«Основы бактериологической техники»

Чтобы сложить фильтр, действуйте следующим образом:

1. Возьмите круглый кусок фильтровальной бумаги и сложите его точно по центру, чтобы образовался полукруг (рис. 100, a).

2. Сложите полукруг точно пополам, чтобы образовался квадрант; сделайте сгиб 2 отчетливым, проведя по нему ногтем большого пальца, затем снова разверните фильтр в полукруг.

3. Сложите каждый конец полукруга к центру и таким образом сформируйте другой квадрант; разгладьте два новых сгиба 3 и 3a, образовавшихся таким образом, и снова разверните в полукруг.

4. Полукруг теперь выглядит как на рисунке 100, a, темные линии указывают на уже сформированные сгибы.

5. Сложите точку 1 к точке 3, а 1a к 3a, чтобы сформировать сгибы 4 и 4a, указанные на диаграмме светлыми линиями. Сложите точку 1 к 3a, а 1a к 3, чтобы сформировать сгибы 5 и 5a.

Fig. 100.—Filter folding: a, Filter folded in half, showing creases; b, appearance of filter on completion of folding; c, filter opened out ready for use.

6. До сих пор все сгибы были сделаны на одной стороне бумаги. Теперь разделите каждый из восьми секторов сгибом через его центр на противоположной стороне бумаги, обозначенным слабыми пунктирными линиями на диаграмме. Постепенно складывайте фильтр по мере того, как делается каждый сгиб, и по завершении фильтр принимает форму клина, как на рисунке 100, b.

При развертывании фильтр принимает форму, представленную на рисунке 100, c.

Сложенный фильтр затем помещается внутрь стеклянной воронки, поддерживаемой на штативе, и смачивается горячей дистиллированной водой перед началом фильтрации среды.

Разжижаемые твердые среды фильтруются через специально изготовленную фильтровальную бумагу — «papier Chardin» — которая продается в коробках по двадцать пять готовых сложенных фильтров.

Fig. 101.—Hot-water filter funnel and ring burner.

Желатин, если он правильно приготовлен, фильтруется через эту бумагу так же быстро, как бульон через шведскую фильтровальную бумагу, и не требует использования воронки с горячей водой.

Агар, аналогично, если он правильно приготовлен, фильтруется легко, хотя и не с такой высокой скоростью, как желатин. Если он плохо «осветлен яйцом», а также в зимние месяцы, необходимо окружить стеклянную воронку, в которой проводится фильтрация агара, рубашкой с горячей водой. Это делается путем помещения стеклянной воронки внутрь медной воронки с двойными стенками — пространство между стенками заполняется водой при температуре около 90° C — и поддержки последней на кольцевой газовой горелке, закрепленной на штативе (рис. 101). Газ зажигается, и водяная рубашка поддерживается при высокой температуре до завершения фильтрации. Если паровой стерилизатор лаборатории достаточно велик, иногда удобнее поместить колбу и фильтровальную воронку внутрь, закрыть стерилизатор и позволить фильтрации происходить в атмосфере живого пара, чем использовать газовую горелку и воронку с горячей водой.

ХРАНЕНИЕ СРЕД В БОЛЬШОМ КОЛИЧЕСТВЕ.

После фильтрации разлейте среду в стерильные литровые колбы с ватными пробками и стерилизуйте в паровом стерилизаторе в течение двадцати минут в течение трех последовательных дней. После третьей стерилизации, и когда колбы и содержимое остынут, обрежьте верхнюю часть ватной пробки вровень с горлышком колбы; протолкните пробку на небольшое расстояние вниз в горлышко колбы и залейте расплавленным парафиновым воском до уровня горлышка. Когда воск застынет, колбы хранят в прохладном темном шкафу для будущего использования.

Fig. 102.—Rubber cap closing store bottle. a, before, and b, after sterilizing.

Этот способ не является абсолютно удовлетворительным, хотя и применяется довольно часто в отдельных случаях; предпочтительнее разливать среду в бутыли из бесцветного стекла с длинным горлышком (емкостью в одну кварту, вмещающие почти 1000 куб. см, подобные тем, в которых продается пастеризованное молоко) и закрывать горлышко специальным резиновым колпачком. Этот колпачок изготовлен из мягкой резины; его нижняя часть, куполообразная с тонкими стенками, надевается на горлышко бутыли (рис. 102, a). Верхняя часть — сплошная, но с острым аккуратным разрезом (сделанным ножом для операций на катаракте или тенотомическим ножом), проходящим полностью через ее ось от центра диска до вершины купола. Во время стерилизации воздух в горлышке бутыли, расширяясь от нагревания, выходит через клапанное отверстие в сплошной части пробки. При извлечении бутыли из паровой камеры жидкость при охлаждении сжимается, и давление наружного воздуха вдавливает сплошную часть резины внутрь горлышка бутыли, плотно прижимая края разреза друг к другу (рис. 102, b). Бутыль, герметизированная таким образом, сохраняет содержимое стерильным в течение неопределенного периода времени без потерь от испарения.

РАЗЛИВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД В ПРОБИРКИ.

После окончательной фильтрации питательную среду обычно «разливают в пробирки» — то есть заполняют ею стерильные пробирки в определенных отмеренных количествах, как правило, по 10 куб. см. Этот процесс иногда осуществляется с помощью большой делительной воронки, снабженной «трехходовым» краном, который сообщается с небольшой градуированной трубкой (емкостью 20 куб. см, градуированной в кубических сантиметрах), прикрепленной сбоку. Форма этого аппарата, известного как воронка Трескова, делает его особенно подверженным повреждениям. Поэтому лучше использовать менее дорогостоящий аппарат, который будет служить той же цели не менее эффективно (рис. 103).

Трехходовой запорный кран Гейсслера имеет трубку с одной стороны крана, скошенную на конце, и трубку с противоположной стороны, обрезанную на расстоянии 3 см от крана. Короткая трубка соединяется с помощью перфорированной резиновой пробки с отрезком толстостенной стеклянной трубки длиной 10 см (диаметром 1,5 см). Третий канал трехходового крана соединяется с помощью резиновой трубки с носиком обычной делительной воронки. Наконец, приемный цилиндр над трехходовым краном градуируется в кубических сантиметрах до 20 путем вливания в него отмеренных количеств воды и нанесения отметок различных уровней снаружи алмазным стеклорезом.

Жидкие среды, содержащие углеводы, разливают в бродильные пробирки (см. рис. 21) или в обычные пробирки для сред, внутри которых уже находятся меньшие перевернутые пробирки (рис. 104) для сбора продуктов жизнедеятельности газообразующих бактерий. При первом заполнении маленькие пробирки плавают на поверхности среды; после первой стерилизации почти весь воздух замещается средой, а после окончательной стерилизации газовые пробирки оказываются погруженными и полностью заполненными средой.

Fig. 103.—Separatory funnel and three-way tap arranged for tubing media.

Fig. 104.—Gas tube (Durham).

