«Основы бактериологической техники»

ПАРАФИНОВЫЙ МЕТОД.

1. Фиксация. Поместите кусочки ткани, лежащие на вате, в стеклянную бутыль с широким горлышком. Налейте достаточное количество сулемовой фиксирующей жидкости; оставьте ткань в ней на двенадцать-двадцать четыре часа в зависимости от размера.

2. Слейте фиксирующую жидкость и тщательно промойте в проточной воде в течение двадцати минут-получаса, чтобы удалить избыток сулемы.

Fig. 72.—L-shaped brass moulds.

Fig. 73.—Paraffin kettle.

3. Уплотнение. Помещайте ткани по очереди в каждую из следующих концентраций спирта на двенадцать-двадцать четыре часа: 50-процентный, 75-процентный, 90-процентный, абсолютный.

4. Обезвоживание осуществляется путем переноса тканей в свежий абсолютный спирт.

5. Просветление. Наполните бутыль с широким горлышком хлороформом наполовину. На поверхность хлороформа налейте слой абсолютного спирта глубиной около пяти-десяти миллиметров. Поместите кусочки ткани в слой спирта, и когда они пройдут сквозь этот слой, перенесите их в чистый хлороформ на шесть-двадцать четыре часа в зависимости от размера кусочков. При «просветлении» ткань становится более или менее прозрачной.

6. Пропитывание. Поместите просветленные ткани в свежий хлороформ с несколькими кусочками парафина и поставьте в теплое место, например, на верхнюю часть теплого инкубатора. Тепло постепенно расплавляет парафин, и ткани должны оставаться в смеси около двадцати четырех часов.

7. Перенесите ткани в сосуд с чистым расплавленным парафином. Поместите этот сосуд в парафиновую водяную баню, отрегулированную на 2° C выше температуры плавления используемого парафина, и оставьте ткани пропитываться в течение четырех-шести часов для обеспечения полной пропитки. Используемый парафин должен иметь температуру плавления не выше 58° C. Для всех обычных целей вполне достаточно 54° C.

8. Залейте в свежий парафин в металлической (или бумажной) форме.

(а) Расположите пару L-образных металлических деталей на стеклянной пластине, чтобы сформировать прямоугольный желоб (Рис. 72).

(б) Налейте свежий расплавленный парафин в форму из специального сосуда (Рис. 73).

(в) Извлеките кусочек ткани из парафиновой бани и расположите его в форме.

(г) Слегка подуйте на поверхность парафина в форме, и как только образуется пленка твердого парафина, осторожно поднимите стеклянную пластину, на которой установлена форма, и опустите пластину вместе с формой в таз с холодной водой.

(д) Когда блок остынет, отломите металлические L-образные детали; обрежьте излишки парафина вокруг ткани ножом, стараясь сохранить прямоугольную форму, и храните блок в коробочке для таблеток.

Когда необходимо залить несколько кусочков ткани одновременно, чрезвычайно полезными окажутся формы из прочной меди размером 10 см, 5 см и 2,5 см соответственно и глубиной 0,75 см (Рис. 74). Установленные на стеклянные пластины, они заменяют пару L-образных деталей в вышеописанном процессе. Когда парафин окончательно застынет, винт «а» следует ослабить, чтобы позволить двум половинам фланца «b» слегка разойтись — это облегчает извлечение парафинового блока.

Fig. 74.—Paraffin mould.

8. Приклейте блок к держателю «парафинового» микротома (Minot, Jung или Cambridge Rocker) с помощью небольшого количества расплавленного парафина. Большая надежность достигается, если парафин вокруг основания блока расплавить с помощью горячего металлического или стеклянного стержня.

9. Нарежьте срезы — тонкие и, по возможности, в виде лент.

Монтаж парафиновых срезов. —

1. Поместите большую каплю 30-процентного спирта в центр предметного стекла (или покровного стекла) и с помощью расправителя срезов перенесите срез на поверхность капли.

2. Удерживая стекло пальцами одной руки, осторожно подогрейте его над пламенем горелки Бунзена, время от времени касаясь нижней поверхности стекла тыльной стороной другой руки. Как только стекло станет отчетливо теплым на ощупь, парафиновый срез расправится, и все морщины исчезнут.

(Стекло со срезом, плавающим на нем, можно поместить на верхнюю часть парафиновой бани на две-три минуты вместо подогрева над пламенем, как описано здесь.)

3. Осторожно наклоните стекло и промокните излишки спирта промокательной бумагой, оставив срез прикрепленным к центру стекла.

4. Поместите стекло в проволочную стойку (Рис. 75), срезом вниз, в «горячий» инкубатор на двенадцать-двадцать четыре часа. По истечении этого времени срез прочно прилипает к стеклу и на последующих этапах обрабатывается как «фиксированный» мазок на покровном стекле.

Примечание. — Если приходится работать с большими толстыми срезами, или если время имеет значение, или если в процессе окрашивания используются кислоты, часто целесообразно добавить следы альбумина Майера в спирт перед расправлением среза. Если используется это вещество, пребывания в «горячем» инкубаторе в течение двадцати минут-получаса будет вполне достаточно для обеспечения прочного прилипания среза к стеклу. Альбуминовая жидкость готовится следующим образом:

Fig. 75.—Section rack.

Альбумин Майера. —

Отвесьте

Salicylate of soda1 gramme

и растворите в

Glycerine50 c.c.

Добавьте

White of egg50 c.c.

Тщательно перемешайте с помощью венчика для яиц.

Отфильтруйте в чистую бутыль.

В качестве альтернативного метода нанесите тонкий слой раствора Шаллибаума на стекло с помощью кисточки из верблюжьей шерсти; осторожно положите срез на эту пленку и слегка нагрейте для фиксации среза.

Раствор Шаллибаума:

Clove oil30 c.c. Collodion10 c.c.

Храните в бутыли из темно-синего стекла в прохладном месте.

Окрашивание парафиновых срезов. —

1. Подогрейте парафиновый срез над пламенем Бунзена, чтобы размягчить (но не расплавить) парафин, затем растворите воск ксилолом, налитым из капельницы.

2. Удалите ксилол, промыв срез спиртом.

3. Если ткань была изначально «зафиксирована» в растворе сулемы, срез теперь необходимо обработать раствором Люголя в течение двух минут, а затем погрузить в 90-процентный спирт для удаления всех следов желтого окрашивания.

4. Промойте водой.

5. Окрашивайте интенсивно, если используете один краситель, так как последующие процессы обесцвечивают.

6. Промойте водой, при необходимости обесцветьте.

7. Промойте несколькими порциями абсолютного спирта для обезвоживания среза.

