку и стеклянную трубку стерилизуют кипячением в стакане с водой в течение пяти минут.

Fig. 129.—Vacuum culture.

3. Соедините трубку, идущую от культурального сосуда, с водяным или воздушным насосом, поместив между ними склянку Вульфа, оборудованную как промывная склянка и содержащую серную кислоту.

4. Откачайте воздух из культурального сосуда.

5. Перед отсоединением аппарата запаяйте стеклянную трубку от культурального сосуда в месте сужения, используя пламя горелки.

6. Инкубируйте.

(C) Метод VI (Метод Бухнера).

Необходимое оборудование и растворы. —

Трубка Бухнера (толстостенная стеклянная пробирка длиной 23 см и диаметром 4 см, снабженная резиновой пробкой, рис. 130).

Пирогалловая кислота в спрессованных таблетках, каждая весом 1 грамм.

Деканормальный раствор каустической соды.

Метод. —

1. Подготовьте пробирочную культуру обычным способом.

2. Смочите резиновую пробку трубки Бухнера водой и убедитесь, что она точно подходит к горлышку трубки.

3. Снимите пробку с бутыли с каустической содой.

4. Бросьте одну из таблеток пирогалловой кислоты [9] в трубку Бухнера (грубо говоря, используйте 1 грамм пирогалловой кислоты на каждые 100 см³ воздушной емкости приемного сосуда).

5. Добавьте около 1 см³ раствора соды.

6. Поместите инокулированную пробирку внутрь трубки Бухнера. Таблетка пирогалловой кислоты действует как буфер и предотвращает повреждение как инокулированной пробирки, так и трубки Бухнера, даже если ее вставили поспешно.

7. Плотно вставьте резиновую пробку в горлышко трубки Бухнера.

Fig. 130.—Buchner's tube.

Таблетка пирогалловой кислоты медленно растворяется в растворе соды, и ее окисление поначалу протекает очень медленно, так что при использовании этого метода имеется достаточно времени.

8. Снова закройте бутыль с каустической содой.

9. Поместите трубку Бухнера в проволочную подставку и инкубируйте.

Метод VII (Метод Райта). —

1. Подготовьте пробирочную культуру обычным способом.

2. Отрежьте ножницами ту часть ватной пробки, которая выступает над горлышком пробирки, затем протолкните пробку внутрь пробирки на 2 или 3 см.

3. С помощью пипетки капните около 1 см³ 10% водного раствора пирогалловой кислоты на пробку. Она немедленно впитается ватой.

4. Другой пипеткой влейте такое же количество раствора каустической соды.

5. Быстро закройте горлышко пробирки плотно прилегающей резиновой пробкой.

6. Инкубируйте.

Fig. 131.—McLeod's anaerobic plate base with half petri dish inverted in situ

Метод VIII (Метод Маклеода). —

Необходимое оборудование и растворы. —

Основание для пластин Маклеода (полый глазурованный глиняный диск диаметром 9 см и глубиной 2 см: верхняя поверхность пронизана центральным отверстием диаметром 2 см, обеспечивающим доступ внутрь, нижняя часть которого разделена на две части низкой перегородкой. Неглубокий желобок опоясывает верхнюю поверхность возле края).

Plasticine.

Pyrogallic acid (1 gramme) compressed tablets.

Sodic hydroxide (0.4 gramme) compressed tablets.

Wash bottle of distilled water.

Surface plates of one or other agar medium (in petri dishes of 8 cm. diameter).

Surface plate spreader.

Метод. —

1. Раскатайте длинный цилиндр из пластилина и вставьте его в желобок на верхней поверхности глиняного основания.

2. Поместите таблетку пирогалловой кислоты в одно отделение внутри основания пластины, а две таблетки гидроксида натрия — в другое.

3. Подготовьте поверхностную пластинчатую культуру организма, который нужно культивировать.

4. Влейте несколько кубических сантиметров дистиллированной воды в то отделение основания пластины, которое содержит гидроксид натрия.

5. Переверните нижнюю половину поверхностной пластины над основанием пластины и плотно прижмите ее края к пластилину, заполняющему желобок.

