«Основы бактериологической техники»

Среды для изучения дрожжей и плесневых грибов.

Раствор Пастера. —

(Реакция щелочная).

1. Weigh out and mix the ash from 10 grammes of yeast; ammonium tartrate, 10 grammes; cane sugar, 100 grammes.

2. Dissolve the mixture in distilled water, 1000 c.c.

3. Разлить по пробиркам или колбам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Дрожжевая вода (Пастер). —

1. Weigh out pressed yeast, 75 grammes; place in a 2-litre flask and add 1000 c.c. distilled water.

2. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут.

3. Профильтровать через бумагу Шардена.

4. Разлить по пробиркам или колбам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Раствор Кона. —

1. Отвесить и смешать

Acid potassium phosphate (KH2PO4)5.0 grammes Calcium phosphate0.5 gramme Magnesium sulphate5.0 grammes Ammonium tartrate10.0 grammes

и растворить в

Distilled water1000 c.c.

2. Разлить по пробиркам или колбам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Раствор Негели. —

1. Отвесить и смешать

Dibasic potassium phosphate (K2HPO4)1.0 gramme Magnesium sulphate0.2 gramme Calcium chloride0.1 gramme Ammonium tartrate10.0 grammes

и растворить в

Distilled water1000 c.c.

2. Разлить по пробиркам или колбам; стерилизовать так же, как питательный бульон.

Гипсовые диски. —

1. Взять большие пробки диаметром 2,5 см и обернуть каждую куском плотной бумаги для записей так, чтобы около сантиметра выступало над верхней поверхностью пробки, и закрепить булавкой (рис. 112).

2. Смешать гипс с дистиллированной водой до состояния густой пасты и заполнить этой пастой каждую пробковую форму.

3. Когда гипс застынет, снять бумагу с пробок и извлечь гипсовые диски.

4. Поместить гипсовые диски на лист асбеста и стерилизовать в сушильном шкафу при 150° C в течение получаса.

Fig. 112.—Cork and paper mould for plaster-of-Paris disc.

5. Извлечь стерильные диски из шкафа с помощью стерильного пинцета, поместить каждый внутрь стерильной капсулы и смочить небольшим количеством стерильной воды.

6. Стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд.

Гипсовые блоки (Энгель и Хансен). —

Они имеют форму усеченных конусов, для их приготовления требуются небольшие жестяные формы диаметром 5,5 см у основания и 4 см у усеченной вершины. Высота (или глубина) формы составляет от 4,5 до 5 см.

1. Смешать порошкообразный прокаленный гипс с дистиллированной водой до состояния густой пасты.

2. Заполнить пастой формы и дать ей застыть и высохнуть на воздухе.

3. Извлечь блок из формы и перенести его в двойную стеклянную чашку подходящего размера (диаметром 7 см × высотой 7 см).

4. Стерилизовать блок в чашке в течение одного часа в сушильном шкафу при 115° C.

5. Осторожно открыть чашку и добавить стерильную дистиллированную воду, чтобы смочить блок и создать на дне чашки слой глубиной 1 см.

Виноградное сусло. — (Виноградное сусло получают с Сицилии в герметично закрытых банках в высококонцентрированном виде — в виде густого сиропа, но не стерилизованным.)

1. Weigh out "wine must," 200 grammes, place in a 2-litre flask and add distilled water, 800 c.c.

2. Weigh out ammonium tartrate, 5 grammes, and add to the dilute must.

3. Поместить колбу на водяную баню, нагретую до 60° C, на один час и тщательно перемешать смесь частым встряхиванием.

4. Профильтровать через бумагу Шардена.

5. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Пшеничный бульон (Гасперини). —

1. Отвесить и смешать 150 г пшеничной муки, 0,5 г сульфата магния, 1 г нитрата калия, 15 г глюкозы.

2. Растворить смесь в 1000 см³ воды, нагретой до 100° C.

3. Профильтровать через бумагу Шардена.

4. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Хлебная паста. —

1. Мелко натереть черствый хлеб на терке.

2. Распределить крошки по стерильным колбам Эрленмейера так, чтобы они образовали слой толщиной около одного сантиметра по дну каждой.

3. Добавить столько дистиллированной воды, сколько крошки могут впитать, но не столько, чтобы покрыть хлеб.

4. Закрыть колбы пробками и стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение четырех дней подряд.

Среды для изучения паразитических плесневых грибов.

Французский агар Сабуро. —

1. Weigh out Chassaing's peptone, 10 grammes, and emulsify it with 200 c.c. distilled water previously heated to 60°C.

2. Weigh out powdered agar, 13 grammes, and emulsify with 200 c.c. cold distilled water.

3. Смешать две эмульсии и смыть в тарированную 2-литровую колбу 600 см³ дистиллированной воды.

4. Пропускать живой пар через смесь в течение двадцати минут для растворения агара.

5. Охладить до 60° C и осветлить яичным белком, как питательный агар (см. стр. 168).

6. Профильтровать через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

7. Weigh out French maltose, 40 grammes, and dissolve in the agar.

8. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный агар.

Английский агар Блэксолла. — Заменить пептон Шассена пептоном Витте и действовать так же, как при приготовлении французского агара.

Французский маннитный агар Сабуро. — (Для культивирования возбудителя фавуса.)

Действовать точно так же, как при приготовлении французского агара (см. выше), заменив мальтозу маннитом (38 г).

Среды для изучения молочных бактерий.

Желатиновый агар. — Эта среда готовится путем добавления к питательному желатину достаточного количества агара для обеспечения твердости среды при инкубации при температурах выше 22° C. Если предполагается использовать температуру инкубации 30° C, необходимо растворить 10% желатина и 0,5% агара в мясном экстракте до добавления пептона и соли; для инкубации при 37° C необходимо использовать 12% желатина и 0,75% агара. Избегайте добавления большего количества агара, чем абсолютно необходимо, иначе действие на среду таких организмов, которые вырабатывают разжижающий фермент, может быть замедлено или полностью отсутствовать.

1. Measure out 400 c.c. double strength meat extract into a "tared" 2-litre flask, and add to it gelatine, 100 grammes.

2. Отвесить 5 г порошкообразного агара, эмульгировать со 100 см³ холодной дистиллированной воды и добавить к содержимому колбы.

3. Растворить агар и желатин, пропуская живой пар через колбу в течение двадцати минут.

4. Отвесить 10 г пептона, 5 г соли, эмульгировать со 100 см³ мясного экстракта двойной концентрации, предварительно нагретого до 60° C, и добавить к содержимому колбы.

5. Поместить обратно в паровой стерилизатор на пятнадцать минут. Затем довести вес до расчетного значения для одного литра (в данном случае 1120 г) добавлением дистиллированной воды при 100° C.

6. Определить реакцию; проверить результат. Затем добавить достаточное количество раствора едкого натра, чтобы довести реакцию до +10.

7. Поместить обратно в паровой стерилизатор при 100° C на двадцать минут.

8. Охладить до 60° C. Осветлить яичным белком, как питательный агар.

9. Профильтровать через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

10. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный агар.