8. Просветлите в ксилоле. (Масло гвоздики обычно не используется, так как оно обесцвечивает срез.)

9. Заключите в ксилоловый бальзам.

СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ СРЕЗОВ.

Двойное окрашивание кармином и по Граму-Вейгерту. —

1. Подготовьте срез к окрашиванию, как описано выше, пункты 1-3.

2. Окрашивайте литиевым кармином (Орта) или пикрокармином в течение десяти-тридцати минут в фарфоровой ванночке для окрашивания (Рис. 76).

3. Промывайте в растворе пикриновой кислоты до желтого цвета. На этом этапе ядра клеток красные, протоплазма желтая, а бактерии бесцветные.

Раствор пикриновой кислоты готовят путем смешивания

Picric acid, saturated aqueous solution40 c.c. Hydrochloric acid1 c.c. Alcohol (90 per cent.)160 c.c.

4. Промойте водой.

5. Промойте спиртом.

6. Окрашивайте анилиновым генцианвиолетом.

7. Промывайте в растворе йода до темно-коричневого или черного цвета.

8. Промойте водой.

9. Окуните в абсолютный спирт на секунду.

10. Обесцветьте анилиновым маслом до тех пор, пока краситель не перестанет вымываться.

Fig. 76.—Staining pot.

11. Wash with aniline oil, 2 parts, xylol, 1 part.

12. Просветлите ксилолом.

13. Заключите в ксилоловый бальзам.

Альтернативный метод Грама-Вейгерта для срезов. —

1. Зафиксируйте парафиновый срез на стекле и подготовьте к окрашиванию обычным способом.

2. Окрашивайте квасцовым кармином около пятнадцати минут.

3. Тщательно промойте водой.

4. Отфильтруйте раствор анилинового генцианвиолета на срез на стекле и оставьте окрашиваться около двадцати пяти минут.

5. Тщательно промойте водой.

6. Обрабатывайте раствором Люголя, пока срез не перестанет темнеть.

7. Тщательно промойте водой.

8. Обрабатывайте смесью равных частей анилинового масла и ксилола, пока краситель не перестанет вымываться.

9. Тщательно промойте ксилолом.

10. Обесцветьте и быстро обезводьте абсолютным спиртом, пока не останется лишь очень слабый голубоватый оттенок.

11. Просветлите ксилолом.

12. Заключите в ксилоловый бальзам.

(Тогда фибрин и гиалиновая ткань окрашиваются в темно-синий цвет, в то время как бактерии, которые «окрашиваются по Граму», выглядят темно-сине-фиолетовыми.)

Метод Унна-Паппенгейма. —

Краситель. —

Отвесьте и смешайте

Methylene green0.15 gramme Pyronin0.25 gramme

и растворите в

Carbolic acid 0.5 per cent. aqueous solution 78 c.c.

Отмерьте

Alcohol2.5 c.c.} Glycerine20.0 c.c.} and add to the stain.

Метод. —

1. Поместите ткань в вышеуказанный краситель на десять минут.

2. Дифференцируйте и обезводьте абсолютным спиртом.

3. Просветлите в ксилоле.

4. Заключите в ксилоловый бальзам.

Для обнаружения капсул. —

1. Метод Макконки. — Окрашивайте точно так же, как для мазков на покровных стеклах (см. стр. 100).

2. Метод Фридлендера. —

Краситель. —

Gentian violet, saturated alcoholic solution50 c.c. Acetic acid, glacial10 c.c. Distilled water100 c.c.

Метод. —

1. Подготовьте срезы к окрашиванию, secundum artem.

2. Окрашивайте срезы в тепле (например, в горячем инкубаторе) в течение двадцати четырех часов.

3. Промойте водой.

4. Decolourise lightly with acetic acid, 1 per cent.

5. Быстро обезводьте абсолютным спиртом.

6. Просветлите ксилолом.

7. Заключите в ксилоловый бальзам.

Для обнаружения кислотоустойчивых бацилл. —

1. Подготовьте срезы к окрашиванию обычным способом.

2. Окрашивайте раствором гематина в течение десяти-двадцати секунд для получения чистого ядерного окрашивания; затем промойте водой.

3. Окрашивайте карболовым фуксином в течение двадцати-тридцати минут при 47°C; затем промойте водой.

4. Treat with aniline hydrochlorate, 2 per cent. aqueous solution, for two to five seconds.

5. Обесцветьте в 75-процентном спирте, пока срез не станет свободным от красителя — пятнадцать-тридцать минут.

6. Обезводьте абсолютным спиртом.

7. Просветлите очень быстро ксилолом.

8. Заключите в ксилоловый бальзам.

Для обнаружения спирохет в тканях.

Пиридиновый метод (Левадити). —

1. Нарежьте кусочки ткани толщиной 1 мм.

2. Зафиксируйте в 10-процентном растворе формалина в течение двадцати четырех часов.

3. Промойте водой в течение одного часа.

4. Поместите в 96-процентный спирт на двадцать четыре часа.

5. Отмерьте в бутыль из темно-зеленого или янтарного стекла 100 куб. см 1-процентного раствора нитрата серебра и 10 граммов чистого пиридина. Перенесите кусочки ткани в этот раствор. Закройте пробкой и выдержите при комнатной температуре три часа, затем в термостате при 50° C в течение четырех-шести часов.

6. Быстро промойте в 10-процентном растворе пиридина.

7. Восстановите серебро, перенеся кусочки ткани в следующий раствор на сорок восемь часов.

Pyrogallic acid4 grammes Acetone10 c.c. Pyridin puriss15 grammes Distilled water100 c.c.

8. Хорошо промойте водой.

Проведите через спирты возрастающей концентрации до абсолютного, выдерживая в каждой концентрации по двадцать четыре часа.

9. Просветлите, залейте, сделайте очень тонкие срезы, смонтируйте, удалите парафин, снова просветлите и заключите в ксилоловый бальзам.

Спирохеты, если они присутствуют, черные и выделяются на бледно-желтом фоне.

Слабый карболовый фуксин, нейтральный красный или толуидиновый синий также могут быть использованы для окрашивания фона при желании, после удаления парафина на этапе 9.

Для обнаружения простейших в срезах (Лейшман). —

Необходимые реактивы:

Leishman's Polychrome stain. Acetic acid 1 in 1500 aqueous solution. Caustic soda 1 in 7000 aqueous solution. Distilled water.

1. Смонтируйте срез, удалите парафин и перенесите в дистиллированную воду как обычно (см. стр. 121).

2. Слейте излишки воды.

3. Покройте срез разбавленным красителем Лейшмана (1 часть красителя, 2 части дистиллированной воды) и оставьте действовать на пять-десять минут (пока ткань не станет темно-синей).