Хранение сред в пробирках. — Среды после разливания в пробирки лучше всего хранить в вертикальном положении в продолговатых ящиках с внутренними размерами 37 см в длину, 12 см в ширину и 10 см в глубину. Каждый ящик (рис. 105) имеет подвижную перегородку, образованную вертикальной гранью утяжеленного треугольного деревянного бруска, свободно скользящего по дну (рис. 105, A), или плоским куском дерева, скользящим в металлическом пазу на дне ящика, который можно зафиксировать в любом месте, затянув винт латунного направляющего стержня, проходящего сквозь перегородку (рис. 105, B). Передняя часть ящика снабжена ручкой и целлулоидной этикеткой для названия содержащейся среды. Эти ящики расставляют на полках в темном шкафу — или, что предпочтительнее, в железном сейфе, — который должен быть максимально герметичным, а на его дверцах должна быть надпись «Хранилище сред».

Fig. 105.—Medium box, showing alternative partitions A and B.

СНОСКИ:

[3] Этот резиновый колпачок был изготовлен для меня компанией Holborn Surgical Instrument Co., Thavies Inn, Лондон, W. C.

XI. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

ОБЫЧНЫЕ ИЛИ ОСНОВНЫЕ СРЕДЫ.

Питательный бульон. —

1. Measure out double strength meat extract, 500 c.c., into a litre flask and add 300 c.c. distilled water.

2. Отвесьте 10 граммов пептона Витте (= 1%) и 5 граммов соли (= 0,5%) и разотрите в однородную пасту с 200 куб. см дистиллированной воды, предварительно нагретой до 60° C. (Следите за тем, чтобы не осталось нерастворенных комочков пептона.)

3. Добавьте пептонную эмульсию к мясному экстракту в колбе и нагревайте в паровом стерилизаторе в течение сорока пяти минут (чтобы полностью растворить пептон и сделать кислотность мясного экстракта стабильной).

4. Оцените реакцию среды; проконтролируйте результат; доведите реакцию готовой среды до +10 (см. стр. 155).

5. Нагревайте в течение получаса в паровом стерилизаторе при 100° C (для завершения осаждения фосфатов и т. д.).

6. Профильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу в стерильную колбу.

7. Разлейте в стерильные пробирки (по 10 куб. см в каждую пробирку).

8. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе в течение двадцати минут в течение трех дней подряд — то есть методом дробной стерилизации (см. стр. 35).

Примечание. — В качестве альтернативного метода, когда нет ни свежего, ни замороженного мяса, питательный бульон можно приготовить из коммерческого мясного экстракта следующим образом:

Бульон «Лемко». —

1. Отмерьте 250 куб. см дистиллированной воды в литровую колбу.

2. Отвесьте 10 граммов мясного экстракта «Лемко» Либиха на кусок чистой фильтровальной бумаги и добавьте к воде в колбе. Хорошо встряхните колбу, чтобы получить однородную эмульсию мясного экстракта.

3. Отвесьте пептон Витте (10 граммов) и соль (5 граммов). Разотрите в однородную пасту со 100 куб. см дистиллированной воды, предварительно нагретой до 60° C.

4. Добавьте пептонно-солевую эмульсию к эмульсии мясного экстракта в колбе и добавьте 650 куб. см дистиллированной воды. Нагревайте в паровом стерилизаторе в течение сорока пяти минут.

5. Стандартизируйте среду и завершите приготовление так же, как для питательного бульона.

Питательный желатин. —

1. Взвесьте 2-литровую колбу на технических весах (рис. 106) и запишите вес или тщательно уравновесьте ее.

Fig. 106.—Trip balance.

Чрезвычайно полезным противовесом является небольшой цилиндр из листовой латуни высотой около 38 мм и диаметром 38 мм с воронкообразной верхней частью и боковой трубкой, через которую можно высыпать содержимое — мелкую дробь (рис. 107).

Fig. 107.—Counterpoise; weight when empty, 35 grammes; when full of dust shot, 200 grammes.

2. Measure out double strength meat extract, 500 c.c., into the "tared" flask.

3. Отвесьте и смешайте 10 граммов пептона, 5 граммов соли и сделайте густую пасту со 150 куб. см дистиллированной воды; затем добавьте эмульсию к мясному экстракту в колбе; также добавьте 100 граммов листового желатина, нарезанного на мелкие кусочки; поместите колбу на водяную баню и доведите до кипения.

Fig. 108.—Arrangement of steam can and water-bath for the preparation of media.

4. Установите 5-литровую жестяную банку (с медным дном, подобную тем, что используются при получении дистиллированной воды) рядом с водяной баней, наполните банку кипящей водой и поместите под нее зажженную горелку Бунзена. Присоедините длинную предохранительную трубку к горлышку банки, а также отводную трубку, изогнутую под прямым углом дважды; отрегулируйте трубку так, чтобы она достигала дна внутри колбы, содержащей желатин и т. д. (рис. 108).

5. Поддерживайте воду в паровой банке в состоянии энергичного кипения, чтобы пар при 100° C барботировал через массу среды в течение десяти минут, к концу этого времени достигается полное растворение желатина. Некоторое количество пара сконденсируется в виде воды в колбе со средой во время этого процесса — отсюда необходимость использования мясного экстракта двойной концентрации, — но если водяная баня будет кипеть, эта конденсация не превысит 100 куб. см.

6. Взвесьте колбу с содержимым; тогда (1115 [4] граммов + вес колбы) минус (вес колбы с содержимым) равно весу воды, необходимой для доведения объема до 1 литра. Добавление необходимого количества воды осуществляется следующим образом:

На одну чашку технических весов поместите противовес тарированной колбы (или эквивалентные ему гири) вместе с гирями, составляющими рассчитанный вес среды. На противоположную чашку поместите колбу с массой среды. Теперь добавляйте кипящую дистиллированную воду из промывалки, пока чашки не придут в точное равновесие.

7. Оттитруйте и оцените реакцию массы среды; проконтролируйте результат. Рассчитайте количество раствора соды, необходимое для доведения реакции массы среды до +10 (то есть рассчитайте для 1000 куб. см за вычетом количества, использованного для титрования).

8. Добавьте необходимое количество раствора соды и нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут для осаждения фосфатов и т. д.

9. Дайте массе среды остыть до 60° C. Хорошо взбейте белки двух яиц, добавьте к содержимому колбы и снова поместите в паровой стерилизатор при 100° C примерно на полчаса (пока яичный альбумин не свернется и не образует крупные плотные массы, плавающие на поверхности и внутри прозрачного желатина).

10. Профильтруйте через бумагу Шардена в стерильную колбу.

11. Разлейте в пробирки по 10 куб. см.

12. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд — то есть методом дробной стерилизации.

Питательный агар-агар. —

1. Взвесьте 2-литровую колбу и запишите вес — или точно уравновесьте ее.