Агаровый желатин (Гуарниари). —

1. Measure out double strength meat extract, 400 c.c., into a "tared" 2-litre flask, and add to it gelatine, 50 grammes.

2. Отвесить 3 г порошкообразного агара; эмульгировать с 50 см³ холодной дистиллированной воды и добавить к содержимому колбы.

3. Растворить агар и желатин, пропуская живой пар через колбу в течение двадцати минут.

4. Отвесить 25 г пептона Витте, 5 г соли, эмульгировать со 100 см³ мясного экстракта двойной концентрации, предварительно нагретого до 60° C, и добавить к содержимому колбы.

5. Поместить обратно в паровой стерилизатор на пятнадцать минут.

6. Взвесить колбу и довести массу среды до расчетного значения для одного литра (1083 г) добавлением дистиллированной воды при 100° C.

7. Тщательно нейтрализовать по лакмусовой бумаге последовательным добавлением небольших количеств нормального раствора соды.

8. Поместить обратно в паровой стерилизатор при 100° C на двадцать минут.

9. Охладить до 60° C. Осветлить яичным белком, как питательный агар.

10. Профильтровать через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

11. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный агар.

Сывороточный желатин. —

1. Свернуть свежее молоко, нагрев его до 60° C и добавив сычужный фермент; отфильтровать сыворотку в стерильную тарированную колбу.

2. Определить и отметить реакцию сыворотки.

3. Weigh out gelatine, 10 per cent., and add it to the whey in the flask.

4. Пропускать живой пар через смесь в течение пятнадцати минут для растворения желатина; взвесить.

5. Определить реакцию массы среды; затем добавить достаточное количество раствора едкого натра, чтобы восстановить реакцию массы среды (т. е. общий вес минус вес колбы) до эквивалента исходной сыворотки.

6. Охладить до 60° C и осветлить яичным белком, как питательный желатин (см. стр. 166).

7. Профильтровать через бумагу Шардена.

8. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный желатин.

Сывороточный агар. —

1. Свернуть свежее молоко, нагрев его до 60° C и добавив сычужный фермент; отфильтровать сыворотку в стерильную колбу.

2. Отвесить 1,5% или 2% агара и добавить его к сыворотке в колбе.

3. Пропускать живой пар через смесь в течение двадцати минут для растворения агара.

4. Охладить до 60° C; осветлить яичным белком, как питательный агар (см. стр. 168).

5. Профильтровать через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

6. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный агар.

Лакмусовая сыворотка. —

1. Свернуть свежее молоко, нагрев его до 60° C и добавив сычужный фермент.

2. Отфильтровать сыворотку через муслин в стерильную колбу.

3. Нейтрализовать по лакмусу осторожным добавлением 4% раствора лимонной кислоты. (Не нейтрализовать минеральной кислотой.)

4. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение одного часа для коагуляции всех белков.

(Если сыворотка мутная после извлечения из стерилизатора, дать ей постоять сорок восемь часов в леднике, а затем слить прозрачную жидкость или профильтровать через фильтровальную свечу Беркефельда.)

5. Профильтровать в стерильную колбу.

6. Подкрасить сыворотку раствором лакмуса до темно-пурпурно-красного цвета.

7. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как молоко.

Лакмусовая сыворотка (Петрушки). —

1. Отмерить в колбу

Fresh milk1000 c.c.

2. Добавить

Hydrochloric acid (or glacial acetic acid)1.5 c.c.

и прокипятить.

3. Отфильтровать свернувшийся казеин.

4. Нейтрализовать по лакмусу добавлением 1 н. раствора едкого натра и прокипятить. Сыворотка снова мутная и кислая.

5. Снова нейтрализовать по лакмусу добавлением 0,1 н. раствора едкого натра.

6. Профильтровать.

7. Подкрасить сыворотку нейтральным раствором лакмуса до темно-пурпурного цвета.

8. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как молоко.

Лакмусовый сывороточный желатин. —

1. Отмерить 1000 см³ молока в тарированную 2-литровую колбу.

2. Добавить 1,5 см³ соляной кислоты (или ледяной уксусной кислоты) и кипятить пять минут.

3. Отфильтровать казеин и сделать сыворотку слабощелочной по лакмусу.

4. Отвесить

Peptone10 grammes

и эмульгировать в нескольких кубических сантиметрах сыворотки, затем вернуть в колбу.

5. Отвесить

Gelatine50 grammes

добавить к сыворотке в колбе и перемешать смесь, пропуская живой пар.

6. Осветлить яичным белком и профильтровать.

7. Довести вес массы среды до расчетного значения для одного литра (1060 г) добавлением дистиллированной воды.

8. Отвесить

Dextrose15 grammes

и растворить в жидком сывороточном желатине.

9. Добавить стерильный раствор лакмуса до требуемого оттенка.

10. Разлить по пробиркам и стерилизовать в течение двадцати минут в паровом стерилизаторе при 100° C в течение пяти дней подряд.

Эта среда остается полужидкой при комнатной температуре и может использоваться для культур в холодном или горячем инкубаторе.

Лакмусовый сывороточный агар готовится аналогично сывороточному желатину, с заменой желатина 15 г агара.

Раствор солодового экстракта (Гершелл). —

1. Отмерить в колбу 1000 см³ дистиллированной воды.

2. Отвесить

Extractum malti (malt extract)25 grammes

и добавить к дистиллированной воде в колбе.

3. Кипятить пять минут, дать постоять и слить прозрачную жидкость с осадка.

4. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Среды для изучения почвенных бактерий, азотфиксаторов.

Агар с почвенными солями (Липман и Браун). — (Для подсчета почвенных организмов.)

1. Отмерить

Agar20 grammes.

Эмульгировать в 200 см³ дистиллированной воды.

2. Смыть агаровую эмульсию в тарированную 2-литровую колбу 400 см³ дистиллированной воды.

3. Отвесить

Peptone0.5 gramme.

Эмульгировать в 50 см³ дистиллированной воды и добавить к содержимому колбы.

4. Пропускать живой пар через смесь в течение двадцати минут для растворения агара.

5. Отвесить и смешать

Dextrose10.0 grammes. Potassium phosphate0.5 gramme. Magnesium sulphate0.2 gramme. Potassium nitrate0.06 gramme.

и добавить к содержимому колбы.

6. Довести вес массы среды до расчетного значения для одного литра (1025 г) добавлением дистиллированной воды при 100° C.

7. Оттитровать массу среды и довести реакцию до +5.

8. Охладить до 60° C. Осветлить яичным белком и профильтровать.

9. Разлить по пробиркам порциями по 10 см³ и стерилизовать так же, как питательный агар.

Раствор Бейеринка I. — (Для культивирования азотфиксирующих организмов.)

1. Отвесить и смешать 1 г гидрофосфата калия, 0,2 г сульфата магния и 0,02 г хлорида натрия.

2. Растворить в 1000 см³ воды в 2-литровой колбе.

3. Добавить 1 см³ однопроцентного водного раствора сульфата железа.

4. Добавить 1 см³ однопроцентного раствора сульфата марганца.