6. Наклейте этикетку и инкубируйте.

(D) Метод IX. —

Необходимое оборудование. —

Small Ruffer's or Woodhead's flask (Fig. 33).

Sterile india-rubber stopper.

India-rubber tubing.

Glass tubing.

Metal screw clips.

Cylinder of compressed hydrogen; or hydrogen gas apparatus

Метод. —

1. Стерилизуйте стеклянный сосуд, имеющий форму колбы Руффера или Вудхеда, в сухожаровом шкафу. (Тубус и боковые трубки закрыты ватными пробками.) После стерилизации прикрепите короткий кусок резиновой трубки, перекрытый металлическим зажимом, к каждой боковой трубке.

2. Инокулируйте большое количество (например, 200 см³) питательной среды. Если используются твердые среды, их необходимо предварительно расплавить путем нагревания.

3. Удалите ватную пробку из тубуса и перелейте инокулированную среду в стеклянный сосуд.

4. Закройте тубус резиновой пробкой, предварительно стерилизованной кипячением в стакане с водой.

Fig. 132.—Kipp's hydrogen apparatus, (a) connected up to two washing bottles containing (b) lead acetate 10 per cent. solution, to remove H2S and (c) silver nitrate solution to remove AsH3. A third washing bottle containing pyrogallic acid 10 per cent. solution, rendered alkaline, to remove any trace of oxygen, is sometimes introduced.

Fig. 133.—Improved gas apparatus; the metal is contained in a perforated glass tube which is submerged in acid when the triangular bottle is upright (a), but is above the level of the liquid when the bottle is turned on its side (b).

5. Соедините резиновую трубку на одном из боковых отводов с баллоном со сжатым водородом (или с отводной трубкой аппарата Киппа, рис. 132, либо другим водородным аппаратом, рис. 133), вставив короткий отрезок стеклянной трубки; аналогичным образом подсоедините длинную резиновую трубку к противоположному боковому отводу, конец которой следует опустить в сосуд с водой.

6. Откройте оба металлических зажима и пропускайте водород через сосуд до тех пор, пока атмосферный воздух не будет вытеснен водородом. Это определяется путем сбора газа, выходящего пузырьками через воду в сосуде, в пробирку и проверки его с помощью зажженной лучины.

7. Закройте металлический зажим на трубке, через которую поступает газ; закройте зажим на выходной трубке.

8. Отсоедините газовый аппарат.

9. Поместите в термостат.

Метод X (Метод Боткина).—

Необходимое оборудование.—

Large glass dish 20 cm. diameter and 8 cm. deep. Flat leaden

cross slightly shorter than the internal diameter of the glass dish.

Bell glass about 15 cm. diameter and 20 to 25 cm. high.

Metal frame for plate cultivations.

Or, glass battery jar for tube cultivations.

Cylinder of compressed hydrogen.

Rubber tubing.

Two pieces of U-shaped glass tubing (each arm 8 cm. in length).

Half a litre of glycerine (or metallic mercury).

Метод.—

1. Поместите свинцовый крест внутрь стеклянной чашки, установив его на дно.

2. Подготовьте культуры обычным способом.

3. Поместите пробирки с культурами в стеклянную банку для элементов (или чашечные культуры на металлической подставке), установив их в центре свинцового креста.

4. Накройте культуры колоколом.

5. Установите U-образные стеклянные трубки в вертикальном положении с противоположных сторон колокола так, чтобы одно колено каждой трубки находилось внутри, а другое — снаружи. Эти трубки лучше всего фиксировать, погружая U-образные изгибы в два комка пластилина, прилепленных ко дну стеклянной чашки. Закрепите короткий отрезок резиновой трубки с металлическим зажимом на каждом из внешних колен (рис. 134).

6. Заполните стеклянную чашку глицерином или металлической ртутью до уровня около 5 см.

Fig. 134.—Botkin's apparatus.

7. Соедините одну U-образную трубку с баллоном с водородом (или газовым аппаратом) с помощью резиновой трубки. Вытесните атмосферный воздух водородом, как в методе IX.

8. Пережмите трубки зажимами и отсоедините газовый аппарат.

9. Поместите в термостат.