4. Обесцветьте раствором уксусной кислоты, пока только ядра не станут синими (исследуйте срез во влажном состоянии, с объективом малого увеличения).

5. Если эозиновый цвет слишком выражен, обработайте раствором каустической соды до получения желаемого оттенка (как видно при объективе 1/6 дюйма).

6. Промойте дистиллированной водой.

7. Быстро обезводьте спиртом.

8. Просветлите ксилолом.

9. Заключите в ксилоловый бальзам.

VIII. КЛАССИФИКАЦИЯ ГРИБОВ.

Для практических целей грибы можно разделить на:

1. Hymenomycetes (including the mushrooms, etc.).

2. Hyphomycetes (moulds).

3. Blastomycetes (yeasts and torulæ).

4. Schizomycetes (bacteria).

Примечание. — Ранее миксомицеты включались в состав грибов; сейчас они признаны принадлежащими к царству животных и называются «мицетозоа».

МОРФОЛОГИЯ HYPHOMYCETES (ГИФОМИЦЕТОВ).

В начале своих занятий внимание студента направляется на различные непатогенные плесени и дрожжи не только для того, чтобы он приобрел необходимую технику при работе с культурами безвредных организмов, но и потому, что именно эти виды являются одними из самых распространенных среди тех, что могут случайно загрязнить его будущие препараты.

Гифомицеты состоят из мицелия коротких членистых палочек или «гиф», отходящих от оси или зародышевой трубки, которая развивается из споры. Гифы бывают —

(а) Питающие или погруженные.

(б) Репродуктивные или воздушные.

Протоплазма этих клеток содержит гранулы, пигмент, масляные капли, а иногда кристаллы оксалата кальция.

Размножение. — Апикальное спорообразование — бесполое; зооспоры — половое.

Mucorinae (Мукоровые). — Mucor (Рис. 77). — Обратите внимание на ветвящиеся нити — «мицелий» (а), «гифы» (б).

Обратите внимание на бесполое размножение.

1. Нить растет вверх. На ее вершине образуется перегородка, затем появляется шаровидное вздутие — «спорангий» (d). Он обладает четкой оболочкой.

2. Из перегородки вырастает булавовидная масса протоплазмы — «колумелла» (c).

Fig. 77.—Mucor mucedo.

Fig. 78.—Aspergillus

3. Остальная часть содержащейся протоплазмы распадается на «зооспоры» (e).

Наконец, оболочка разрывается, и споры выходят наружу.

Perisporaceae (Периспоровые). — Aspergillus (Рис. 78). — Обратите внимание на ветвящиеся нити — «мицелий» (а).

Fig. 79.—Penicillium.

Обратите внимание на бесполое размножение.

1. Нить (б) растет вверх, ее окончание становится булавовидным; на булавовидном конце появляются колбовидные клетки — «стеригмы» (c).

2. На свободном конце каждой стеригмы образуется овальное тело — спора или «конидия» (d), которая при созревании отбрасывается со стеригмы. На каждой стеригме могут располагаться две или более конидии.

Penicillium (Пеницилл) (Рис. 79). — Обратите внимание на ветвящиеся нити — «мицелий» (а) (часто содержащий глобулы).

Обратите внимание на бесполое размножение.

1. Нить растет вверх — «конидиеносец» (б) — и ее вершина делится на несколько ветвей — «базидии» (c).

2. На вершине каждой базидии появляется колбовидная клетка, «стеригма» (d).

3. На вершине каждой стеригмы появляется ряд овальных клеток — «споры» или «конидии» (e). Они при созревании отбрасываются со стеригм.

Fig. 80.—Oïdium.

Ascomycetae (Аскомицеты). — Oidium (Оидиум) (Рис. 80). — (Это семейство, возможно, так же близко к бластомицетам, как и к гифомицетам.)

Обратите внимание на ветвящиеся нити — «псевдомицелий» (а). Кое-где нити на концах распадаются на овальные или палочковидные сегменты, «оидии», и ведут себя как споры.

Обратите внимание на бесполое размножение. Из псевдомицелия возникают настоящие гифы (б), каждая из которых, в свою очередь, заканчивается цепочкой спор (c).

МОРФОЛОГИЯ BLASTOMYCETES (БЛАСТОМИЦЕТОВ).

Бластомицеты состоят из сферических или овальных клеток (диаметром от 8 до 9,5 мкм), которые при быстром размножении почкованием могут образовывать ложный мицелий. Тонкая клеточная стенка окружает зернистую протоплазму, в которой можно заметить вакуоли и иногда ядро. Последнее лучше всего видно при окрашивании гематоксилином (см. стр. 105).

В процессе роста и размножения бластомицеты расщепляют растворы, содержащие сахар, на спирт и CO2.

Saccharomyces (Сахаромицеты) (Рис. 81). — Обратите внимание на круглые или овальные клетки зернистой протоплазмы (а), содержащие твердые частицы и вакуоли (c) и окруженные четкой оболочкой.

Размножение. — Почкование; аскоспоры — бесполое.

Обратите внимание на бесполое размножение.

1. «Геммация» — то есть почкование дочерних клеток (б) из различных частей постепенно увеличивающейся материнской клетки. Они в конечном итоге отбрасываются и, в свою очередь, становятся материнскими клетками и образуют новые группы почек.

Fig. 81.—Saccharomyces with ascospores.

Fig. 82.—Torula.

2. Спорообразование — «аскоспоры» (e). Они образуются при определенных температурах и в строго определенные периоды; например, Saccharomyces cerevisiae, тридцать часов при 25°–37°C или десять дней при 12°C.

Torulae (Торулы) (Рис. 82). — Торулы, хотя и напоминают дрожжи почти во всех других отношениях, никогда не образуют эндоспор. Обратите внимание на удлиненные, колбасовидные клетки (а), более крупные овальные клетки (б) и шаровидные клетки (c), причем первые две часто переплетаются и растут в виде пленки.

Обратите внимание на отсутствие образования аскоспор.

IX. SCHIZOMYCETES (ШИЗОМИЦЕТЫ).

Классификация и морфология. — Бактерии часто классифицируются в общих чертах в соответствии с их жизненными функциями на —

Saprogenic, or putrefactive bacteria;

Zymogenic, or fermentative bacteria;

Pathogenic, or disease-producing bacteria;

или в соответствии с их потребностями в питании на —

Prototrophic, requiring no organic food (e. g., nitrifying bacteria);

Metatrophic, requiring organic food (e. g., saprophytes and facultative parasites);

Paratrophic, requiring living food (obligate parasites);

или в соответствии с продуктами их метаболизма на —

Chromogenic, or pigment-producing bacteria;

Photogenic, or light-producing bacteria;

Aerogenic, or gas-producing bacteria;

и так далее.