2. Measure out double strength meat extract, 500 c.c., into the "tared" flask.

3. Отвесьте и смешайте 10 граммов пептона, 5 граммов соли и 20 граммов порошкообразного агара, сделайте густую пасту со 150 куб. см дистиллированной воды и добавьте к мясному экстракту в колбе; поместите колбу на водяную баню.

4. Установите паровую баню и водяную баню, как уже было указано (для приготовления желатина) и показано на рисунке.

5. Пропускайте живой пар (при 100° C) через массу среды в течение двадцати пяти минут, к концу этого времени достигается полное растворение агара.

6. Теперь взвесьте колбу с содержимым; тогда (1035 [5] граммов + вес колбы) минус (вес колбы с содержимым) равно весу воды, необходимой для доведения объема среды до 1 литра. Добавьте необходимое количество (см. приготовление желатина, стр. 166, шаг 6).

7. Оттитруйте и оцените реакцию массы среды; проконтролируйте результат. Рассчитайте количество раствора соды, необходимое для доведения реакции массы среды до +10 (то есть рассчитайте для 1000 куб. см за вычетом количества, использованного для титрования).

8. Добавьте необходимое количество раствора соды и снова поместите в паровой стерилизатор на двадцать минут (для завершения осаждения фосфатов и т. д.).

9. Дайте массе среды остыть до 60° C. Хорошо взбейте белки двух яиц, добавьте к содержимому колбы и снова поместите в паровой стерилизатор при 100° C примерно на один час (пока яичный альбумин не свернется и не образует крупные плотные массы, плавающие на поверхности и внутри прозрачного агара).

10. Профильтруйте через бумагу Шардена, при необходимости используя воронку с горячей водой (рис. 101), в стерильную колбу.

11. Разлейте в пробирки по 10 или 15 куб. см.

12. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд — то есть методом дробной стерилизации.

Кровяная сыворотка (свернутая). —

1. Стерилизуйте цилиндрический стеклянный сосуд (рис. 109) и его крышку сухим жаром или путем промывания сначала эфиром, затем спиртом, и высушивания.

2. Соберите кровь на бойне от быка или овцы в стерильный цилиндр.

3. Дайте сосуду постоять пятнадцать минут, чтобы кровь свернулась. (Это необходимо сделать до ухода с бойни, иначе сыворотка окрасится гемоглобином.)

4. Отделите сгусток от стенок сосуда с помощью стерильной стеклянной палочки (выход сыворотки значительно меньше, если этого не сделать) и поместите цилиндр в ледник на двадцать четыре часа.

5. Удалите сыворотку стерильными пипетками или слейте ее через сифон и разлейте в стерильные пробирки (по 5 куб. см в каждую) или колбы.

6. Нагревайте пробирки с сывороткой до 56° C на водяной бане в течение получаса в течение двух дней подряд.

7. На третий день нагревайте пробирки в наклонном положении в аппарате для свертывания сыворотки до температуры около 72° C. (При этой температуре образуется сгусток, который довольно прозрачен; выше 72° C образуется плотный мутный сгусток.)

Fig. 109.—Blood-serum jar with wicker basket for transport.

Аппарат для свертывания сыворотки (рис. 110) в своей простейшей форме представляет собой прямоугольный медный ящик с двойными стенками, закрытый неплотной стеклянной крышкой и обшитый войлоком или асбестом — пространство между стенками заполнено водой. Аппарат опирается на регулируемые ножки, чтобы сыворотку можно было затвердеть под любым желаемым углом, и нагревается снизу горелкой Бунзена, управляемой терморегулятором. Более сложные формы по форме напоминают сушильный шкаф (рис. 26) и снабжены регулируемыми полками, так что можно получить любой желаемый наклон поверхности сыворотки.

8. Поместите пробирки в термостат при 37° C на сорок восемь часов, чтобы исключить те, которые были загрязнены. Храните остальные в прохладном месте для будущего использования.

Альтернативный метод.

Шаги 1-5, как указано выше.

6. Стерилизуйте сыворотку дробным методом — то есть путем воздействия на водяной бане при температуре 56° C в течение получаса в течение шести дней подряд; храните в жидком состоянии.

7. Сверните в аппарате для свертывания сыворотки при необходимости.

Fig. 110.—Serum inspissator.

Сывороточная вода. —

Она составляет основу многих полезных сред и готовится следующим образом:

1. Соберите кровь на бойне (см. стр. 168) и, когда она плотно свернется, соберите всю выделившуюся сыворотку и измерьте в градуированном цилиндре.

2. На каждые 100 куб. см сыворотки добавьте 300 куб. см дистиллированной воды и смешайте в колбе.

3. Нагревайте смесь в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут. (Это разрушает любой диастатический фермент, присутствующий в сыворотке, и частично стерилизует жидкость.)

4. Профильтруйте, если смесь мутная.

5. Если она не нужна сразу, завершите стерилизацию сывороточной воды двумя последующими пропариваниями при 100° C в течение двадцати минут с интервалом в двадцать четыре часа.

Цитратный кровяной агар. Больница Гая. —

1. Умертвите небольшого кролика парами хлороформа и прикрепите его к доске (как для вскрытия); тщательно смочите шерсть 2-процентным раствором лизола.

2. Стерилизуйте несколько пар пинцетов, ножниц и т. д. путем кипячения.

3. Откиньте кожу с грудной клетки стерильными инструментами.

4. Вскройте грудную полость с помощью нового набора стерильных инструментов.

5. Вскройте перикард другим набором стерильных инструментов.

6. Прижгите поверхность левого желудочка раскаленным железом.

7. Возьмите стерильную капиллярную пипетку (рис. 13, c); отломите запаянный конец парой стерильных пинцетов.

8. Зафиксируйте сердце пинцетом и проткните кончиком пипетки стенку желудочка через прижженную область, примените всасывание к закрытому ватой концу пипетки и наполните ее кровью.

9. Перенесите все количество крови, собранной из сердца кролика, в небольшую колбу Эрленмейера, содержащую несколько стерильных стеклянных бусин и 5 куб. см концентрированного раствора цитрата натрия. (См. стр. 378.)

10. Тщательно перемешайте и отставьте на пару часов.

11. Расплавьте несколько пробирок с питательным агаром (см. стр. 167) и охладите до 42° C.

12. С помощью стерильной градуированной пипетки на 10 куб. см перенесите 1 куб. см цитратной крови из колбы Эрленмейера в каждую пробирку с разжиженным агаром. Вращайте пробирку между ладонями, чтобы равномерно распределить цитратную кровь по всему агару.

13. Поместите пробирки в наклонное положение и дайте среде застыть.

14. Поместите пробирки с кровяным агаром на сорок восемь часов в термостат при 37° C и по истечении этого времени удалите все загрязненные пробирки.

15. Храните оставшиеся стерильными пробирки для будущего использования.

Молоко. —

1. Налейте 1 литр свежего коровьего или козьего молока в большую делительную воронку и нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение одного часа.

2. Извлеките из стерилизатора и оцените реакцию молока (нормальное коровье молоко в среднем имеет +17). Если кислотность выше +20 или ниже +10, отбракуйте этот образец молока и используйте другую партию молока из другого источника.