5. Отвесить 20 г декстрозы и добавить к содержимому колбы (для различных организмов можно использовать до 40 г декстрозы).

6. Пропарить в течение двадцати минут, профильтровать.

7. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Раствор Бейеринка II. — (Для роста Azobacter.)

Действовать так же, как при приготовлении раствора № I, заменив декстрозу маннитом в шаге 5.

Раствор Виноградского (для нитрифицирующих организмов). —

1. Отвесить и смешать.

Potassium phosphate1.0 gramme Magnesium sulphate0.5 gramme Calcium chloride0.01 gramme Sodium chloride2.0 grammes

и растворить в

Distilled water1000 c.c.

2. Разлить по колбам порциями по 20 см³ и добавить в каждую небольшое количество свежепромытого карбоната магния.

3. Стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

4. Add to each flask containing 20 c.c. solution, 2 c.c. of a sterile 2 per cent. solution of ammonium sulphate.

5. Инкубировать при 37° C в течение сорока восьми часов и удалить все загрязненные колбы с культурой. Остальное сохранить для дальнейшего использования.

Раствор Виноградского (для нитритных организмов). —

1. Отвесить и смешать

Ammonium sulphate1 gramme Potassium sulphate1 gramme

и растворить в

Distilled water1000 c.c.

2. Добавить 5–10 г основного карбоната магния, предварительно стерилизованного кипячением.

3. Разлить по колбам и стерилизовать и т. д., как предыдущий раствор.

Силикатный гель (Виноградский). —

1. Отвесить и смешать

Ammonium sulphate0.40 gramme Magnesium sulphate0.05 gramme Calcium chloride0.01 gramme

и растворить в

Distilled water50 c.c.

Этикетка — Раствор A.

2. Отвесить и смешать

Potassium phosphate0.10 gramme Sodium carbonate0.60 gramme

и растворить в

Distilled water50 c.c.

Этикетка — Раствор B.

3. Отвесить

Silicic acid3.4 grammes

и растворить в

Distilled water100 c.c.

4. Вылить раствор кремниевой кислоты в большую фарфоровую чашку.

5. Смешать равные количества растворов A и B; затем добавлять последовательно небольшими порциями смесь солей к раствору кремниевой кислоты, непрерывно помешивая стеклянной палочкой, пока не образуется гель достаточно твердой консистенции.

6. Распределить слой этого геля по дну каждой из нескольких больших капсул или «чашек».

7. Стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд.

Среды для изучения водных бактерий.

Питательный агар (Гессе и Ниднер). — (Для подсчета водных организмов.)

1. Отвесить: 12,5 г агара и эмульгировать в 250 см³ дистиллированной воды.

2. Смыть агаровую эмульсию в тарированную 2-литровую колбу еще 250 см³ дистиллированной воды.

3. Растворить, пропуская живой пар через смесь.

4. Эмульгируйте 7,5 г Naehrstoff-Heyden (альбумозы) в 200 мл холодной дистиллированной воды и добавьте к расплавленному агару.

5. Доведите массу среды до расчетного значения для одного литра (1020 г) путем добавления дистиллированной воды при температуре 100° C.

6. Осветлите яичным белком и отфильтруйте.

7. Разлейте в пробирки по 10 мл и стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Бульон с желчными солями — двойной концентрации.

1. Weigh out Witté's peptone, 40 grammes, and emulsify with 300 c.c. distilled water previously warmed to 60° C.

2. Смойте пептонную эмульсию в литровую колбу 600 мл дистиллированной воды.

3. Отвесьте 10 г таурохолата натрия и 10 г глюкозы; растворите в 100 мл дистиллированной воды и добавьте к пептонной эмульсии в колбе.

4. Нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут.

5. Отфильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу в стерильную колбу.

6. Добавьте стерильный нейтральный раствор лакмуса в количестве, достаточном для окрашивания среды в глубокий пурпурный цвет.

7. Разлейте в небольшие колбы Эрленмейера по 25 мл.

8. Стерилизуйте так же, как питательный бульон.

Среды для изучения бактерий растений.

Beetroot.—} Carrot.—} are prepared tubes and sterilised in a manner precisely Turnip.—} similar to that described for potato. Parsnip.—}

Сенной настой.

1. Weigh out dried hay, 10 grammes, chop it up into fine particles and place in a flask.

2. Добавьте 1000 мл дистиллированной воды, нагретой до 70° C; закройте колбу плотной резиновой пробкой.

3. Мацерируйте на водяной бане при 60° C в течение трех часов.

4. Замените пробку ватной пробкой и нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение одного часа.

5. Отфильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный бульон.

Фасолевый бульон. (Для культивирования бактерий из клубеньков бобовых).

1. Отмерьте 1000 мл дистиллированной воды в 2-литровую колбу.

2. Отвесьте 250 г фасоли и добавьте к воде в колбе.

3. Отвесьте 10 г хлорида натрия и добавьте к содержимому колбы.

4. Добавьте 1 мл 1-процентного раствора бикарбоната натрия.

5. Поместите в паровой стерилизатор при 100° C на тридцать минут.

6. Отфильтруйте.

7. Отвесьте 20 г сахарозы и добавьте к фильтрату.

8. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный бульон.

Фасолевый агар.

1. Отмерьте 400 мл дистиллированной воды в тарированную 2-литровую колбу.

2. Отвесьте 15 г агара, смешайте со 100 мл холодной дистиллированной воды до состояния густой пасты и добавьте в колбу.

3. Растворите агар, пропуская острый пар через смесь, как при приготовлении питательного агара.

4. Отвесьте 250 г фасоли, поместите в колбу со смесью агара.

5. Добавьте 1 мл 1-процентного водного раствора бикарбоната натрия.

6. Отвесьте 10 г хлорида натрия и добавьте к содержимому колбы.

7. Поместите в паровой стерилизатор при 100° C на тридцать минут.

8. Доведите массу среды до 1030 г (значение на литр, полученное экспериментально) путем добавления дистиллированной воды при 100° C.

9. Охладите до 60° C, осветлите яйцом и отфильтруйте.

10. Отвесьте 20 г сахарозы и добавьте к содержимому колбы.

11. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар на древесной золе.

1. Отмерьте 400 мл дистиллированной воды в тарированную 2-литровую колбу.

2. Отвесьте 10 г агара и сделайте густую пасту со 100 мл холодной дистиллированной воды.

3. Добавьте эту агаровую пасту к дистиллированной воде в колбе.

4. Растворите агар, пропуская через него острый пар, как при приготовлении питательного агара.

5. Отвесьте 5 г чистой древесной золы и поместите во вторую колбу, содержащую 200 мл дистиллированной воды с несколькими стерильными стеклянными бусинами: тщательно встряхивайте в механическом шейкере в течение десяти минут.

6. Нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут.

7. После извлечения из стерилизатора тщательно вытрите внешнюю поверхность колбы, поместите ее над пламенем Бунзена и кипятите в течение одной минуты.

8. Отфильтруйте непосредственно в колбу, содержащую расплавленную агаровую смесь.