Такие широкие группировки, однако, имеют мало практической ценности при систематическом изучении грибов-делящихся.

С другой стороны, никакой действительно научной классификации шизомицетов до сих пор не составлено, и различные морфологические проявления представителей этого семейства до сих пор используются в качестве основы для классификации, как показано ниже —

1. Кокки. (Рис. 83). — Округлые или овальные клетки, подразделяемые в зависимости от расположения особей после деления на —

Диплококки и стрептококки, где деление происходит только в одной плоскости, а особи остаются прикрепленными (а) парами или (б) цепочками.

Тетрады, Merismopedia или Pediococci, где деление происходит попеременно в двух плоскостях под прямым углом друг к другу, а особи остаются прикрепленными в виде плоских табличек по четыре или их кратных количеств.

Fig. 83.—Types of bacteria—cocci: 1, Diagram of sphere indicating planes of fission; 2, diplococci; 3, streptococci; 4, tetrads; 5, sarcinæ; 6, staphylococci.

Сарцины, где деление происходит последовательно в трех плоскостях, а особи остаются прикрепленными в виде кубических пакетов по восемь и их кратных количеств.

Fig. 84.—Types of bacteria—bacilli, etc.: 1, Bacilli; 2, diplobacilli; 3 streptobacilli; 4, spirilla; 5, vibrios; 6, spirochætæ.

Микрококки или стафилококки, где деление происходит в трех плоскостях, но без определенной последовательности; следовательно, особи остаются прикрепленными парами, короткими цепочками, пластинками по четыре, кубическими пакетами по восемь и неправильными массами, содержащими многочисленные кокки.

2. Бациллы (Рис. 84, 1-3). — Палочковидные клетки. Бациллу, однако, какой бы короткой она ни была, обычно можно отличить от кокка тем, что две ее стороны параллельны. Некоторые бациллы после деления сохраняют характерное расположение, и их можно называть диплобациллами или стрептобациллами.

Leptothrix — это термин, который в прошлом свободно использовался для обозначения длинной нити, но теперь ограничен такими формами, которые принадлежат к Leptothriciae (см. ниже).

3. Spirilla (Fig. 84, 4 to 6).—Curved and twisted filaments. Classified, according to shape, into—

Spirillum.

Vibrio (comma).

Spirochæta.

Многие спирохеты, по-видимому, принадлежат к царству животных и группируются под названием простейших; другие организмы, которым было дано это название, несомненно, являются бактериями.

Встречаются также более высокоорганизованные формы бактерий, обладающие следующими характеристиками: это прикрепленные, неветвящиеся нитевидные формы, демонстрирующие—

(а) дифференцировку между основанием и вершиной;

(б) рост, по-видимому, апикальный;

(в) выраженный плеоморфизм;

(г) «псевдоветвление» вследствие прилегания клеток друг к другу; и классифицируемые на—

1. Beggiotoa. } Free swimming forms, which

2. Thiothrix. } contain sulphur granules.

3. Crenothrix. }

4. Cladothrix. } These forms do not contain

5. Leptothrix. } sulphur granules.

6. Streptothrix. A group which exhibits true but

not dichotomous branching, and contains some pathogenic

species.

Морфология одной и той же бактерии может значительно варьировать в зависимости от условий.

Например, при одних условиях исследования чистой культуры бациллы могут показать, что преобладающей формой является короткая овальная палочка, тогда как другая культура той же бациллы, но выращенная в иных условиях, может состоять почти целиком из длинных нитей или тяжей. Это морфологическое варьирование известно как «плеоморфизм».

Некоторые факторы, влияющие на плеоморфизм:

1. Состав, реакция и т. д. питательной среды, в которой растет микроорганизм.

2. Атмосфера, в которой он культивируется.

3. Температура, при которой проводится инкубация.

4. Воздействие света или защита от него.

Различные аспекты анатомии, морфологии и физиологии бактерий, на которых делается акцент на следующих страницах, следует изучать как можно более тщательно на препаратах микроорганизмов, упомянутых в связи с каждым из них.

АНАТОМИЯ.

1. Капсула (рис. 85, b). — Желатинозная оболочка (вероятно, близкая по составу к муцину), окружающая каждый отдельный организм и препятствующая непосредственному контакту между двумя особями. У некоторых видов капсула (например, B. pneumoniae) выражена хорошо, но ее не всегда удается обнаружить. В случаях очень выраженной желатинизации клеточной стенки отдельные клетки склеиваются в единую массу, к которой применяется термин «зооглея» (например, Streptococcus mesenteroides). У некоторых видов в капсуле откладывается красящее вещество или оксид железа.

2. Клеточная стенка (рис. 85, c). — Защитная дифференцировка наружного слоя клеточной протоплазмы; ее трудно обнаружить, но обработка йодом или солевым раствором иногда вызывает сжатие клеточного содержимого — «плазмолиз» — и тем самым делает клеточную стенку заметной (например, B. megatherium), как показано на рисунке 85. Окрашенные бациллы при исследовании с помощью поляризационного микроскопа часто показывают двоякопреломляющую клеточную стенку (например, B. tuberculosis и B. anthracis).

У некоторых высших бактерий клеточная стенка демонстрирует эту дифференцировку в значительной степени и образует твердую оболочку, внутри которой клеточная протоплазма свободно перемещается; а в процессе размножения клеточная протоплазма может выдавливаться наружу, оставляя пустую трубку неизменной по форме.

Fig. 85.—Dragrammatic sketch of composite bacterium to illustrate details of anatomical structure.

Fig. 86.—Plasmolysis.

3. Содержимое клетки. — Протоплазма (микопротеин) содержит высокий процент азота, но, как говорят, отличается от белка тем, что не осаждается C2H6O. Обычно она выглядит гомогенной — иногда зернистой — и может содержать капли масла или вакуоли с клеточным соком (рис. 85, d), хроматиновые гранулы и даже гранулы серы. Вакуоли с клеточным соком следует отличать от спор, с одной стороны, и от вакуолизированного вида, обусловленного плазмолизом, с другой.

Содержимое клетки иногда может дифференцироваться на пристеночный слой и центральное тельце (например, Beggiatoa) при окрашивании гематоксилином.

4. Ядро. — Существование этой структуры не было окончательно доказано, но у некоторых бактерий вблизи центра бактериальной клетки наблюдались частицы хроматина, а на полюсах — более плотные массы протоплазмы, которые проявляют более выраженное сродство к анилиновым красителям, чем остальная часть клеточной протоплазмы. Последние называются полярными гранулами или Polkoerner (рис. 85, e). Иногда эти скопления протоплазмы изменяют цвет поглощаемого ими красителя. Тогда они известны как метахроматические тельца или Ernstschen Koerner (например, B. diphtheriae).