Метод XI (Метод Нови).—

Необходимое оборудование.—

Jar for plate cultivations (Fig. 135).

Or, jar for tube cultivations (Fig. 136).

Lubricant for stopper of jar.

Rubber tubing.

Cylinder of compressed hydrogen.

Метод.—

1. Подготовьте культуры обычным способом.

2. Поместите их внутрь банки.

3. Смажьте пробку и вставьте ее в горлышко банки так, чтобы ручка находилась на одной линии с двумя боковыми трубками.

4. Соедините отводную трубку «a» с источником водорода с помощью резиновой трубки.

Fig. 135.—Novy's jar for plate cultivations.

Fig. 136.—Novy's jar for tube cultivations.

5. Присоедините отрезок резиновой трубки к выходной трубке «b», собирайте пробы выходящего газа (над водой) и периодически проверяйте их.

6. Когда воздух будет полностью вытеснен водородом, поверните ручку пробки под прямым углом к линии входной и выходной трубок; это перекроет отверстия обеих трубок.

7. Отсоедините газовый аппарат и поместите в термостат.

(E) Метод XII (Метод Буллока).—

Необходимое оборудование.—

Bulloch's jar.

Pot of resin ointment.

Small glass dish 14 cm. diameter by 5 cm. deep.

Vessel for tube cultures or metal rack for plate cultures.

Pyrogallic acid tablets.

Cylinder of compressed hydrogen.

Geryk or other air pump.

Rubber pressure tubing.

10 c.c. pipette.

Glass tubing.

Dry granulated caustic soda or compressed tablets each, containing

0.4 grammes sodic hydroxide.

Small beaker of water.

Метод.—

1. Подготовьте культуры обычным способом.

2. Поместите стеклянную чашку в центр стеклянной пластины и установите культуры внутри нее.

3. Поместите достаточное количество таблеток пирогалловой кислоты с одной стороны стеклянной чашки (т. е. 1 таблетку на каждые 100 кубических сантиметров объема воздуха под колоколом). Поместите небольшую горку сухой гранулированной соды (или полдюжины таблеток гидроксида натрия) рядом с таблетками пирогаллола.

4. Смажьте фланец колокола смоляной мазью и плотно прижмите колокол к стеклянной пластине, накрыв культуры — так, чтобы длинная трубка проходила своим нижним концом в стеклянную чашку в точке, прямо противоположной таблеткам пирогалловой кислоты. Смажьте оба крана смоляной мазью (рис. 137).

5. Соедините короткую трубку «a» с источником газа с помощью резиновой вакуумной трубки и откройте оба крана.

6. Соедините длинную прямую стеклянную трубку с длинной трубкой «b» с помощью отрезка резиновой трубки, вставив винтовой зажим; периодически собирайте пробы выходящего газа и проверяйте их.

7. Когда воздух будет вытеснен, закройте кран входной трубки, затем кран выходной трубки «b». Затяните зажим, отсоедините стеклянную трубку от резинового соединения и подсоедините короткую трубку «a» к воздушному насосу с помощью вакуумной трубки.

8. Откройте кран трубки «a» и двумя-тремя качками воздушного насоса откачайте небольшое количество газа, создав небольшое разрежение. Затем закройте кран и отсоедините воздушный насос.

9. Наполните 10-кубовую пипетку с расширением водой; вставьте ее кончик в резиновую трубку на длинной трубке «b» до винтового зажима. Откройте винтовой зажим и впускайте воду до тех пор, пока она не остановится из-за внутреннего давления. Закройте кран. (Вода растворяет соду и пирогалловую кислоту, превращая последнюю в щелочной пирогаллол и тем самым активируя ее скрытую способность поглощать кислород).

Fig. 137.—Bulloch's jar.

10. Переверните трубки от тубусов так, чтобы они соединились в безопасном месте над верхушкой колокола; еще раз убедитесь, что все соединения герметичны, и перенесите аппарат в термостат.

Этот последний метод является наиболее удовлетворительным для анаэробных культур, так как с его помощью можно достичь полной анаэробиоза с наименьшими затратами времени и усилий.