9. Отвесьте 4 г мальтозы. Добавьте к содержимому колбы.

10. Доведите массу среды до расчетного значения для одного литра (1019 г) путем добавления дистиллированной воды при 100° C.

11. Поместите колбу обратно в паровой стерилизатор на двадцать минут, охладите до 60° C, осветлите яйцом и отфильтруйте.

12. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Среды для изучения специальных бацилл.

B. Acnes.

Агар с олеиновой кислотой (Флеминг).

1. Отмерьте в стерильную толстостенную стеклянную бутыль, в которой уже содержится около 10 стерильных стеклянных бусин

Ascitic fluid250 c.c.

2. Отвесьте

Oleic acid25 grammes

и добавьте к асцитической жидкости в бутыли.

3. Равномерно эмульгируйте путем встряхивания (вручную или в шейкере) в течение десяти минут.

4. Расплавьте и отмерьте в колбу

Nutrient agar750 c.c.

затем охладите до 55° C.

5. Смешайте эмульсию олеиновой кислоты с агаром.

6. Add 10 c.c. sterile neutral red, 1 per cent. aqueous solution.

7. Разлейте в пробирки по 10 мл, наклоните и дайте застыть.

8. Инкубируйте в течение сорока восьми часов при 37° C и отбракуйте все загрязненные пробирки. Храните стерильные пробирки для дальнейшего использования.

Группа кишечно-тифозных бактерий.

Бульон Париетти.

1. Отмерьте 4 мл чистой соляной кислоты и добавьте к ней 100 мл раствора карболовой кислоты (5-процентного). Дайте раствору постоять по крайней мере несколько дней перед использованием.

2. Этот раствор добавляется в количествах 0,1, 0,2 и 0,3 мл (с помощью стерильной градуированной пипетки) в пробирки, каждая из которых содержит 10 мл предварительно стерилизованного питательного бульона (см. стр. 163).

3. Инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов для удаления загрязненных пробирок. Храните остаток для дальнейшего использования.

Карболизованный бульон.

1. Приготовьте питательный бульон (см. стр. 163, разделы с 1 по 6). Отмерьте 1000 мл.

2. Отвесьте 1 г карболовой кислоты (для специальных целей может потребоваться 2,5 или 5 г) и растворите ее в среде.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как бульон.

Карболизованный желатин.

1. Приготовьте питательный желатин (см. стр. 164, разделы с 1 по 7). Отмерьте 1000 мл.

2. Weigh out carbolic acid, 5 grammes (= 0.5 per cent.), and dissolve it in the gelatine.

3. При необходимости отфильтруйте через бумагу Шардена.

4. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный желатин.

Один или 2,5 г карболовой кислоты (= 0,1% или 0,25%) иногда используются вместо 5 г для удовлетворения особых требований.

Карболизованный агар.

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167, разделы с 1 по 8). Отмерьте 1000 мл.

2. Отвесьте 1 г чистого фенола и растворите в среде.

3. При необходимости отфильтруйте через бумагу Шардена.

4. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Лакмусовый желатин.

1. Приготовьте питательный желатин (см. стр. 164, разделы с 1 по 8).

2. Добавьте стерильный раствор лакмуса в количестве, достаточном для окрашивания среды в глубокий лавандовый цвет.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный желатин.

Лактозо-лакмусовый бульон (Lakmus Molke).

1. Weigh out peptone, 4 grammes, and emulsify it with 200 c.c. meat extract (vide page 148), previously heated to 60°C.

2. Weigh out salt, 2 grammes, and lactose, 20 grammes, and mix with the emulsion.

3. Смойте смесь в стерильную литровую колбу 200 мл мясного экстракта и добавьте 600 мл дистиллированной воды.

4. Нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут, чтобы полностью растворить пептон и т. д.

5. Тщательно нейтрализуйте по лакмусовой бумаге путем последовательного добавления небольших количеств децинормального раствора соды.

6. Поместите обратно в паровой стерилизатор на двадцать минут для осаждения фосфатов и т. д.

7. Отфильтруйте через два слоя шведской фильтровальной бумаги.

8. Добавьте стерильный раствор лакмуса в количестве, достаточном для окрашивания среды в глубокий пурпурный цвет.

9. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как бульон.

Лактозо-лакмусовый желатин (Вюрц).

1. Приготовьте питательный желатин (см. стр. 164, разделы с 1 по 4).

2. Доведите реакцию среды до -5.

3. Поместите обратно в паровой стерилизатор при 100° C на двадцать минут.

4. Осветлите яйцом, как для желатина.

5. Weigh out lactose, 20 grammes (= 2 per cent.), and dissolve it in the medium.

6. Отфильтруйте через бумагу Шардена.

7. Добавьте достаточное количество стерильного раствора лакмуса, чтобы окрасить среду в бледно-лавандовый цвет.

8. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный желатин.

Лактозо-лакмусовый агар (Вюрц).

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167, разделы с 1 по 4).

2. Доведите реакцию среды до -5.

3. Поместите обратно в паровой стерилизатор при 100° C на двадцать минут.

4. Охладите до 60° C и осветлите яйцом, как для питательного агара.

5. Weigh out lactose, 20 grammes (= 2 per cent.), and dissolve it in the medium.

6. Отфильтруйте через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

7. Добавьте стерильный раствор лакмуса в количестве, достаточном для окрашивания среды в бледно-лавандовый цвет.

8. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Глицериновый картофельный бульон.

1. Возьмите 1 кг картофеля, тщательно промойте в воде, очистите и мелко натрите на терке для хлеба.

2. Взвесьте картофельную массу, поместите ее в 2-литровую колбу и добавьте дистиллированную воду в пропорции 1 мл на каждый грамм массы картофеля. Оставьте колбу в холодильнике на двенадцать часов.

3. Процедите смесь через марлю и отфильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу в мерный цилиндр. Отметьте количество фильтрата.

4. Поместите фильтрат в колбу, добавьте равное количество дистиллированной воды и нагревайте в паровом стерилизаторе в течение шестидесяти минут.

5. Add glycerine, 4 per cent., mix thoroughly, and again filter.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный бульон.

Картофельный желатин (Эльснер).

1. Возьмите 1 кг картофеля, тщательно промойте в воде, очистите и, наконец, мелко натрите на терке для хлеба.

2. Взвесьте картофельную массу, поместите ее в 2-литровую колбу и добавьте дистиллированную воду в пропорции 1 мл на каждый грамм массы картофеля. Оставьте колбу в холодильнике на двенадцать часов.

3. Процедите смесь через марлю и отфильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу в мерный цилиндр.

4. Добавьте 15-процентный желатин к картофельному отвару и пропустите острый пар через смесь в течение десяти минут.

5. Оцените реакцию; доведите реакцию среды до +25.

6. Охладите среду ниже 60° C; осветлите яйцом, как для питательного желатина (см. стр. 166).

7. Добавьте 1-процентный йодид калия (порошкообразный) в среду.

8. Отфильтруйте через бумагу Шардена.

9. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный желатин.