5. Жгутики (органы движения, рис. 85, a). — Это желатинозные выросты клеточной протоплазмы (или, что более вероятно, капсулы), расположенные либо на одном полюсе, либо на обоих полюсах, либо рассеянные по всей периферии. Жгутики не являются псевдоподиями. Обладание жгутиками одно время предлагалось в качестве основы для системы классификации, когда различали следующие типы жгутикования (рис. 87):

Fig. 87.—Types of ciliation.

1. Полярное: (а) монотрихиальное (один жгутик, расположенный на одном полюсе; например, B. pyocyaneus).

(б) Амфитрихиальное (по одному жгутику на каждом полюсе; например, Spirillum volutans).

(в) Лофотрихиальное (пучок жгутиков, расположенный на каждом полюсе; например, B. cyanogenus).

2. Диффузное: перитрихиальное (жгутики рассеяны по всей периферии; например, B. typhosus).

ФИЗИОЛОГИЯ.

Размножение. — Активная стадия. — Вегетативная, т. е. путем деления клеток, или «бинарного деления».

1. Клетка удлиняется, и протоплазма скапливается на противоположных полюсах.

2. Происходит круговое перетягивание организма посередине между этими скоплениями, и внутри клетки образуется перегородка под прямым углом к ее длине.

3. Деление углубляется, перегородка разделяется на две пластинки, и в конечном итоге образуются две клетки.

Fig. 88.—Fission o£ cocci.

Fig. 89.—Fission of bacteria.

4. Дочерние клетки могут оставаться соединенными желатинозной оболочкой в течение некоторого времени. В конце концов они разделяются и сами подвергаются делению.

Культуры на искусственных средах после роста в одной и той же среде в течение некоторого времени — т. е. когда питательные вещества истощены — показывают «инволюционные формы» (рис. 90), хорошо представленные в культурах B. pestis на агаре двухдневной давности, B. diphtheriae на картофеле четырех-шестидневной давности.

Fig. 90.—Involution forms.

Они делятся на два класса, а именно:

(а) Инволюционные формы, характеризующиеся изменениями формы (рис. 90). (Не обязательно мертвые.)

(б) Инволюционные формы, характеризующиеся потерей способности к окрашиванию. (Всегда мертвые.)

Стадия покоя. — Спорообразование. — Условия, влияющие на спорообразование: в старой культуре могут остаться только споры. Раньше предполагалось, что споры образуются всегда, чтобы вид не вымер, когда

(а) запас питательных веществ истощен.

(б) Среда стала токсичной из-за накопления продуктов метаболизма.

(в) Окружающая среда стала неблагоприятной; например, изменение температуры.

Это не совсем верно; например, температура, при которой споры образуются лучше всего, постоянна для каждой бактерии, но варьирует у разных видов; опять же, аэробам для спорообразования требуется кислород, но анаэробы не образуют спор в его присутствии.

(А) Артрогенные: отмечены только у микрококков. Один полный элемент, образующийся в результате обычного деления, дифференцируется для этой цели, увеличивается и развивает плотную клеточную стенку. Одна или несколько клеток в ряду могут претерпевать это изменение.

Этот процесс, вероятно, не является настоящим спорообразованием, а лишь относительным повышением устойчивости. Эти так называемые артроспоры никогда не наблюдались в состоянии «прорастания», и их устойчивость не очень выражена, так как они не способны инициировать новые культуры после воздействия температуры 80° C в течение десяти минут.

(Б) Эндогенные: клеточная протоплазма дифференцируется и конденсируется в сферическую или овальную массу (очень редко цилиндрическую). После дальнейшего сжатия наружные слои массы становятся еще более дифференцированными и образуют отчетливую оболочку споры, и сама спора теперь обладает высокой преломляющей способностью. Было высказано предположение, и, по-видимому, на веских основаниях, что оболочка споры состоит из двух слоев: экзоспориума и эндоспориума. Каждая клетка образует только одну спору, обычно посередине, иногда на одном конце (однако зафиксированы некоторые исключения; например, B. inflatus). Форма материнской клетки может оставаться неизменной, как у бациллы сибирской язвы, или изменяться, как у бациллы столбняка, и эти моменты служат основой для классификации спорообразующих бацилл следующим образом:

(А) Тело материнской бациллы не изменено по форме (рис. 91, a).

(Б) Клетка материнской бациллы изменена по форме.

1. Clostridium (рис. 91, b): палочка, вздутая в центре и суженная на полюсах; веретенообразная; например, B. butyricus.

2. Клиновидная (рис. 91, c): палочки, слегка вздутые на одном полюсе и более или менее заостренные на другом; клинообразные.

Fig. 91—Types of spore-bearing bacilli.

3. Булавовидная (рис. 91, d): палочки, вздутые на одном полюсе и цилиндрические (неизмененные) на другом; по форме напоминают замочную скважину; например, B. chauvei.

4. Головчатая (рис. 91, e): палочки со сферическим расширением на одном полюсе; по форме напоминают барабанную палочку; например, B. tetani.

Эндоспоры остаются внутри материнской клетки в течение некоторого времени (в одном случае утверждается, что прорастание споры происходит внутри материнской клетки — «эндопрорастание»), но в конечном итоге высвобождаются в результате набухания и растворения клеточной оболочки материнской бациллы в окружающей жидкости или разрыва этой оболочки. Затем они демонстрируют следующие характеристики:

1. Хорошо сформированные, плотные клеточные оболочки, что делает их чрезвычайно трудными для окрашивания, но после окрашивания их так же трудно обесцветить.

2. Высокая преломляющая способность, которая отличает их от вакуолей.

3. Более высокая устойчивость, чем у материнского организма, к таким летальным агентам, как тепло, высушивание, голодание, время и т. д., причем эта устойчивость обусловлена

(а) низким содержанием воды в плазме споры.

(b) Low heat-conducting power} of the spore membrane. (c) Low permeability}

Эта устойчивость несколько варьирует в зависимости от конкретного вида — например, некоторые споры могут выдерживать кипячение в течение нескольких минут, — но практически все они погибают, если кипячение продолжается десять минут.

Прорастание. — При переносе на подходящие среды и помещении в благоприятные условия споры прорастают, обычно в течение двадцати четырех — тридцати шести часов, и последовательно претерпевают следующие изменения, за которыми можно наблюдать в культурах «висячая капля» на термостолике:

1. Медленно набухают и увеличиваются в размерах за счет поглощения воды.