СНОСКИ:

[8] См. также метод открывания и закрывания пробирок с культурами, стр. 74-76.

[9] Если невозможно получить спрессованные таблетки пирогалловой кислоты, приготовьте основной раствор «кислого пирогаллола»

Pyrogallic acid, 10 grammes

Hydrochloric acid, 1.5 c.c.

Distilled water, 100 c.c.

и на этапе 4 введите 10 см³ этого раствора.

XV. МЕТОДЫ ИЗОЛЯЦИИ.

Работа в предыдущих разделах, организованная для демонстрации основных биологических характеристик бактерий в целом, предназначена для выполнения с помощью культур различных организмов, предварительно выделенных, идентифицированных и предоставленных студенту в чистом виде. Культура, состоящая из потомства одной клетки, называется «чистой культурой»; та, которая содержит представителей двух или более видов бактерий, называется «нечистой» или «смешанной культурой», и теперь необходимо указать основные методы, с помощью которых один или несколько организмов могут быть выделены в чистом виде из смеси; независимо от того, существует ли эта смесь в виде нечистой лабораторной культуры или содержится в гное и других патологических экссудатах, инфицированных тканях, воде или пищевых продуктах.

Fig. 138.—Hæmatocytometer cell, showing, a, section through the centre of the cell, and b, a magnified image of the cell rulings.

До внедрения твердых сред единственным методом получения чистых культур был метод «разведения» — отнюдь не надежный метод. «Разведение» заключалось в приблизительной оценке количества бактерий, присутствующих в заданном объеме жидкости (с помощью предметного стекла с градуированной камерой, напоминающей гемоцитометр, рис. 138), и разведении жидкости путем добавления стерильной воды или бульона до тех пор, пока заданный объем (обычно 1 см³) разведения не содержал только один организм. При посеве этого объема жидкости в несколько пробирок или колб с питательными средами иногда случалось, что полученный рост был продуктом одной особи микроба. Столь ненадежный метод в настоящее время, к счастью, заменен многими другими, более надежными и удобными, и в методах, выбранных здесь для описания, разделение и изоляция требуемых бактерий могут быть осуществлены—

A. Механическим разделением.

1. Поверхностным посевом на пластины:

(a) Gelatine.

(b) Agar.

(c) Serum agar.

(d) Blood agar.

(e) Hanging-drop or block.

[2. Посевом вращением по Эсмарху:

Этот архаичный метод (см. стр. 226) больше не используется для изоляции бактерий.]

3. Серийным посевом.

B. Биологической дифференциацией.

4. Дифференциальными средами.

(a) Selective.

(b) Deterrent.

5. Дифференциальной инкубацией.

6. Дифференциальной стерилизацией.

7. Дифференциальным культивированием в атмосфере.

8. Инокуляцией животным.

Выбор метода, который будет применяться в каждом конкретном случае, зависит от множества обстоятельств, и часто комбинация двух или более методов обеспечивает более быстрый и надежный результат, чем строгое следование какому-либо одному методу. Опыт — единственный надежный проводник, но, как правило, использование первого или третьего метода окажется наиболее удобным, поскольку каждый из них дает возможность одновременной изоляции нескольких или всех разновидностей бактерий, присутствующих в смеси.

1. Поверхностные посевы на пластины.—

(a) Желатин (см. стр. 164).

(b) Агар (см. стр. 167).

(c) Щелочная сывороточная агаровая среда (см. стр. 211).

Эти пластины готовятся способом, в точности аналогичным тому, который принят для поверхностных посевов на желатин и агар (см. стр. 231-233).

(d) Сывороточный агар.—

1. Расплавьте три пробирки с питательным агаром, промаркируйте их 1, 2 и 3 и поместите их вместе с тремя пробирками стерильной жидкой сыворотки, также промаркированными 1a, 2a и 3a, в водяную баню, отрегулированную на 45° C; дайте достаточно времени, чтобы температура содержимого каждой пробирки достигла температуры водяной бани.

2. Возьмите пробирку с сывороткой № 1a и пробирку с агаром № 1. Прокалите пробки и удалите их из пробирок (удерживая пробку пробирки с агаром в руке); прокалите горлышки пробирок, перелейте сыворотку в пробирку с расплавленным агаром и верните пробку на место.