Эскулиновый агар. (B. coli и родственные организмы дают черные колонии, окруженные черным ореолом).

1. Отмерьте 400 мл дистиллированной воды в тарированную 2-литровую колбу.

2. Отвесьте

Agar15 grammes Peptone10 grammes Sodium taurocholate5 grammes

и сделайте густую пасту со 150 мл дистиллированной воды.

3. Добавьте эту пасту к дистиллированной воде в колбе.

4. Растворите ингредиенты, пропуская острый пар через смесь.

5. Отвесьте

Aesculin1.0 gramme Ferric citrate0.5 gramme

и растворите во второй колбе, содержащей 100 мл дистиллированной воды.

6. Смешайте содержимое двух колб — доведите массу до расчетного значения среды (в данном случае 1031,5 г) путем добавления дистиллированной воды при 100° C.

7. Осветлите яйцом и отфильтруйте.

8. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар с желчными солями (МакКонки).

1. Weigh out powdered agar, 15 grammes (= 1.5. per cent.), and emulsify with 200 c.c. cold tap water.

2. Weigh out peptone, 20 grammes (= 2 per cent.), and emulsify with 200 c.c. tap water previously warmed to 60°C.

3. Тщательно смешайте пептонную и агаровую эмульсии.

4. Отвесьте 5 г таурохолата натрия (= 0,5%), растворите его в 300 мл водопроводной воды и используйте этот раствор для смывания агарово-пептонной эмульсии в тарированную 2-литровую колбу.

5. Пропускайте острый пар через смесь в течение двадцати минут.

6. Доведите массу среды до расчетного значения для одного литра (1040 г).

7. Охладите до 60° C и осветлите яйцом, как для питательного агара (см. стр. 168).

8. Отфильтруйте через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

9. Weigh out lactose, 10 grammes (= 1 per cent.), and dissolve it in the agar.

При желании добавьте 5 мл 1-процентного (= 0,5%) водного раствора нейтрального красного.

10. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар с лакмусом и нутрозой (Дригальский-Конради).

Эта среда должна быть приготовлена точно так же, как нутрозный агар, описанный на стр. 172, с заменой сывороточной воды на мясной экстракт и увеличением процентного содержания агара, добавляемого на литр, до 3 процентов.

Фуксиновый агар (Браун).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу:

Nutrient agar1000 c.c.

2. Отвесьте: 10 г лактозы и растворите в жидком агаре.

3. Доведите реакцию до -5 и отфильтруйте.

4. Отмерьте и тщательно смешайте с агаром:

Fuchsin, alcoholic solution5 c.c.

Раствор фуксина готовится путем смешивания:

Fuchsin (basic)3 grammes. Absolute alcohol60 c.c.

Дайте постоять двадцать четыре часа, затем тщательно центрифугируйте и слейте надосадочную жидкость в бутыль с плотной пробкой.

5. Measure out and add to the nutrient agar, sodium sulphite, 10 per cent. aqueous solution, freshly prepared 25 c.c.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

7. Храните в темном шкафу.

Фуксин-сульфитный агар (Эндо).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу:

Nutrient agar1000 c.c.

2. Отвесьте

Lactose10 grammes.

и растворите в жидком агаре.

3. Доведите реакцию до +3 и отфильтруйте.

4. Отмерьте и тщательно смешайте с жидким агаром.

Fuchsin, alcoholic solution (vide supra)5 c.c.

5. Отмерьте и добавьте к среде

Sodium sulphite, 10 per cent. aqueous solution25 c.c.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар с бриллиантовым зеленым (Конради).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу

Nutrient agar1000 c.c.

2. Доведите реакцию до +30 путем добавления нормальной фосфорной кислоты; и отфильтруйте.

3. Отмерьте и тщательно смешайте с жидкой средой

Brilliant green (Hoechst) 1 per thousand aqueous solution6.5 c.c.

4. Отмерьте и добавьте к среде

Picric acid (Gruebler), 1 per cent. aqueous solution6.5 c.c.

5. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар с бриллиантовым зеленым и желчными солями (Фокус).

1. Отвесьте 20 г агара и эмульгируйте в 100 мл холодной дистиллированной воды.

2. Смойте эмульсию в тарированную 2-литровую колбу 500 мл дистиллированной воды.

3. Растворите агар, пропуская острый пар через колбу.

4. Охладите, осветлите яйцом и отфильтруйте.

5. Отвесьте

Sodium taurocholate5 grammes Peptone20 grammes

и добавьте к среде в колбе.

6. Отвесьте

Lactose5 grammes

и добавьте к среде в колбе.

7. Доведите реакцию до +15 и при необходимости отфильтруйте.

8. Отмерьте

Brilliant green, 1 per thousand aqueous solution20 c.c.

и тщательно смешайте с жидким агаром.

9. Отмерьте и добавьте к среде

Picric acid, 1 per cent. aqueous solution20 c.c.

10. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар с китайским зеленым (Вербицкий).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу

Nutrient agar1000 c.c.

2. Точно доведите реакцию до +13 и отфильтруйте.

3. Отмерьте и тщательно смешайте с жидким агаром

China green 0.2 per cent. aqueous solution15 c.c.

4. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар с малахитовым зеленым (Леффлер).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу

Nutrient agar1000 c.c.

2. Отвесьте

Dextrose10 grammes.

и растворите в питательном агаре.

3. Доведите реакцию до +3 и отфильтруйте.

4. Отмерьте и тщательно смешайте в жидком агаре

Malachite green, 0.1 per cent. aqueous solution16 c.c. for "weak" medium.

4a. К отфильтрованному агару добавьте

Malachite green, 2 per cent. aqueous solution25 c.c. for "strong" medium.

5. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Двусахарный агар (Рассел).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу

Nutrient agar1000 c.c.

2. Добавьте 100 мл раствора лакмуса к жидкому агару.

3. Отвесьте и растворите в жидком агаре.

Lactose10 grammes Dextrose10 grammes.

4. Сделайте реакцию среды нейтральной по лакмусовой бумаге путем осторожного добавления нормальной едкой щелочи.

5. Разлейте в пробирки по 10 мл и стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

6. Храните для использования в прохладном темном месте.

B. Diphtheriæ.

Глицериновая кровяная сыворотка.

1. Приготовьте кровяную сыворотку, как описано на стр. 168, разделы с 1 по 4.

2. Добавьте 5-процентный чистый глицерин.

3. Завершите приготовление, как описано выше для обычной кровяной сыворотки, разделы с 5 по 7.

Примечание. Для специальных целей используются различные процентные содержания глицерина — от 4% до 8%. Пять процентов — это обычно используемая концентрация.

Кровяная сыворотка (Леффлер).

1. Приготовьте питательный бульон (см. стр. 163), используя мясной экстракт, приготовленный из телятины вместо говядины.

2. Добавьте 1-процентную глюкозу к бульону и дайте ей полностью раствориться.

3. Теперь добавьте 300 мл прозрачной кровяной сыворотки (см. стр. 168, разделы с 1 по 4) на каждые 100 мл этого бульона.