Отбраковывайте молоко, в которое были добавлены антисептики в качестве консервантов.

3. Дайте молоку остыть, после чего жир или сливки поднимутся на поверхность и образуют толстый слой.

4. Слейте обезжиренное молоко, находящееся под слоем жира, в стерильные пробирки (по 10 куб. см в каждую).

5. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение пяти дней подряд.

6. Инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов и удалите все загрязненные пробирки. Храните остальные для будущего использования.

Лакмусовое молоко. —

1. Подготовьте молоко, как описано выше, разделы 1–3.

2. Слейте обезжиренное молоко, находящееся под слоем жира, в колбу.

3. Добавьте стерильный раствор лакмуса в количестве, достаточном для окрашивания молока в глубокий лавандовый цвет.

4. Разлейте в пробирки, стерилизуйте и т. д., как для молока.

Нутрозо-агар (Эйр). —

(Это модификация хорошо известной среды Дригальского-Конради, первоначально предложенной для выделения B. typhosus).

1. Соберите 250 куб. см совершенно свежей бычьей сыворотки (см. Кровяная сыворотка, стр. 168, шаги 1–5) и добавьте к ней 450 куб. см стерильной дистиллированной воды.

2. Weigh out agar powder, 20 grammes, and emulsify it with 250 c.c. of the cold serum water.

3. Отвесьте

Witté's peptone10 grammes Sodium chloride5 grammes Nutrose10 grammes

и растворите в 200 куб. см сывороточной воды, нагретой до 80° C.

4. Смешайте агаровую эмульсию и пептонно-нутрозный раствор в «тарированной» колбе емкостью 2 литра и добавьте еще 100 куб. см сывороточной воды.

5. Завершите растворение различных ингредиентов путем барботирования живого пара через колбу, как при приготовлении питательного агара.

6. Добавьте еще 250 куб. см сывороточной воды.

7. Взвесьте колбу с содержимым: тогда (1045 граммов + вес колбы) минус (вес колбы с текущим содержимым) = вес жидкости, необходимой для доведения объема среды до 1 литра. Добавьте необходимое количество стерильной дистиллированной воды.

8. Оттитруйте и оцените реакцию массы среды. Затем стандартизируйте до реакции +2,5.

9. Осветлите яйцом и профильтруйте, как для питательного агара. (При осветлении после добавления яичного белка смесь должна находиться в паровом стерилизаторе полные два часа.)

10. После завершения фильтрации измерьте фильтрат и на каждые 150 куб. см среды добавьте:

Litmus solution (Kahlbaum)20 c.c. Krystal violet aqueous solution (1:1000) (B. Hoechst)1.5 c.c. Lactose1.5 grammes

11. Разлейте в пробирки по 15 куб. см.

12. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд — то есть методом дробной стерилизации в течение трех дней.

Яичная среда (Дорсет). —

1. Приготовьте 1000 куб. см 0,85-процентного раствора хлорида натрия в прочной 2-литровой колбе.

2. Стерилизуйте в автоклаве при 120° C в течение двадцати минут. Охладите до 20° C.

3. Возьмите 12 свежих яиц; промойте скорлупу сначала водой, затем неразбавленным формалином: дайте скорлупе высохнуть.

4. Разбейте яйца в стерильный градуированный цилиндр и измерьте общий объем смешанных белков и желтков. Добавьте одну часть стерильного физиологического раствора к трем частям смешанных яиц.

5. Перенесите эту смесь в большую бутыль с широким горлышком и пробкой, предварительно стерилизованную. Добавьте стерильные стеклянные бусины и тщательно встряхивайте в механическом шейкере около тридцати минут или взбейте венчиком для яиц.

6. Профильтруйте через грубую кисею в стерильную колбу.

Примечание. — Несколько капель спиртового раствора основного фуксина (достаточно, чтобы придать определенный розовый цвет) или несколько капель водостойких китайских чернил, добавленных в среду на этом этапе, облегчают последующий «вылов» колоний.

7. Разлейте в пробирки по 10 куб. см.

8. Затвердите в наклонном положении в аппарате для свертывания сыворотки при 75° C в течение одного часа.

9. Поместите пробирки на сорок восемь часов в термостат при 37° C и удалите все загрязненные пробирки.

Чтобы предотвратить высыхание, в каждую пробирку между шагами 8 и 9 можно добавить 0,5 куб. см глицеринового бульона (см. стр. 209).

10. Закройте те пробирки со средами, которые остались стерильными, резиновыми колпачками и храните для будущего использования.

Картофель. —

1. Выберите довольно крупные картофелины, хорошо их вымойте и очистите кожуру жесткой щеткой для ногтей.

2. Очистите от кожуры и удалите глазки.

3. Вырежьте цилиндры из самого длинного диаметра каждой картофелины с помощью выемки для яблок или большого пробкового сверла (то есть диаметром около 1,4 см).

Реакция свежего картофеля сильно кислая по отношению к фенолфталеину. Поэтому, если требуется, чтобы картофель имел реакцию, близкую к +10, как для культивирования некоторых вибрионов, цилиндры следует вымочить в 1-процентном растворе карбоната натрия в течение тридцати минут.

4. Разрежьте каждый цилиндр по диагонали от конца до конца, образуя две клиновидные части.

5. Поместите небольшой кусочек стерильной ваты, смоченной стерильной водой, на дно стерильной пробирки; вставьте картофельный клин в пробирку так, чтобы его основание опиралось на вату. Теперь закройте пробирку ватной пробкой (рис. 111).

6. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение пяти дней подряд.

Fig. 111.—Potato tube.

Примечание. — Пробковое сверло, предназначенное для нарезки картофельных цилиндров, должно быть посеребрено как внутри, так и снаружи, а нож, используемый для деления цилиндров, должен быть серебряным или посеребренным. При соблюдении этих мер предосторожности картофельные клинья сохранят свой белый цвет и не будут иметь обесцвечивания, которое так часто наблюдается при использовании стальных инструментов.

Пивное сусло. — Сусло в основном используется в качестве среды для культивирования дрожжей, плесневых грибов и т. д., как в жидкой форме, так и в твердой, полученной путем добавления желатина или агара. Сусло готовится следующим образом:

1. Отвесьте 250 граммов дробленого солода и поместите в 2-литровую колбу.

2. Добавьте 1000 куб. см дистиллированной воды, нагретой до 70° C, и закройте колбу резиновой пробкой.

3. Поместите колбу на водяную баню, отрегулированную на 60° C, и дайте мацерации продолжаться в течение одного часа.

4. Процедите через кисею в чистую колбу и нагревайте в паровом стерилизаторе в течение тридцати минут.

5. Профильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу.

6. Разлейте в пробирки по 10 куб. см или храните в колбах.

7. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Естественная реакция сусла не должна нарушаться.