3. Тщательно перемешайте и залейте пластину № 1 secundum artem.

4. Обработайте оставшиеся пробирки с агаром и сывороткой аналогичным образом и залейте пластины № 2 и 3.

5. Высушите пластины с сывороточным агаром в термостате при 60° C в течение одного часа (см. стр. 232).

6. Инокулируйте пластины серийно, как описано для поверхностных посевов на желатин (стр. 231).

(e) Кровяной агар, человеческий.—

1. Расплавьте пробирку со стерильным агаром и вылейте ее в стерильную чашку; дайте застыть.

2. Соберите несколько капель человеческой крови в стерильных асептических условиях в стерильную капиллярную пипетку с резиновой грушей.

3. Слегка приподнимите крышку чашки Петри, вставьте кончик капиллярной пипетки и нанесите кровь в центр поверхности агара. Закройте чашку.

4. Возьмите платиновой петлей небольшое количество инокулята. Приподнимите крышку пластины, введите петлю, смешайте ее содержимое с каплей крови, удалите петлю, закройте чашку и простерилизуйте петлю.

5. Наконец, распределите смесь по поверхности агара стерилизованным L-образным шпателем.

6. Промаркируйте и поместите в термостат.

(При необходимости можно инокулировать серийно две, три или более подобных пластин.)

(f) Кровяной агар, животный.—

При приготовлении цитратного кровяного агара (стр. 171) всегда рекомендуется разливать несколько пробирок с кровяным агаром в чашки, которые можно хранить в леднике, готовыми к использованию в любой момент для поверхностных посевов.

(g) Культура в висячей капле или блоке (см. стр. 233).

3. Серийные посевы.—Обычно делаются на агаре или сыворотке крови, хотя можно использовать и желатин.

Метод заключается в следующем:

1. Возьмите не менее четырех «скошенных» пробирок со средами и пронумеруйте их по порядку.

2. Прокалите все пробки и убедитесь, что каждую из них можно легко удалить.

3. Зарядите платиновую петлю небольшим количеством инокулята, соблюдая обычный порядок, и засейте пробирку № 1, тщательно распределяя по всей поверхности. Если на дне пробирки скопилась конденсационная вода, используйте ее как разбавитель перед распределением содержимого петли по поверхности среды.

4. Не стерилизуя и не перезаряжая петлю, инокулируйте пробирку № 2, сделав три параллельных штриха от одного конца скошенной поверхности до другого.

5. Засейте остальные пробирки в серии «штрихами», как пробирку № 1.

6. Промаркируйте отличительным именем или номером и датой; поместите в термостат.

Рост, который последует в первых двух или трех пробирках серии, вероятно, будет настолько плотным, что окажется бесполезным. Однако ближе к концу серии будут обнаружены отдельные колонии, каждую из которых можно перенести в свежую пробирку с питательной средой без риска загрязнения соседними колониями.

«Обработка» пластин.—

Успешно получив пластину (или пробирочную культуру), на которой колонии хорошо выросли и достаточно отделены друг от друга, следует приступить к процессу «обработки», «выкалывания» или «вылавливания» колоний, чтобы получить субкультуры в чистом виде из каждой из присутствующих различных бактерий.

Иногда это довольно простая задача. Например, исходная смешанная культура при микроскопическом исследовании содержала грамположительный микрококк, грамположительную прямую палочку и грамотрицательную короткую палочку. Третья желатиновая пластина, приготовленная из этой смеси, при осмотре после четырехдневной инкубации показала двадцать пять колоний — семь влажных желтых колоний, каждая из которых погружалась в неглубокую ямку разжиженного желатина, четырнадцать плоских переливающихся пленочных колоний и четыре приподнятые белые слизистые колонии. Пленочный препарат (окрашенный по Граму) из каждой разновидности, исследованный микроскопически, показал, что желтая разжижающая колония состояла из грамположительных микрококков; плоская колония — из грамположительных палочек, а белая колония — из грамотрицательных палочек. По одной из каждой разновидности этих колоний переносили с помощью стерилизованной петли в свежую пробирку с желатиновой культурой, и после инкубации рост в каждой субкультуре соответствовал культурно и микроскопически росту колонии на пластине, из которой она была получена — таким образом, поставленная цель была бы достигнута.