2. Теряют свою преломляющую способность.

3. На этой стадии можно наблюдать один из трех процессов (но конкретный процесс всегда постоянен для одного и того же вида):

(а) спора прорастает в новую бациллу, не сбрасывая оболочку споры (которая в этом случае становится клеточной оболочкой); например, B. leptosporus.

(б) она теряет оболочку споры путем растворения; например, B. anthracis.

(в) она теряет оболочку споры путем разрыва.

В этом процессе разрыв может быть полярным (только на одном полюсе, например, B. butyricus), биполярным (например, B. sessile) или экваториальным (например, B. subtilis).

В тех случаях, когда оболочка споры сбрасывается, клеточная оболочка новой бациллы может быть сформирована из—

(а) внутреннего слоя оболочки споры, который претерпел предварительное расщепление на пристеночный и висцеральный слои; например, B. butyricus.

(б) наружных слоев клеточной протоплазмы, которые дифференцируются для этой цели; например, B. megatherium.

Новая бацилла теперь увеличивается в размерах, удлиняется и переходит к вегетативному росту — т. е. подвергается делению, — бациллы, образующиеся в результате этого, в свою очередь, могут давать начало спорам.

Fig. 92. Simple.

Fig. 93. Solution.

Fig. 94. Polar.

Fig. 95. Bipolar.

Fig. 96. Equatorial.

Питательные вещества. — 1. Органические питательные вещества. —

(а) Чистые паразиты (например, B. leprae) не живут вне живого организма.

(б) Как сапрофитные, так и факультативно-паразитические бактерии требуют неконцентрированной пищи.

(в) Факультативным паразитам нужны высокоорганизованные питательные вещества; например, белки или другие источники азота и углерода, а также соли.

(г) Сапрофитные бактерии культивируются легче; например,

1. Некоторые бактерии растут почти в чистой дистиллированной воде.

2. Некоторые бактерии растут в чистых растворах углеводов.

3. Вода абсолютно необходима для роста бактерий.

Для роста бактерий необходима пища с определенной реакцией. Как правило, рост наиболее активен в средах, которые реагируют слабокисло по фенолфталеину — то есть нейтрально или слабощелочно по лакмусу. Рост плесени, с другой стороны, наиболее энергичен в средах, которые сильнокисло по фенолфталеину.

Окружающая среда. — Влияние физических агентов на жизнь и рост бактерий выражено сильно.

1. Атмосфера. — Присутствие кислорода необходимо для роста некоторых бактерий, и смерть наступает, когда его подача прекращается. Такие организмы называются облигатными аэробами.

Некоторые бактерии, по-видимому, одинаково хорошо процветают как при наличии, так и при отсутствии кислорода. Они называются факультативными анаэробами.

Третий класс будет жить и размножаться только тогда, когда доступ свободного кислорода полностью исключен. Они называются облигатными анаэробами.

2. Температура. — Практически никакой рост бактерий не происходит ниже 5°C и очень мало выше 40°C. 30°C–37°C — наиболее благоприятная температура для подавляющего большинства микроорганизмов.

Максимальная и минимальная температуры, при которых происходит рост, а также оптимум, довольно постоянны для каждой бактерии.

Бактерии были классифицированы в соответствии с их оптимальной температурой на—

Min.Opt.Max. 1. Psychrophilic bacteria (chiefly water organisms)0° C.15° C.30°C. 2. Mesophilic bacteria (includes pathogenic bacteria)15° C.37° C.45°C. 3. Thermophilic bacteria45° C.55° C.70°C.

Термическая точка гибели организма является еще одной биологической константой; это температура, которая вызывает гибель вегетативных форм при воздействии в течение десяти минут (см. стр. 298–301).

3. Свет. — Многие организмы безразличны к присутствию света. С другой стороны, свет часто препятствует росту и в большей или меньшей степени изменяет биохимические характеристики организмов — например, хромогенность или способность к разжижению. Патогенные бактерии претерпевают прогрессирующую потерю вирулентности при культивировании в присутствии света.

4. Движения. — Движения, если они незначительны и имеют просто текучий характер, по-видимому, не оказывают вредного влияния на рост бактерий; но сильное воздействие, такое как встряхивание, абсолютно убивает их.

Состояние полного покоя, по-видимому, наиболее благоприятно для роста бактерий.

Продукты метаболизма бактерий. — Пигментообразование. — Многие микроорганизмы производят один или несколько ярких пигментов — желтый, оранжевый, красный, фиолетовый, флуоресцентный и т. д. — в процессе своей жизни и роста. Красящее вещество обычно существует как межклеточное экскреторное вещество. Иногда, однако, оно, по-видимому, откладывается непосредственно внутри тел бактерий. Поэтому хромогенные бактерии классифицируются в соответствии с конечным пунктом назначения красящего вещества, которое они вырабатывают, на—

Хромопаровые бактерии: у которых пигмент диффундирует наружу в окружающую среду.

Хромофорные бактерии: у которых пигмент откладывается в клеточной протоплазме организма.

Парахромофорные бактерии: у которых пигмент откладывается в клеточной стенке организма.

Разные виды хромогенных бактерий различаются по своим требованиям к окружающей среде для выработки характерных пигментов; например, некоторым нужен кислород, свет или высокая температура; другие, напротив, предпочитают обратные условия.

Светоизлучение. — Некоторые бактерии, обычно те, которые изначально происходят из воды, пресной или соленой, проявляют выраженную фосфоресценцию при культивировании в подходящих условиях. Они классифицируются как «фотогенные».

Ферментообразование. — Многие бактерии производят растворимые ферменты в процессе своего роста, о чем свидетельствует разжижение желатина, свертывание молока и т. д. Эти ферменты могут принадлежать к любому из следующих хорошо известных классов: протеолитические, диастатические, инвертазы, сычужные.

Токсинообразование. — Большое количество, особенно патогенных бактерий, вырабатывает или секретирует ядовитые вещества, о которых мало что известно, хотя многие из них, по-видимому, действуют как ферменты.

Эти токсины обычно делятся на—

Экзотоксины (или растворимые токсины): те, которые диффундируют в окружающую среду и удерживаются ею в растворе.

Эндотоксины (или неразделимые токсины): те, которые настолько тесно связаны с клеточной протоплазмой бактерий, их вырабатывающих, что до настоящего времени не было найдено способа их отделения или экстракции.

Конечные продукты метаболизма. — К этой рубрике относятся—

Органические кислоты (например, молочная, масляная и т. д.).

Щелочи (например, аммиак).

Ароматические соединения (например, индол, фенол).

Восстанавливающие вещества (например, те, которые восстанавливают нитраты до нитритов).