Примечание. — Иногда удобнее получать «неохмеленное» [6] пивное сусло непосредственно с пивоварни. В этом случае его разбавляют равным количеством дистиллированной воды, пропаривают в течение часа, фильтруют, разливают в стерильные колбы или пробирки и стерилизуют методом дробной стерилизации.

Сусло-желатин. —

1. Measure out wort (prepared as above), 900 c.c., into a sterile flask.

2. Weigh out gelatine, 100 grammes (= 10 per cent.), and add it to the wort in the flask.

3. Пропускайте живой пар через смесь в течение десяти минут, чтобы растворить желатин.

4. Охладите до 60° C; осветлите яйцом, как для питательного желатина (см. стр. 164).

5. Профильтруйте через бумагу Шардена.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для питательного желатина.

Сусло-агар. —

1. Measure out wort (as above), 700 c.c., into a sterile flask.

2. Отвесьте 20 граммов порошкообразного агара; разотрите в однородную пасту с 200 куб. см холодного сусла и добавьте к суслу в колбе.

3. Пропускайте живой пар через смесь в течение двадцати минут, чтобы растворить агар.

4. Охладите до 60° C; осветлите яйцом, как для питательного агара (см. стр. 167).

5. Профильтруйте через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для питательного агара.

Пептонная вода (Данхэм). —

1. Отвесьте 10 граммов пептона Витте и 5 граммов соли и эмульгируйте примерно с 250 куб. см дистиллированной воды, предварительно нагретой до 60° C.

2. Вылейте эмульсию в литровую колбу и доведите объем до 1000 куб. см добавлением дистиллированной воды.

3. Нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут.

4. Профильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу.

5. Разлейте в пробирки по 10 куб. см в каждую.

6. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

«Сахарные» или «углеводные» среды. —

Ранее способность бактерий вызывать гидролитические изменения в углеводных веществах наблюдалась только в связи с несколькими хорошо изученными сахарами, но в последние годы было показано, что при использовании лакмуса в качестве индикатора эти так называемые «реакции брожения» облегчают дифференциацию близкородственных видов, и список веществ, используемых в этой связи, был значительно расширен. Среды, приготовленные с ними, теперь больше не считаются специальными, а включены в «основные среды» лаборатории. Основными из этих веществ являются следующие, расположенные в соответствии с их химическим строением:

MonosaccharidesDextrose (glucose), lævulose, galactose, mannose, arabinose, xylose. DisaccharidesMaltose, lactose, saccharose. TrisaccharidesRaffinose (mellitose). PolysaccharidesDextrin, inulin, starch, glycogen, amidon. GlucosidesAmygdalin, coniferin, salicin, helicin, phlorrhizin.

Polyatomic alcoholsTrihydric, Glycerin. Tetrahydric, Erythrite. Pentahydric, Adonite. Hexahydric, Dulcite, (dulcitol or melampirite), isodulcite (rhamnose), mannite (mannitol), sorbite (sorbitol), inosite.

Эти вещества следует приобретать у Kahlbaum (Берлин); в чистом виде и, по возможности, в виде крупных кристаллов, а метод приготовления среды, содержащей любое из них, можно проиллюстрировать на примере раствора декстрозы.

Раствор декстрозы. —

1. Отвесьте

Peptone20 grammes Glucose10 grammes

и разотрите вместе в ступке; затем эмульгируйте в 100 куб. см дистиллированной воды, нагретой до 60° C.

2. Поместите в колбу и добавьте

Distilled water850 c.c.

3. Пропарьте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут, чтобы растворить пептон и глюкозу.

4. Добавьте

Kubel-Tiemann litmus solution (Kahlbaum)50 c.c.

(Перечисленные выше вещества реагируют кисло по отношению к фенолфталеину, но по-разному по отношению к нейтральному раствору лакмуса. К тем, которые реагируют кисло, очень осторожно добавляйте раствор n/1 гидрата натрия к среде в общем объеме, пока не вернется нейтральный оттенок).

5. Разлейте в пробирки, в которые предварительно были помещены перевернутые газовые пробирки Дарема.

6. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Примечание. — Ни в коем случае нельзя стерилизовать эти среды в автоклаве, так как температуры выше 100° C сами по себе вызывают гидролитические изменения в рассматриваемых веществах. Не менее важно не превышать двадцати минут при стерилизации, так как пренебрежение этой мерой предосторожности может обесцветить лакмус или привести к появлению желтоватых оттенков, когда пробирки впоследствии будут инокулированы кислотообразующими бактериями.

Нейтральный раствор лакмуса.

Наиболее удовлетворительным является раствор Кубеля-Тиманна, приготовленный Kahlbaum. Однако его можно приготовить в лаборатории следующим образом:

1. Отвесьте

Commercial litmus50 grammes,

и поместите в бутыль с хорошо притертой пробкой емкостью 500 куб. см; отмерьте и добавьте 300 куб. см 95-процентного спирта.

2. Хорошо встряхивайте не реже одного раза в день в течение семи дней — спирт приобретает зеленый цвет.

3. Слейте зеленый спирт, налейте в бутыль еще 300 куб. см 95-процентного спирта и повторите встряхивание.

4. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока при добавлении свежего спирта жидкость не будет окрашиваться лишь в фиолетовый цвет.

5. Слейте спирт, оставив лакмус как можно более сухим. Подсоедините бутыль к воздушному насосу и выпарьте последние следы спирта.

6. Перенесите сухой лакмус в литровую колбу, отмерьте 600 куб. см дистиллированной воды и оставьте в контакте на 24 часа при частом встряхивании.

7. Профильтруйте раствор в чистую колбу и добавьте одну или две капли чистой концентрированной серной кислоты, пока раствор лакмуса не станет отчетливо винно-красного цвета.

8. Добавьте избыток чистой твердой бариты и дайте постоять, пока реакция снова не станет щелочной.

9. Профильтруйте.

10. Пропускайте CO2 через раствор, пока реакция не станет определенно кислой.

11. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд. Это стерилизует раствор, а также удаляет углекислый газ, оставляя раствор нейтральным.

Среды для анаэробных культур. В дополнение к вышеуказанным средам, все из которых могут быть и используются при культивировании анаэробных бактерий, для этой цели обычно используются некоторые специальные среды, содержащие легко окисляющиеся вещества. Основными из них являются следующие:

Бульон с желчными солями (МакКонки). —

1. Отвесьте 20 граммов пептона Витте (= 2%) и эмульгируйте с 200 куб. см дистиллированной воды, предварительно нагретой до 60° C.

2. Отвесьте 5 граммов таурохолата натрия (коммерческого) (= 0,5%) и 5 граммов глюкозы (= 0,5%) и растворите в пептонной эмульсии.

3. Перенесите пептонную эмульсию в колбу с 800 куб. см дистиллированной воды и нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут.

4. Профильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу в стерильную колбу.

5. Добавьте стерильный раствор лакмуса в количестве, достаточном для окрашивания среды в глубокий пурпурный цвет, обычно требуется 13%.