Обычно, однако, колонии нельзя так легко дифференцировать, и если их не «обрабатывать» упорядоченным и систематическим образом, много труда будет потрачено впустую, а ценное время потеряно. Следующий метод минимизирует связанные с этим трудности.

(A) Осмотр.

a. Не открывая пластину, внимательно изучите различные колонии невооруженным глазом, с помощью часовой лупы или перевернув пластину на предметном столике микроскопа и рассматривая ее с помощью 1-дюймового объектива через дно пластины и слой среды.

b. Если можно обнаружить явные различия, отметьте маленьким кружком на дне пластины местоположение каждой из выбранных колоний с помощью воскового карандаша.

c. Если нельзя выделить очевидных различий, выберите девять колоний наугад и укажите их положение карандашными отметками на дне пластины.

(B) Вылавливание колоний.—

a. Возьмите стерильную чашку Петри и переверните ее на лабораторном столе. Проведите две параллельные линии на дне чашки восковым карандашом и еще две параллельные линии под прямым углом к первой паре — таким образом разделив площадь чашки на девять частей. Пронумеруйте верхнюю правую часть 1, а центральную нижнюю часть 8 (рис. 139). Переверните чашку обратно. Номера 1 и 8 легко распознаются через стекло и благодаря своему положению позволяют локализовать любое из других делений по номеру. Это «рабочая чашка».

b. Слегка приподнимите крышку чашки и с помощью стерильной пипетки с грушей нанесите маленькую каплю стерильной воды в центр каждого из девяти делений.

c. Стерилизованным платиновым шпателем поднимите одну из отмеченных колоний с «пластины 3» и перенесите ее в первое деление в расчерченной чашке, эмульгируя в ожидающей ее капле воды. Повторите этот процесс с оставшимися колониями, эмульгируя отдельную колонию в каждой капле воды.

(C) Предварительная дифференциация бактерий.—

a. Подготовьте мазок на покровном стекле из каждой капли эмульсии в «рабочей чашке» и пронумеруйте их в соответствии с делением, из которого они были взяты. Окрасьте по методу Грама.

b. Исследуйте микроскопически, используя иммерсионный объектив, и отметьте номера тех мазков, которые морфологически и по результатам окраски по Граму представляются состоящими из различных видов бактерий.

Fig. 139.—Diagram for stock plate.

(D) Подготовка изоляционных субкультур.—

a. Инокулируйте скошенный агар и пробирку с бульоном из эмульсии в рабочей чашке, соответствующей каждому из этих специально выбранных номеров.

b. Установите, включают ли мазки из девяти эмульсий в рабочей чашке все разновидности, представленные в мазке, сделанном из исходной смеси перед посевом на пластины.

c. Если некоторые разновидности отсутствуют, подготовьте вторую рабочую чашку из других колоний на пластине 3 и повторяйте процесс до тех пор, пока каждая морфологическая форма или тинкториальная разновидность не будет получена в субкультуре.

d. Поместите рабочие чашки в ледник в ожидании результатов инкубации. (Если какая-либо из субкультур не удалась, дополнительный материал можно получить из соответствующей эмульсии; или, если она высохла, увлажнив ее дополнительной каплей стерильной дистиллированной воды.)

e. Поместите все субкультуры в термостат и идентифицируйте отобранные организмы.

4. Дифференциальные среды.—

(a) Селективные.—Некоторые разновидности сред особенно подходят для определенных видов бактерий и позволяют им перерастать и, в конечном итоге, подавлять другие разновидности; например, сусло является наиболее подходящей основой среды для роста торул и дрожжей, и его следует использовать при заливке пластин для изоляции этих организмов. Чтобы получить чистую культуру дрожжей из смеси, содержащей также бактерии, часто достаточно инокулировать сусло из смеси и инкубировать при 37° C в течение двадцати четырех часов. Засейте свежую пробирку с суслом из полученного роста и инкубируйте. Повторите процесс еще раз, и из роста в этой третьей пробирке сделайте штрих на сусло-желатине и инкубируйте при 20° C. Полученный рост почти наверняка будет чистой культурой дрожжей.