Газы (например, сероводород, углекислый газ и т. д.).

И хотя обсуждение их образования и т. д. выходит за рамки лабораторного руководства, методы, используемые для их обнаружения и разделения, входят в обычную рутинную работу и поэтому будут описаны (см. стр. 276 и далее).

X. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

Для того чтобы жизнь и рост бактерий можно было точно наблюдать в лаборатории, необходимо—

1. Изолировать отдельных представителей различных разновидностей микроорганизмов.

2. Культивировать организмы, таким образом изолированные, отдельно от других ассоциированных или контаминирующих бактерий — т. е. в чистой культуре.

Для успешного достижения этих целей необходимо обеспечить питание в форме, соответствующей потребностям конкретной бактерии или бактерий, находящихся под наблюдением, и в общем можно сказать, что питательные материалы должны максимально приближаться по составу и характеру к естественной пище организма.

Общие требования бактерий к пище уже были указаны (стр. 142), и время от времени разрабатывались многие комбинации белков и углеводов в этом направлении. Они, вместе с различными растительными тканями, физиологическими или патологическими секретами жидкостей и т. д., коллективно называются питательными средами или культуральными средами.

Большее количество этих сред является преимущественно жидкими, но из-за быстроты, с которой бактериальный рост распространяется в жидкости, невозможно изучить в ней характеристики отдельных организмов. Многие такие среды поэтому впоследствии делают твердыми путем добавления веществ, таких как желатин или агар, в различных пропорциях, причем пропорции такого добавленного материала обычно упоминаются при упоминании сред; например, 10-процентный желатин, 2-процентный агар. Желатин используется для отверждения тех сред, которые предполагается использовать при культивировании бактерий при комнатной температуре или в «холодном» инкубаторе. В обычно используемых процентах желатиновые среды становятся жидкими при 25°C; более высокие проценты остаются твердыми при несколько более высоких температурах, но трудность фильтрации крепких растворов желатина препятствует их широкому использованию.

Среды, с другой стороны, которые были отверждены путем добавления агара, становятся жидкими только при воздействии 90° C в течение примерно десяти минут и снова затвердевают, когда температура падает до 40° C.

Когда возникает необходимость сделать эти среды жидкими, применяется нагревание, после прекращения которого они снова принимают свое твердое состояние. Такие среды следует называть разжижаемыми средами; по сути, однако, их обычно группируют вместе с твердыми средами.

Примечание. — Здесь следует указать, что обозначение 10-процентный желатин или 2-процентный агар относится только к количеству этих веществ, фактически добавленных в процессе производства, а не к проценту желатина или агара, в зависимости от случая, присутствующему в готовой среде; объяснение заключается в том, что используемые коммерческие продукты содержат большую долю нерастворимого материала, который отделяется путем фильтрации во время приготовления разжижаемых сред.

Другие среды, опять же — например, картофель, коагулированная сыворотка крови и т. д. — не могут быть снова разжижены физическими средствами, и их называют твердыми средами.

На следующих страницах подробно описан метод приготовления различных питательных сред, находящихся в обычном употреблении (см. также главу XI), те, которые требуются лишь изредка для более узкоспециализированной работы, сгруппированы в главе XII. Необходимо заранее оговорить, что следует соблюдать исключительную чистоту в отношении всей аппаратуры, сосудов, воронок и т. д., используемых при приготовлении сред; хотя на предварительных этапах приготовления большинства сред абсолютная стерильность используемой аппаратуры не является обязательной.

МЯСНОЙ ЭКСТРАКТ.

Водный раствор экстрактивных веществ и т. д. постного мяса (обычно говядины) составляет основу нескольких питательных сред. Этот раствор называется «мясным экстрактом», и эмпирически было определено, что его приготовление должно осуществляться путем экстракции полукилограмма влажного мяса одним литром воды. Для многих целей, однако, удобнее иметь более концентрированный экстракт; поэтому один килограмм мяса следует экстрагировать одним литром воды, чтобы получить мясной экстракт «двойной крепости».

Одно время было принято, и до сих пор в некоторых лабораториях принято использовать либо «говяжью голяшку», либо «говяжий стейк» — оба содержат мышечный сахар, который часто необходимо удалять перед завершением приготовления питательной среды. Сердечная мышца (бычье сердце или овечье сердце) предпочтительнее, и с точки зрения экономии, легкости и чистоты манипуляций, а также экстрактивной ценности, импортируемые замороженные бычьи сердца обеспечивают лучший экстракт.

Мясной экстракт (Fleischwasser) готовится следующим образом:

1. Отмерьте 1000 куб. см дистиллированной воды в большую колбу (или стеклянный стакан, или эмалированный железный котел) и добавьте 1000 граммов (примерно 2,5 фунта) свежего постного мяса — например, бычьего сердца — мелко измельченного в мясорубке.

2. Аккуратно нагрейте смесь на водяной бане, следя за тем, чтобы температура содержимого колбы не превышала 40° C в течение первых двадцати минут. (Это растворяет растворимые белки, экстрактивные вещества, соли и т. д.)

3. Теперь поднимите температуру смеси до точки кипения и поддерживайте ее при этой температуре в течение десяти минут. (Это осаждает некоторые альбумины, гемоглобин и т. д. из раствора.)

4. Процедите смесь через стерильную марлю или перфорированную фарфоровую воронку, затем отфильтруйте жидкость через шведскую фильтровальную бумагу в стерильную «нормальную» литровую колбу, и когда она остынет, доведите объем до 1000 куб. см добавлением дистиллированной воды — чтобы восполнить потерю от испарения.

5. Если он не нужен сразу, стерилизуйте мясной экстракт в большом количестве в паровом стерилизаторе в течение двадцати минут в течение трех последовательных дней.

Телятина, баранина или куриное мясо иногда заменяют говядину; или мясной экстракт может быть приготовлен из внутренних органов животных, таких как мозг, селезенка, печень или почки.

Примечание. — В качестве альтернативного метода 5 куб. см мясного сока Брэнда или 3 грамма говяжьего сока Уайета, или 10 граммов мясного экстракта Либиха (Lemco) можно растворить в 1000 куб. см дистиллированной воды, нагреть и отфильтровать, как указано выше, чтобы получить обычный мясной экстракт или экстракт одинарной крепости.

Среды, приготовленные из таких мясных экстрактов, однако, крайне неудовлетворительны при использовании для культивирования более высокопаразитических бактерий; хотя при работе в тропических и субтропических регионах их использование практически обязательно.