6. Разлейте по 10 куб. см в пробирки, содержащие маленькие газовые пробирки (см. рис. 104, стр. 161). Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Глюкозо-формиатный бульон (Китасато). —

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 163, sections 1 to 6).

2. Отвесьте 20 граммов глюкозы (= 2%) и 4 грамма формиата натрия (= 0,4%) и растворите в жидкости.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для бульона.

Глюкозо-формиатный желатин (Китасато). —

1. Приготовьте питательный желатин (см. стр. 164, разделы 1–7) и отмерьте 1000 куб. см.

2. Отвесьте 20 граммов глюкозы (= 2%) и 4 грамма формиата натрия (= 0,4%) и растворите в горячем желатине.

3. Профильтруйте через бумагу Шардена.

4. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для питательного желатина.

Глюкозо-формиатный агар (Китасато). —

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167, разделы 1–8). Отмерьте 1000 куб. см.

2. Weigh out glucose, 20 grammes (= 2 per cent.), sodium formate, 4 grammes (= 0.4 per cent.), and dissolve in the agar.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для питательного агара.

Сульфиндиготатный бульон (Вейль). —

1. Отмерьте 1000 куб. см питательного бульона (см. стр. 163, разделы 1–6).

2. Отвесьте 20 граммов глюкозы (= 2%) и 1 грамм сульфиндиготата натрия (= 0,1%) и растворите в жидкости.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для бульона.

Сульфиндиготатный желатин (Вейль). —

1. Приготовьте питательный желатин (см. стр. 164, разделы 1–7). Отмерьте 1000 куб. см.

2. Отвесьте 20 граммов глюкозы (= 2%) и 1 грамм сульфиндиготата натрия (= 0,1%) и растворите в горячем желатине.

3. Профильтруйте через бумагу Шардена.

4. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для питательного желатина.

Сульфиндиготатный агар. —

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167, разделы 1–8). Отмерьте 1000 куб. см.

2. Отвесьте 20 граммов глюкозы (= 2%) и 1 грамм сульфиндиготата натрия (= 0,1%) и растворите в горячем агаре.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для питательного агара.

Примечание. — Сульфиндиготатные среды имеют синий цвет, который во время роста анаэробных бактерий окисляется и обесцвечивается до светло-желтого.

СНОСКИ:

[4] Эта цифра получена путем сложения: 1 литр воды, 1000 граммов; 10-процентный желатин, 100 граммов; 1-процентный пептон, 10 граммов; 0,5-процентная соль, 5 граммов; итого 1115 граммов. Модификации вышеуказанного процесса в отношении количеств и процентов потребуют соответствующих изменений цифр. Средний вес измеренного литра 10-процентного питательного желатина, приготовленного таким образом после фильтрации, составляет 1080 граммов.

[5] Эта цифра получена путем сложения: 1 литр воды (мясной экстракт), 1000 граммов; 2-процентный агар, 20 граммов; 1-процентный пептон, 10 граммов; 0,5-процентная соль, 5 граммов — итого 1035 граммов. Модификации процесса в отношении количеств или процентов потребуют соответствующих изменений в рассчитанной цифре среды. Средний вес измеренного литра 2-процентного агара, приготовленного таким образом после фильтрации, составляет 1010,5 граммов.

[6] «Охмеленное» сусло оказывает токсическое действие на многие бактерии, включая молочнокислые бактерии.

XII. СПЕЦИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

В этой главе собраны среды, которые были разработаны различными исследователями для специальных целей, сгруппированные под заголовками, указывающими на их основное назначение. Во многих случаях приводится имя автора среды, но без ссылки на его оригинальные инструкции, поскольку они во многих случаях неадекватны требованиям отдельного исследователя, который, вероятно, не смог бы воспроизвести среду в форме, дающей результаты, приписываемые ей автором. Поэтому были внесены такие модификации, которые способствуют единообразию между различными партиями сред.

Было включено значительное количество цветных сред, предназначенных главным образом для работы с кишечными бактериями; но, за исключением того факта, что модификация автором среды Дригальского-Конради была включена в число рутинных сред лаборатории, никаких комментариев относительно их относительной ценности не приводилось, поскольку только путем наблюдения и практики можно приобрести навыки, необходимые для использования их полной ценности.

Инструкции по стерилизации редко даются в полном объеме; необходимо выполнять рутинный метод воздействия в паровом стерилизаторе при 100° C (без давления) в течение двадцати минут в течение трех дней подряд для всех жидких сред и тридцати минут в течение трех дней подряд для всех разжижаемых или твердых сред; и только когда необходимо отступить от этих общих правил, приводятся дополнительные детали.

Среды для изучения химического состава бактерий.

Аспарагиновая среда (Ушинского). —

1. Отвесить и смешать

Asparagin3.4 grammes Ammonium lactate10.0 grammes Sodium chloride5.0 grammes Magnesium sulphate0.2 gramme Calcium chloride0.1 gramme Acid potassium phosphate (KH2PO4)1.0 gramme

2. Растворить смесь в 1000 см³ дистиллированной воды.

3. Add glycerine, 40 c.c.

4. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Аспарагиновая среда (Френкеля и Фогеса). —

1. Отвесить и смешать

Asparagin4 grammes Sodium phosphate, (Na2HPO4) 12OH2 grammes Ammonium lactate6 grammes Sodium chloride5 grammes

и растворить в

Distilled water1000 c.c.

2. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Примечание. — Любую из вышеуказанных аспарагиновых сред после добавления 10% желатина или 1,5% агара можно с успехом использовать в твердом состоянии.

Безбелковый бульон (Ушинского). —

1. Отвесить и смешать

Calcium chloride0.1 gramme Magnesium sulphate0.2 gramme Acid potassium phosphate (KH2PO4)2.0 grammes Potassium aspartate3.0 grammes Sodium chloride5.0 grammes Ammonium lactate6.0 grammes

2. Растворить смесь в 1000 см³ дистиллированной воды.

3. Добавить 30 см³ глицерина.

4. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Среды для изучения биохимических реакций.

Среды, свободные от инозита — Бульон (Дарема). —

1. Prepare meat extract, 1000 c.c. (vide page 148), from bullock's heart which has been "hung" for a couple of days.

2. Prepare nutrient bouillon (+10), 1000 c.c. (vide, page 161), from the meat extract, and store in 1-litre flask.

3. Инокулировать бульон чистой культурой B. lactis aerogenes и инкубировать при 37° C в течение сорока восьми часов.

4. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут для уничтожения бацилл и некоторых продуктов их жизнедеятельности.

5. Определить реакцию среды и при необходимости довести ее до +10.

6. Инокулировать бульон чистой культурой B. coli communis и инкубировать при 37° C в течение сорока восьми часов.

7. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут.

Теперь наполнить бульоном две бродильные пробирки, подкрасить раствором лакмуса и стерилизовать; инокулировать культурой B. lactis aerogenes. Если кислота или газ не образуются, значит, бульон не содержит сахара; если же присутствуют кислота или газ, снова довести реакцию бульона в колбе до +10, повторно инокулировать одной из вышеупомянутых бактерий и инкубировать; затем снова провести проверку. Повторять это до тех пор, пока в среде не перестанут появляться кислота или газ при культивировании любой из указанных выше бацилл.