(b) Подавляющие.—Верное утверждение также справедливо. Некоторые среды обладают способностью ингибировать рост большего или меньшего числа видов. Например, среды, содержащие карболовую кислоту в количестве 1 процента, будут ингибировать рост практически всего, кроме Bacillus coli communis.

5. Дифференциальная инкубация.—

При изоляции определенных бактерий используется тот факт, что разные виды различаются по своей оптимальной температуре. Смесь, содержащую Bacillus typhosus и Bacillus aquatilis sulcatus, например, можно засеять на две пробирки со скошенным агаром, одну инкубировать при 40° C, а другую при 12° C. После двадцати четырех часов инкубации первая покажет чистую культуру Bacillus typhosus, в то время как вторая будет почти чистой культурой Bacillus aquatilis.

6. Дифференциальная стерилизация.—

(a) Неспорообразующие бактерии.—Аналогичным образом можно воспользоваться различиями в термических точках гибели бактерий. Из смеси двух организмов, чьи термические точки гибели различаются, скажем, на 4° C — например, Bacillus pyocyaneus, термическая точка гибели 55° C, и Bacillus mesentericus vulgatus, термическая точка гибели 60° C — чистую культуру последнего можно получить путем нагревания смеси на водяной бане до 58° C и поддержания ее при этой температуре в течение десяти минут. Затем смесь засевают на свежие среды и инкубируют, после чего полученный рост будет состоять исключительно из B. mesentericus.

(b) Спорообразующие бактерии.—Этот метод находит свое основное практическое применение при дифференциации спорообразующего организма от того, который не образует спор. В этом случае смесь нагревают на водяной бане при 80° C в течение пятнадцати-двадцати минут. По истечении этого времени неспорообразующие бактерии погибают, и культуры, сделанные из смеси, дадут рост, возникающий только в результате прорастания спор.

Дифференциальная стерилизация при 80° C наиболее удобно осуществляется на водяной бане специальной конструкции, разработанной Бальфуром Стюартом (рис. 140). Она состоит из медного сосуда с двойными стенками, установленного на ножках и снабженного тубусом, сообщающимся с пространством между стенками. Это пространство почти заполнено бензолом (температура кипения 80° C; для этой цели необходимо использовать чистый бензол, свободный от тиофена, иначе температура кипения со временем постепенно и заметно повышается), а к тубусу прикреплена длинная стеклянная трубка длиной около 2 метров и диаметром около 0,75 см, служащая конденсатором (трубка вдвое меньшей длины, если она снабжена конденсационным расширением в центре, будет столь же эффективна). Внутренняя часть сосуда частично заполнена водой и накрыта крышкой с отверстием для термометра. Последний погружается в воду и регистрирует ее температуру. Очень маленького пламени горелки Бунзена под аппаратом достаточно, чтобы поддерживать кипение бензола и постоянную температуру воды внутри 80° C. Таким образом, баня всегда готова к использованию.

Метод.—Использование аппарата.

1. Поместите часть самой смеси, если она жидкая и содержит споры, или эмульсию таковой, если она получена из твердого материала, в пробирку.

2. Погрузите пробирку в воду, содержащуюся в бензольной бане, следя за тем, чтобы верхний уровень жидкости в пробирке находился по крайней мере на 2 см ниже поверхности воды в медном сосуде.

3. Температура воды, конечно, падает на несколько градусов после открытия бани и внесения пробирки с более холодной жидкостью, но через несколько минут температура снова достигнет 80° C.

4. Когда термометр снова покажет 80° C, отметьте время, а пятнадцать минут спустя удалите пробирку со смесью из бани.

5. Сделайте посевы на подходящие среды; поместите в термостат.

Fig. 140.—Benzole bath.