4. Разлейте в стерильные пробирки и завершите приготовление, как для обычной кровяной сыворотки.

Кровяная сыворотка (Лоррен Смит).

1. Соберите кровяную сыворотку (см. стр. 168, разделы с 1 по 4), по возможности свободную от гемоглобина.

2. Отвесьте 0,15% гидрата натрия и растворите его в жидкости (или добавьте 0,375 мл деканармального раствора соды на каждые 100 мл сыворотки).

3. Разлейте в пробирки и затвердите при 100° C в сывороточном инсписсаторе.

4. Инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов для удаления загрязненных пробирок. Храните остаток для дальнейшего использования.

Кровяная сыворотка (Кансилмен и Мэллори).

1. Соберите кровяную сыворотку на бойне, коагулируйте, удалите сыворотку и разлейте в пробирки (см. стр. 168).

Необходимо соблюдать большую осторожность, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха — действительно, если за один раз наполняется лишь несколько пробирок, хороший способ — поставить их вертикально в приемник воздушного насоса и откачать воздух как можно полнее перед переносом в сывороточный инсписсатор.

2. Нагревайте пробирки в наклонном положении в сухожаровом стерилизаторе при 90° C до полного затвердевания, скажем, полчаса.

3. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение 20 минут в течение трех дней подряд.

Полученная среда не прозрачная, а непрозрачная и твердая.

B. Tuberculosis.

Яичная среда (Лубенау).

Эта модификация яичной среды Дорсета (см. стр. 174) предпочтительнее для некоторых для роста туберкулезной палочки человеческого типа. Она заключается в добавлении одной части 6-процентного глицерина в нормальном физиологическом растворе к яичной смеси между этапами 4 и 5.

Глицериновый бульон.

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 163, sections 1 to 6).

2. Measure out glycerine, 60 c.c. (= 6 per cent.), and add to the bouillon.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как бульон.

Глицериновый агар.

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167, разделы с 1 по 8). Отмерьте 1000 мл.

2. Measure out pure glycerine, 60 c.c. (= 6 per cent.), and add to the agar.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Глицериновая кровяная сыворотка.

1. Приготовьте кровяную сыворотку, как описано на стр. 168, разделы с 1 по 4.

2. Добавьте 5-процентный чистый глицерин.

3. Завершите приготовление, как описано выше для обычной кровяной сыворотки, разделы с 5 по 7.

Примечание. Для специальных целей используются различные процентные содержания глицерина — от 4% до 8%. Пять процентов — это обычно используемая концентрация.

Глицеринизированный картофель.

1. Приготовьте обычные картофельные клинья (см. стр. 174, разделы с 1 по 4).

2. Замочите клинья в 25-процентном растворе глицерина на пятнадцать минут.

3. Увлажните ватные тампоны на дне картофельных пробирок 25-процентным раствором глицерина.

4. Вставьте клин картофеля в каждую пробирку и снова закройте пробирки.

5. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение пяти дней подряд.

Среды из тканей животных (Фругони).

1. Возьмите несколько стерильных пробирок 16 × 3 или 4 см, закрытых ватными пробками, и в каждую вставьте отрезок толстой стеклянной трубки длиной 2 см (диаметром около 1 см); заполните глицериновым (6-процентным) бульоном до верхнего уровня стеклянной трубки. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

2. Убейте небольшого кролика с помощью паров хлороформа.

3. При строгом соблюдении асептики извлеките легкие, печень и другие плотные органы и перенесите их в стерильную двойную стеклянную чашку.

4. С помощью стерильных ножниц и пинцета разделите органы на прямоугольные блоки размером примерно 3 × 1,5 × 1 см.

5. Налейте в чашку достаточное количество стерильного раствора глицерина (6-процентного в нормальном физиологическом растворе), накройте и оставьте на один час.

6. Введите блок ткани в каждую пробирку так, чтобы он опирался на верхний конец стеклянной трубки. (Поверхность ткани теперь будет оставаться влажной за счет капиллярного притяжения и конденсации).

7. Стерилизуйте в автоклаве при 120° C в течение тридцати минут.

8. Закройте пробирки колпачками и храните их в холодильнике для дальнейшего использования.

Ткани, полученные при вскрытии, также могут быть использованы после предварительной стерилизации кипячением или автоклавированием.

Среды для изучения специальных кокков.

Diplococcus GonorrhϾ.

Асцитический бульон (сывороточный бульон).

1. Соберите асцитическую жидкость (плевральную жидкость, жидкость при гидроцеле и т. д.) путем аспирации непосредственно в стерильные колбы при строгом соблюдении асептики.

2. Смешайте сыворотку с двойным объемом стерильного питательного бульона (см. стр. 163).

3. Если считается необходимым (из-за наличия крови, кристаллов и т. д.), отфильтруйте сывороточный бульон через фарфоровую фильтровальную свечу.

4. Разлейте в пробирки и стерилизуйте на водяной бане при 56° C в течение получаса в течение пяти дней подряд.

5. Инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов и удалите загрязненные пробирки. Храните остаток для дальнейшего использования.

Сывороточный агар (Гейман).

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167) по следующей формуле:

Agar2.0 per cent. Peptone1.5 per cent. Salt0.5 per cent. Meat extractquantum sufficit.

2. Доведите реакцию среды до +10.

3. Отфильтруйте; разлейте в пробирки по 6 мл.

4. Стерилизуйте так же, как питательный агар.

5. После третьей стерилизации охладите пробирки до 42° C и добавьте в каждую 3 мл стерильной жидкости гидроцеле, асцитической жидкости или плеврального выпота (предварительно стерилизованных, при необходимости, дробным методом); дайте пробиркам застыть в наклонном положении.

6. После застывания инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов и удалите все загрязненные пробирки. Храните остаток для дальнейшего использования.

Сывороточный агар (Вертхаймер).

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167) по следующей формуле:

Agar2.0 per cent. Peptone2.0 per cent. Salt0.5 per cent. Meat extractquantum sufficit.

2. Доведите реакцию среды до +10.

3. Отфильтруйте; разлейте в пробирки по 5 мл.

4. Стерилизуйте так же, как питательный агар.

5. После последней стерилизации охладите до 42° C, затем добавьте 5 мл стерильной кровяной сыворотки из человеческой плаценты (стерилизованной, при необходимости, дробным методом) в каждую пробирку; наклоните пробирки.

6. После застывания инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов и удалите все загрязненные пробирки. Храните остаток для дальнейшего использования.

Сывороточный агар (Кантаке и Стивенс).

1. Соберите асцитическую, плевральную или гидроцельную жидкость в стерильные колбы и оставьте в холодильнике на двенадцать часов для осаждения.

2. Слейте 1000 мл прозрачной жидкости в мерный цилиндр и перенесите в стерильную литровую колбу.

3. Добавьте 0,5 мл деканармального раствора NaOH на каждые 100 мл сыворотки (т. е. 5,0 мл) и тщательно перемешайте.

4. Нагревайте в паровом стерилизаторе в течение двадцати минут.