8. После последнего нагревания поставить колбу в прохладное место и дать росту осесть. Профильтровать надосадочную жидкость через шведскую фильтровальную бумагу. Если фильтрат мутный, профильтровать через фарфоровую фильтровальную свечу.

9. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как бульон.

Бульон, приготовленный описанным выше способом, будет абсолютно свободен от сахара; на его основе можно приготовить питательный безсахарный желатин или агар, растворив в нем требуемый процент желатина или агара соответственно и доведя среду до готовности согласно указаниям на страницах 166 и 167. Наиболее важное применение безсахарного бульона — использование его для приготовления сахарных бульонов (глюкозного, мальтозного, лактозного или сахарозного) с точным процентным содержанием компонентов.

Сахарный (декстрозный) бульон. —

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 163, sections 1 to 6) or sugar-free bouillon (vide supra).

2. Weigh out glucose (anhydrous), 20 grammes (= 2 per cent.), and dissolve in the fluid.

3. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как бульон.

Обычная коммерческая глюкоза подходит для этой цели так же хорошо, но не рекомендуется, поскольку в процессе стерилизации она вызывает постепенное потемнение среды.

Примечание. — В некоторых случаях вместо глюкозы берется соответствующий процент лактозы, мальтозы или сахарозы.

Сахарный желатин. —

1. Приготовить питательный желатин (см. стр. 164, разделы 1–7). Отмерить 1000 см³.

2. Weigh out glucose, 20 grammes (= 2 per cent.), and dissolve in the hot gelatine.

3. Профильтровать через бумагу Шардена.

4. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный желатин.

Сахарный агар. —

1. Приготовить питательный агар (см. стр. 167, разделы 1–8). Отмерить 1000 см³.

2. Weigh out glucose, 20 grammes (= 2 per cent.), and dissolve in the clear agar.

3. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный агар.

Примечание. — Другие «сахарные» среды готовятся путем замены глюкозы соответствующим процентом лактозы, мальтозы (или любого другого вещества, упомянутого в разделе «Сахарные среды» на стр. 177).

Железистый бульон. —

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 141, sections 1 to 6).

2. Weigh out ferric tartrate, 1 gramme (= 0.1 per cent.), and dissolve it in the bouillon.

3. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как бульон.

Примечание. — Вместо тартрата можно использовать лактат железа.

Свинцовый бульон. —

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 163, sections 1 to 6).

2. Weigh out lead acetate, 1 gramme (= 0.1 per cent.), and dissolve it in the bouillon.

3. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как бульон.

Нитратный бульон. —

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 163, sections 1 to 6).

2. Weigh out potassium nitrate, 5 grammes (= 0.5 per cent.), and dissolve it in the bouillon.

3. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как бульон.

Примечание. — Вместо нитрата калия можно использовать нитрат натрия или аммония, либо соль можно добавлять в пропорции от 0,1 до 1% для удовлетворения особых требований.

Железо-пептонный раствор (Пейкса). —

1. Weigh out peptone, 30 grammes, and emulsify it with 200 c.c. tap water, previously heated to about 60°C.

2. Смыть эмульсию в литровую колбу 800 см³ водопроводной воды.

3. Weigh out salt, 5 grammes, and sodium phosphate, 3 grammes, and dissolve in the mixture in the flask.

4. Нагревать смесь в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут для полного растворения пептона и профильтровать в чистую колбу.

5. Разлить по пробиркам порциями по 10 см³.

6. Добавить в каждую пробирку 0,1 см³ 2% нейтрального раствора тартрата железа. (Образуется желтовато-белый осадок.)

7. Стерилизовать так же, как питательный бульон.

Свинцово-пептонный раствор. —

Готовить так же, как железо-пептонный раствор, но в шаге 6 заменить на 0,1 см³ 1% нейтрального водного раствора ацетата свинца.

Нитратно-пептонный раствор (Пейкса). —

1. Отвесить 10 г пептона Витте и эмульгировать его в 200 см³ дистиллированной воды, свободной от аммиака и предварительно нагретой до 60° C.

2. Смыть эмульсию в колбу и довести объем до 1000 см³ дистиллированной водой, свободной от аммиака.

3. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут.

4. Weigh out sodium nitrate, 1 gramme, and dissolve in the contents of the flask.

5. Профильтровать через шведскую фильтровальную бумагу.

6. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Лакмусовый бульон. —

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 163, sections 1 to 6).

2. Добавить достаточное количество стерильного раствора лакмуса, чтобы окрасить среду в темно-лавандовый цвет. (Среды с реакцией +10 обычно имеют очень слабощелочную или иногда нейтральную реакцию по лакмусу.)

3. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как бульон.

Пептонный раствор с розоловой кислотой. —

1. Отвесить 0,5 г розоловой кислоты (кораллина) и растворить ее в 100 см³ 80% спирта. Хранить как основной раствор.

2. Measure out peptone water (Dunham), 100 c.c., and rosolic acid solution, 2 c.c., and mix.

3. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут.

4. Профильтровать через шведскую фильтровальную бумагу.

5. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Среда Капальди-Проскауэра № I. —

1. Отвесить и смешать

Sodium chloride2.0 grammes Magnesium sulphate0.1 gramme Calcium chloride0.2 gramme Monopotassium phosphate2.0 grammes

2. Растворить в 1000 см³ воды в 2-литровой колбе

3. Отвесить и смешать

Asparagin2 grammes Mannite2 grammes

и добавить к содержимому колбы.

4. Отмерить 25 см³ раствора и оттитровать его децинормальным раствором едкого натра, используя лакмус в качестве индикатора. Проверить результат и рассчитать количество едкого натра, необходимое для нейтрализации остальной части раствора по лакмусу. Добавить это количество едкого натра.

5. Профильтровать.

6. Добавить 47,5 см³ раствора лакмуса (= 5%).

7. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Среда Капальди-Проскауэра № II. —

1. Отвесить и смешать

Peptone20 grammes Mannite1 gramme

2. Растворить в 1000 см³ воды в 2-литровой колбе.

3. Нейтрализовать по лакмусу, как в среде № I (см. выше, шаг 4).

4. Профильтровать.

5. Добавить 47,5 см³ раствора лакмуса (= 5%).

6. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Мочевые среды. Бульон. —

1. Собрать свежевыделенную мочу в стерильную колбу.

2. Поместить колбу в паровой стерилизатор при 100° C на тридцать минут.

3. Профильтровать через два слоя шведской фильтровальной бумаги.

4. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон. (Реакцию не изменять.)

Мочевой желатин. —

1. Собрать свежевыделенную мочу в стерильную колбу.

2. Измерить удельный вес, и если он выше 1010, разбавить стерильной водой до достижения этого показателя.

3. Определить (с контролем) при температуре кипения и отметить реакцию мочи.