7. Дифференциальное культивирование в атмосфере.—

(a) Адаптируя атмосферные условия к конкретному организму, который желательно изолировать, сравнительно легко отделить строгий аэроб от строгого анаэроба и наоборот. В первом случае, однако, важно, чтобы культуры были сделаны на твердых средах, так как при проведении в жидких средах аэробы, размножающиеся в верхних слоях жидкости, делают глубину полностью анаэробной, и в этих условиях рост анаэробов будет продолжаться беспрепятственно.

(b) Когда желательно отделить факультативный анаэроб от строгого анаэроба, обычно достаточно засеять смесь на поверхность скошенного агара, инкубировать аэробно при 37° C и тщательно осматривать через частые интервалы. При первых признаках роста необходимо подготовить субкультуры и обработать их аналогичным образом. В результате этих быстрых субкультивирований факультативный анаэроб будет получен в чистой культуре примерно в третьем или четвертом поколении.

(c) Если, с другой стороны, требуется строгий анаэроб из смеси факультативных и строгих анаэробов, залейте пластины глюкозо-формиатного агара (или желатина) обычным способом, поместите их в банку Буллока или Нови и инкубируйте при подходящей температуре. Выберите колонии требуемого организма, когда появится рост, и перенесите в пробирки с различными средами.

Инкубируйте при подходящих условиях температуры и атмосферы.

8. Инокуляция животным.—

Наконец, при работе с патогенными организмами часто целесообразно инокулировать часть нечистой культуры (или даже часть исходного патологического материала) животному, специально выбранному из-за его восприимчивости к конкретному патогенному организму, который желательно инокулировать. Действительно, для некоторых из наиболее чувствительных и строго паразитических бактерий этот метод инокуляции животным является практически единственным методом, который даст удовлетворительный результат.

XVI. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ИЗУЧЕНИЯ.

Чтобы идентифицировать организм после изоляции, необходимо подготовить пробирочные, пластинчатые и другие культуры, инкубировать их при подходящих условиях температуры и окружающей среды и периодически исследовать (a) макроскопически, (b) микроскопическими методами, (c) химическими методами, (d) физическими методами, (e) методами инокуляции, и результаты этих исследований должны быть должным образом записаны.

Необходимо определенно заявить, что ни один микроорганизм не может быть идентифицирован по какому-либо одному признаку или свойству, будь то микроскопическому, биологическому или химическому, но, напротив, его полная история жизни должна быть тщательно изучена, и затем его идентичность установлена на основе рассмотрения суммы всех этих наблюдений.

Чтобы придать записанным результатам их максимальную ценность, необходимо, чтобы они были точными и систематическими, поэтому следует придерживаться какой-либо подобной схемы; и это особенно необходимо при описании организма, который ранее не был изолирован и изучен.

СХЕМА ИЗУЧЕНИЯ.

Обозначение:

Первоначально выделен (имя наблюдателя) в (дата), из (источник организма).

1. Культуральные признаки.—(См. Макроскопическое исследование культуры, стр. 261.)

Gelatine plates,} Gelatine streak,} at 20°C. Gelatine stab,} Gelatine shake,}

Agar plates,} Agar streak or smear,} Agar stab,} Inspissated blood-serum,} at 20° C. and 37°C. Bouillon,} Litmus milk,} Potato,}

Специальные среды для демонстрации характерного внешнего вида.

2. Морфология.—(См. Микроскопическое исследование культур, стр. 272.)

Vegetative forms:

Shape.

Size.

Motility.

Flagella (if present).

Capsule (if present).

Involution forms.

Pleomorphism (if observed).

Sporing forms (if observed). Of which class?

Staining reactions.

3. Химические продукты роста.—(См. Химическое исследование культур, стр. 276.)

Chromogenesis.

Photogenesis.

Enzyme formation.

Fermentation of carbohydrates:

Acid formation.

Alkali formation.

Indol formation.

Phenol formation.

Reducing and oxidising substances.

Gas formation.

4. Биология.—(См. Физическое исследование культур, стр. 295.)

Atmosphere.

Temperature.

Reaction of nutrient media.

Resistance to lethal agents:

Physical:

Desiccation.

Light.

Colours.

Chemical germicides.

Vitality.

5. Патогенность:

Susceptible animals, subsequently arranged in order of susceptibility.

Immune animals.

Experimental inoculation, symptoms of disease.