5. Отвесьте 15 г агара, эмульгируйте в отдельной емкости с 200 мл щелочной жидкости, предварительно охлажденной примерно до 20° C, а затем добавьте к остатку жидкости в колбе.

6. Пропускайте острый пар через смесь в течение двадцати минут, чтобы растворить агар.

7. Отфильтруйте через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

8. Отвесьте 10 г глюкозы (= 1%) и растворите ее в прозрачном агаре.

8a. If desired, add glycerine, 5 per cent., to the clear agar.

9. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Сывороточный агар (Либман).

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167), используя, однако, 1,5-процентный пептон (то есть 15 г на литр вместо 10 г).

2. Доведите реакцию до 0 (т. е. нейтральную по фенолфталеину).

3. Отфильтруйте и перенесите 1000 мл расплавленной среды в стерильную колбу.

4. Отвесьте 20 г декстрозы и растворите в жидком агаре.

5. Разлейте в пробирки по 6 мл; и стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд.

6. После третьей стерилизации охладите до 42° C и добавьте в каждую пробирку 3 мл стерильной жидкости гидроцеле, асцитической жидкости или плеврального выпота (предварительно стерилизованных, при необходимости, дробным методом); дайте пробиркам застыть в наклонном положении.

7. После застывания инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов и удалите все загрязненные пробирки. Храните остаток для дальнейшего использования.

Яичный альбумин, сгущенный.

1. Разбейте несколько свежих яиц (куриных, утиных или индюшачьих) и соберите «белки» в мерный цилиндр, стараясь избежать смешивания с желтками.

2. Добавьте 40-процентную дистиллированную воду и тщательно перемешайте смесь с помощью венчика для яиц.

3. Отвесьте 0,15% гидрата натрия и растворите его в жидкости (или добавьте количество деканармального раствора едкой щелочи, рассчитанное на получение необходимого процента щелочи в общем объеме жидкости — т. е. 0,375 мл деканармального раствора NaOH на 100 мл смеси).

3a. При желании теперь можно добавить глюкозу в количестве от 1 до 2 процентов.

4. Процедите смесь через марлю и отфильтруйте через фарфоровую фильтровальную свечу в стерильную колбу для фильтрования.

5. Разлейте в пробирки и затвердите при 100° C в сывороточном инсписсаторе.

6. Инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов и удалите все загрязненные пробирки; храните остаток для дальнейшего использования.

Яичный альбумин (Тарханов и Колесников).

1. Поместите неповрежденные куриные яйца в деканармальный раствор едкой щелочи на десять дней. (По истечении этого времени белок становится твердым, как желатин).

2. Осторожно удалите скорлупу и нарежьте яйцо тонкими ломтиками.

3. Промывайте в течение двух часов в проточной воде.

4. Поместите ломтики яйца в большой стакан и стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение одного часа.

5. Перенесите каждый ломтик яйца с помощью пары стерилизованных пинцетов в чашку Петри или большую капсулу.

6. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Бульон с яичным альбумином (Липшюц).

1. Отвесьте

Egg albumin (extra fine powder, Merck).4 grammes

и поместите в 2-литровую колбу с несколькими стерильными стеклянными бусинами.

2. Отмерьте 200 мл дистиллированной воды в полулитровую колбу и нагрейте до 37° C в инкубаторе.

3. Добавьте воду в колбу, содержащую альбумин и бусины, и растворите путем встряхивания.

4. Add n/10-NaOH, 40 c.c. Allow the mixture to stand for thirty minutes with frequent shaking.

5. Отфильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу.

6. Стерилизуйте кипячением два или три раза с интервалом в два часа.

7. Добавьте 600 мл обычного питательного бульона.

8. Разлейте в небольшие колбы Эрленмейера по 50 мл.

9. Инкубируйте в течение сорока восьми часов при 37° C — отбракуйте все загрязненные колбы и храните остаток для дальнейшего использования.

Агар с яичным альбумином.

1. Приготовьте раствор яичного альбумина, как описано выше в пунктах 1-6.

2. Расплавьте и отмерьте 600 мл обычного питательного агара и добавьте к раствору яичного альбумина (вместо питательного бульона).

3. Завершите приготовление, как описано выше в пунктах 8-9.

Diplococcus Meningitidis Intracellularis.

Асцитический агар (Вассерман), синоним N-as-gar (Мервин Гордон).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу:

Nutrient agar600 c.c.

2. Отмерьте в полулитровую колбу

Distilled water210 c.c.

и добавьте к нему

Ascitic fluid90 c.c. Nutrose6 grammes

3. Нагревайте над пламенем Бунзена, постоянно встряхивая, пока жидкость не закипит и нутроза не растворится.

4. Добавьте нутрозно-асцитический раствор к жидкому агару.

5. Нагревайте в паровом стерилизаторе в течение тридцати минут, затем отфильтруйте.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Примечание. Готовая среда в данном случае составляет всего 900 мл, так как при доведении до ровно одного литра были бы введены неудобные дроби.

Diplococcus Pneumoniæ.

Кровяной агар (Уошборн).

1. Расплавьте несколько пробирок с питательным агаром (см. стр. 167) и дайте им застыть в наклонном положении.

2. Поместите пробирки в горизонтальном положении в «горячий» инкубатор на сорок восемь часов, чтобы испарить часть конденсационной воды.

3. Убейте небольшого кролика хлороформом и прибейте его к доске (как для вскрытия). Тщательно смочите шерсть 2-процентным раствором лизола.

4. Стерилизуйте несколько пар пинцетов, ножниц и т. д. кипячением.

5. Откиньте кожу над грудной клеткой с помощью стерильных инструментов.

6. Вскройте грудную полость с помощью нового набора стерильных инструментов.

7. Вскройте перикард другим набором стерильных инструментов.

8. Прижгите поверхность левого желудочка раскаленным железом и извлеките жидкую кровь из сердца с помощью стерильных пипеток (например, тех, что показаны на рис. 13, c).

9. Нанесите небольшое количество крови на наклонную поверхность агара в каждой из пробирок и дайте ей стечь по всей поверхности среды.

10. Поместите пробирки в наклонное положение и дайте крови свернуться.

11. Верните «кровяной агар» в горячий инкубатор на сорок восемь часов и удалите все загрязненные пробирки. Храните остаток для дальнейшего использования.

Питательные среды для изучения бактерий полости рта в целом.

Картофельный желатин (Годби). —

1. Приготовьте глицериновый картофельный бульон (см. стр. 203, разделы 1–5).

2. Добавьте 10% желатина к картофельному отвару и продувайте смесь острым паром в течение десяти минут.

3. Оцените реакцию; доведите реакцию среды до +5.

4. Охладите среду до температуры ниже 60°C, осветлите яичным белком, как для питательного желатина.

5. Профильтруйте через бумагу Шардена.

6. Разлейте по пробиркам и стерилизуйте, как питательный желатин.

Питательные среды для изучения простейших.

Тканевая среда (Ногучи). — Для спирохет (культивирование должно проводиться в анаэробных условиях).

1. Закройте ватными пробками и стерилизуйте пробирки размером 20 × 2 см.