4. Weigh out gelatine, 10 per cent., and add to the urine in the flask.

5. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение одного часа для растворения желатина.

6. Определить реакцию и добавить достаточное количество раствора едкого натра, чтобы восстановить реакцию всей массы среды до эквивалента исходной мочи.

7. Охладить до 60° C и осветлить яичным белком, как питательный желатин (см. стр. 166).

8. Профильтровать через бумагу Шардена.

9. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный желатин.

Мочевой желатин (Хеллер). —

1. Собрать свежевыделенную мочу в стерильную колбу.

2. Профильтровать через животный уголь для удаления части красящих веществ.

3. Измерить удельный вес, и если он выше 1010, разбавить стерильной водой до достижения этого показателя.

4. Add Witté's peptone, 1 per cent.; salt, 0.5 per cent.; gelatine, 10 per cent.

5. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение одного часа для растворения желатина и т. д.

6. Добавлять нормальный раствор едкого натра небольшими порциями и время от времени проверять реакцию лакмусовой бумагой, пока жидкость не станет слабощелочной.

7. Охладить до 60° C и осветлить яичным белком, как питательный желатин (см. стр. 166).

8. Профильтровать через бумагу Шардена.

9. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный желатин.

Мочевой агар. —

1. Собрать свежевыделенную мочу в стерильную колбу.

2. Измерить удельный вес, и если он выше 1010, разбавить стерильной водой до достижения этого показателя.

3. Отвесить 1,5% или 2% порошкообразного агара и добавить его к моче.

4. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение девяноста минут для растворения агара.

5. Охладить до 60° C и осветлить яичным белком, как питательный агар (см. стр. 168).

6. Профильтровать через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

7. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный агар.

(Реакцию не изменять.)

Сывороточно-сахарные среды (Хисс). —

В этих средах ферментация углеводных веществ под действием бактерий проявляется коагуляцией сывороточных белков в дополнение к образованию кислой реакции.

Сывороточно-декстрозная вода (Хисс). —

1. Отмерить в литровую колбу

Serum water (See page 170)1000 c.c.

2. Отвесить

Dextrose10 grammes

и растворить в сывороточной воде.

3. Профильтровать через шведскую фильтровальную бумагу.

4. Отмерить и добавить к среде

Litmus solution (Kahlbaum)50 c.c.

5. Разлить по пробиркам порциями по 10 см³ и стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Левулозу, галактозу, мальтозу, лактозу и т. д. можно заменить в аналогичных количествах декстрозой и довести среду до готовности, как указано выше.

Питательная жидкость Омелянского (для целлюлозоразлагающих бактерий). —

1. Отвесить и смешать

Potassium phosphate4.0 grammes Magnesium sulphate2.0 grammes Ammonium sulphate4.0 grammes Sodium chloride0.25 gramme

2. Растворить в 4000 см³ дистиллированной воды.

3. Разлить по колбам порциями по 250 см³.

4. Отвесить и добавить по 5 г осажденного мела в каждую колбу.

5. Стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Среды для изучения хромогенных бактерий.

Молочный рис (Айзенберг). —

1. Measure out nutrient bouillon, 70 c.c., and milk, 210 c.c., and mix thoroughly.

2. Weigh out rice powder, 100 grammes, and rub it up in a mortar with the milk and broth mixture.

3. Заполнить пастой стерильные капсулы, распределяя ее так, чтобы образовался слой толщиной около 0,5 см по дну каждой.

4. Нагревать на водяной бане при 100° C до тех пор, пока смесь не затвердеет.

5. Закрыть капсулы крышками. Стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд.

(Таким образом получается твердая среда цвета кофе с молоком.)

Молочный рис (Сойка). —

1. Measure out nutrient bouillon, 50 c.c., and milk, 150 c.c., and mix thoroughly.

2. Weigh out rice powder, 100 grammes, and rub it up in a mortar with the milk and broth mixture.

3. Заполнить пастой стерильные капсулы, чтобы образовался слой по дну каждой.

4. Закрыть капсулы крышками.

5. Стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд.

(Таким образом образуется чисто-белая непрозрачная среда.)

Среды для изучения фосфоресцирующих и фотогенных бактерий.

Рыбный бульон. —

1. Weigh out herring, mackerel, or cod, 500 grammes, and place in a large porcelain beaker (or enamelled iron pot).

2. Отвесить 26,5 г хлорида натрия, 0,75 г хлорида калия, 3,25 г хлорида магния и растворить в 500 см³ дистиллированной воды. Добавить раствор к рыбе в стакане.

3. Поместить стакан на водяную баню и действовать так же, как при приготовлении мясного экстракта, т. е. осторожно нагревать при 40° C в течение двадцати минут, затем быстро довести температуру до точки кипения и поддерживать ее в течение десяти минут.

4. Процедить смесь через муслин в чистую колбу.

5. Отвесить 5 г пептона и эмульгировать примерно с 200 см³ горячей рыбной воды; тщательно перемешать с остатком рыбной воды в колбе.

6. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут для полного растворения пептона.

7. Профильтровать через шведскую фильтровальную бумагу.

8. Когда рыбный бульон остынет, если он будет использоваться как жидкая среда, довести объем до 1000 см³ добавлением дистиллированной воды. Если же он будет использоваться в качестве основы для агаровых или желатиновых сред, хранить его в «двойной концентрации».

9. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

В качестве альтернативного метода вместо 500 г свежей рыбы можно использовать 16 г рыбного корма «Marvis».

Рыбный желатин. —

1. Measure out double strength fish bouillon, 500 c.c., into a "tared" 2-litre flask.

2. Add sheet gelatine, 100 grammes, cut into small pieces.

3. Пропускать живой пар через смесь в течение пятнадцати минут для растворения желатина.

4. Взвесить колбу с содержимым; довести вес до расчетного значения для одного литра среды (1135,5 г) добавлением дистиллированной воды при 100° C (см. стр. 166).

5. Охладить до температуры ниже 60° C и осветлить яичным белком.

6. Профильтровать через бумагу Шардена.

7. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный желатин.

После окончательной стерилизации хорошо встряхнуть для аэрации среды.

Рыбный желатин-агар. —

1. Weigh out powdered agar, 5 grammes, and emulsify it with 200 c.c. double strength fish bouillon.

2. Смыть эмульсию в тарированную 2-литровую колбу 300 см³ рыбного бульона.

3. Weigh out sheet gelatine, 70 grammes, cut it into small pieces and add it to the contents of the flask.

4. Пропускать живой пар через смесь для растворения желатина и агара.

5. Взвесить колбу с содержимым. Довести вес до расчетного значения для одного литра среды (1110,5 г) добавлением дистиллированной воды при 100° C (см. стр. 166).

6. Охладить до температуры ниже 60° C и осветлить яичным белком.

7. Профильтровать через бумагу Шардена.

8. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный желатин.

После окончательной стерилизации хорошо встряхнуть для аэрации среды.