2. Умертвите небольшого кролика парами хлороформа. Вскройте брюшную полость с соблюдением всех правил асептики, извлеките почки и яички и перенесите их в стерильную стеклянную чашку. Нарежьте органы стерильными ножницами на мелкие кусочки — скажем, кубики со стороной 4 миллиметра. Из четырех органов должно получиться от 25 до 30 кусочков ткани.

3. Поместите по одному маленькому кусочку стерильной ткани на дно каждой стерилизованной пробирки.

4. Возьмите колбу, содержащую около 400 см³ питательного агара (реакция +10), расплавьте среду нагреванием и охладите на водяной бане до 50°C.

5. Добавьте 200 см³ асцитической или гидроцельной жидкости (можно использовать сыворотку лошади или овцы, но она менее эффективна) к жидкому агару и осторожно перемешайте, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.

6. Разлейте примерно по 20 см³ асцитического агара в каждую из стерилизованных пробирок, в которых уже находится кусочек стерильной ткани кролика, установите все пробирки вертикально в штативы или банку и дайте агару застыть.

7. После застывания налейте на поверхность среды в каждой пробирке стерильное парафиновое масло слоем 3 сантиметра.

8. Инкубируйте пробирки при 37°C в течение нескольких дней и отбракуйте те, которые оказались загрязненными.

9. Стерильные пробирки сохраните для дальнейшего использования.

XIII. ИНКУБАТОРЫ.

Fig. 113.—Incubator.

Инкубатор (рис. 113) по существу состоит из камеры для размещения культур и т. д., окруженной водяной рубашкой, стенки которой выполнены из металла, обычно меди, а снаружи покрыты асбестовой или войлочной оболочкой либо деревянным кожухом. Вода в рубашке нагревается газом или электричеством и поддерживается при постоянной температуре с помощью терморегулятора. Ячеистый инкубатор (рис. 114), изготовленный для меня [7] несколько лет назад, обладает величайшей практической пользой. Здесь центральная полость разделена пятью двустенными перегородками (в которых циркулирует вода, связанная с водяными резервуарами в верхней и нижней частях инкубатора) и дополнительно железными полками, образующими двадцать четыре ячейки. В каждую из них вставляется железный выдвижной ящик длиной 35 см, шириной 12 см и высотой 22 см, представляющий собой автономный инкубатор. Ящик оснащен деревянной передней панелью, к которой прикреплены ручка и пронумерованная этикетка. В качестве терморегулирующего устройства используется хорошо известная капсула Хирсона.

Fig. 114.—Cellular incubator.

В лаборатории требуется как минимум два инкубатора: один, отрегулированный на поддержание температуры 37°C и известный как «горячий» инкубатор, для культивирования бактерий; другой — на 20–22°C, известный как «прохладный» или «холодный» инкубатор.

Два других инкубатора, отрегулированные на 42°C и 60°C соответственно, хотя и не являются абсолютно необходимыми, очень быстро оправдывают свое приобретение.

Терморегуляторы. — Терморегулятор является наиболее важной частью инкубатора, так как от его эффективной работы зависит поддержание постоянной температуры в камере для культивирования. Он также используется при оснащении водяных и парафиновых бань и для многих других целей.

Fig. 115.—Reichert's thermo-regulator.

Из множества форм и разновидностей терморегуляторов (помимо электрических) только две получили достаточно широкое распространение, чтобы о них стоило упомянуть. В одном из них поток газа к газовой горелке регулируется расширением или сжатием ртути внутри стеклянного баллона; в другом — изменениями положения стенок металлической капсулы, содержащей жидкость, точка кипения которой соответствует температуре, при которой должен работать инкубатор. Это:

(a) Терморегулятор Райхерта (рис. 115), состоящий из баллона с ртутью, который подвешивается в среде (воздухе или воде), температуру которой необходимо регулировать. Газ поступает через А и выходит к горелке через В. По мере повышения температуры ртуть расширяется и перекрывает основной поток газа. По мере понижения температуры ртуть сжимается и вновь открывает узкую трубку С. С помощью винта D (который механически поднимает или опускает столбик ртути независимо от температуры) и термометра прибор можно настроить на поддержание любой желаемой температуры в инкубаторе. Для этой модели требуется специальная газовая горелка с отдельной подачей газа к запальной горелке сбоку.

(b) Капсульный регулятор Хирсона состоит из металлической капсулы, герметично запаянной и заполненной жидкостью, которая кипит при требуемой температуре; он устанавливается внутри инкубатора. К верхней стороне капсулы припаяна толстая металлическая пластина с центральной чашкой для приема нижнего конца жесткого стержня, через который движения стенок капсулы передаются на газовый клапан, закрепленный снаружи инкубатора.

Газовый клапан (регулятор) показан на рисунке 116. А — входное отверстие для газа, С — выходное отверстие к горелке, нагревающей водяную рубашку, B D — рычаг, шарнирно закрепленный на стойках в точке G, на который воздействует капсула через жесткий стержень, входящий в гнездо под винтом P.

Fig. 116.—Capsule thermo-regulator.

Конструкция клапана такова, что всякий раз, когда короткое плечо рычага B D давит на диск под концом B, основная подача газа полностью прекращается. Однако в такие моменты очень небольшое количество газа проходит от А к С через отверстие внутри клапана, размер которого можно регулировать винтовой иглой S, поэтому газовое пламя под инкубатором никогда не гаснет.

Расширение металлических стенок капсулы, происходящее при кипении ее содержимого, создает движущую силу, передаваемую через жесткий стержень для подъема длинного плеча рычага B D. Поскольку это расширение происходит только при заранее определенной температуре, рычаг будет приводиться в действие только при достижении критической температуры, при этом даже при температуре на 1°C ниже той, на которую рассчитана капсула, заметного эффекта не наблюдается.

W — это груз, перемещающийся по рычагу D; при увеличении расстояния между грузом и точкой опоры на стенки капсулы оказывается большее давление, в результате чего точка кипения жидкости в капсуле немного повышается, и таким образом с любой конкретной капсулой можно получить диапазон регулировки около двух градусов.

СНОСКИ:

[7] Made by the firm of Chas. Hearson & Co., 235 Regent St., London, W.

XIV. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ.

Культуры микроорганизмов в лаборатории обычно готовят одним из трех способов:

Tube cultures.

Plate cultures.

Hanging-drop cultures.

Их можно инкубировать либо аэробно (т. е. в присутствии кислорода), либо анаэробно (т. е. в отсутствие кислорода или в присутствии инертного газа, такого как водород, азот или углекислый газ).

Что касается температуры, при которой выращиваются культуры, можно установить общее правило: все среды, затвердевшие при добавлении желатина, инкубируются при 20°C или, во всяком случае, при температуре, не превышающей 22°C (то есть в «холодном» инкубаторе); в то время как жидкие среды и все другие твердые среды инкубируются при 37°C (то есть в «горячем» инкубаторе). Исключений из этого правила много. Например, при изучении роста психрофильных бактерий, дрожжей и плесневых грибов холодный инкубатор используется для всех сред.