Реакция мясного экстракта. — Мясной экстракт, приготовленный таким образом, имеет кислую реакцию из-за присутствия кислых фосфатов калия и натрия, слабых кислот гликолевого ряда и органических соединений, в которых преобладает кислотный характер. Из-за природы веществ, из которых он получает свою реакцию, общая кислотность мясного экстракта может быть точно оценена только тогда, когда раствор находится при температуре кипения.

Более того, было замечено, что длительное кипячение (такое, которое требуется при приготовлении питательных сред) вызывает в нем гидролитические изменения, которые повышают его кислотность, и мясной экстракт становится стабильным в этом отношении только после того, как его выдерживали при температуре кипения в течение сорока пяти минут.

Хотя мясной экстракт всегда реагирует кисло по фенолфталеину, он иногда реагирует нейтрально или даже щелочно по лакмусу; и опять же, мясной экстракт, который был сделан точно нейтральным по лакмусу, все еще реагирует кисло по фенолфталеину. Это своеобразное поведение зависит от двух факторов:

1. Лакмус нечувствителен ко многим слабым органическим кислотам, присутствие которых легко определяется фенолфталеином.

2. Двузамещенный фосфат натрия, который образуется в процессе нейтрализации, представляет собой соль, которая реагирует щелочно по лакмусу, но нейтрально по фенолфталеину. Поэтому, чтобы получить точную оценку реакции любого данного образца мясного экстракта, необходимо, чтобы—

1. Мясной экстракт был предварительно подвергнут воздействию температуры 100° C в течение сорока пяти минут.

2. Оценка проводилась при температуре кипения.

3. Фенолфталеин использовался в качестве индикатора.

Оценка проводится с помощью титрования против стандартных растворов каустической соды следующим образом:

Метод оценки реакции. —

Apparatus Required:Solutions Required: 1. 25 c.c. burette graduated in tenths of a centimetre.1. 10N NaOH, accurately standardised. 2. 1 c.c. pipette graduated in hundredths, and provided with rubber tube, pinch-cock, and delivery nozzle.2. n/1 NaOH, accurately standardised 3. 25 c.c. measure (cylinder or pipette, calibrated for 98°C.—not 15°C).3. n/10 NaOH, accurately standardised 4. Several 60 c.c. conical beakers or Erlenmeyer flasks.4. 0.5 per cent. solution of phenolphthalein in 50 percent. alcohol.

5. White porcelain evaporating basin, filled with boiling water and arranged over a gas flame as a water-bath. 6. Bohemian glass flask, fitted as a wash-bottle, and filled with distilled water, which is kept boiling on a tripod stand.

Метод. — Расположите аппаратуру, как показано на рисунке 97.

(А) 1. Заполните бюретку n/10 NaOH.

2. Заполните пипетку n/1 NaOH.

Fig. 97.—Arrangement of apparatus for titrating media.

3. Отмерьте 25 куб. см мясного экстракта (предварительно нагретого в паровой бане при 100° C в течение сорока пяти минут) в один из стаканов с помощью мерного сосуда; ополосните мерный сосуд очень небольшим количеством кипящей дистиллированной воды из промывалки, а затем добавьте эту промывную воду к мясному экстракту, уже находящемуся в стакане.

4. Влейте около 0,5 куб. см раствора фенолфталеина, погрузите стакан в водяную баню и доведите до кипения.

5. В среду в стакане осторожно вливайте n/10 NaOH из бюретки до тех пор, пока не будет достигнута конечная точка, на что указывает появление розоватого оттенка, показанного на рисунке 98 (b). Отметьте количество децинормального раствора соды, использованного в процессе.

Примечание. — Непосредственно перед достижением конечной точки в жидкости можно заметить очень легкую опалесценцию, обусловленную осаждением двузамещенных фосфатов. После достижения истинной конечной точки дальнейшее добавление около 0,5 куб. см децинормального раствора соды даст глубокий пурпурный цвет (рис. 98, c), который является так называемой «конечной точкой» Американского комитета бактериологов.

Fig. 98.—a, Sample of filtered meat extract or nutrient gelatine to which phenolphthalein has been added. The medium is acid, as evidenced by the unaltered colour of the sample. b, The same neutralised by the addition of n/10 NaOH. The production of this faint rose-pink colour indicates that the "end-point," or neutral point to phenolphthalein, has been reached. If such a sample is cooled down to say 30° or 20° C., the colour will be found to become more distinct and decidedly deeper and brighter, resembling that shown in c. c, Also if, after the end-point is reached, a further 0.5 c.c. or 1.0 c.c. n/10 NaOH be added to the sample, the marked alkalinity is evidenced by the deep colour here shown.

(Б) Выполните «контрольное» титрование (иногда могут потребоваться два контроля) следующим образом:

1. Отмерьте 25 куб. см мясного экстракта в один из стаканов, промойте мерный сосуд кипящей водой и добавьте фенолфталеин, как при первой оценке.

2. Влейте n/1 NaOH из пипетки, чуть меньше эквивалента количества децинормального раствора соды, необходимого для нейтрализации 25 куб. см среды. (Например, если при первой оценке для нейтрализации 25 куб. см среды по фенолфталеину потребовалось 5 куб. см n/10 NaOH, добавьте только 0,48 куб. см n/1 NaOH.) Погрузите стакан в водяную баню.

3. Завершите титрование с помощью n/10 NaOH.

4. Отметьте количество раствора n/10 NaOH, необходимое для завершения титрования, и добавьте его к эквиваленту раствора n/1 NaOH, ранее влитого. Примите общую сумму за правильную оценку.

Метод выражения реакции. —

Реакция или титр мясного экстракта, среды или любого раствора, оцененного вышеуказанным образом, наиболее удобно выражается путем указания количества кубических сантиметров нормальной щелочи (или нормальной кислоты), которое потребовалось бы для того, чтобы сделать один литр раствора точно нейтральным по фенолфталеину.

Fig. 99.—Stock bottle for dekanormal soda solution.

Знак + (плюс) ставится перед этим числом, если исходный раствор реагирует кисло, и знак - (минус), если он реагирует щелочно.

Например, «мясной экстракт + 10» указывает на образец мясного экстракта, который реагирует кисло по фенолфталеину и потребовал бы добавления 10 куб. см нормального NaOH на литр для его нейтрализации.

Примечание. — Такой раствор, вероятно, реагировал бы щелочно по лакмусу.

И наоборот, если в результате наших экспериментов по титрованию мы обнаружим, что 25 куб. см мясного экстракта требуют добавления 5 куб. см n/10 NaOH для нейтрализации, то 1000 куб. см мясного экстракта потребуют добавления 200 куб. см n/10 NaOH = 20 куб. см n/1 NaOH.

И эта последняя цифра, 20, перед которой стоит знак + (т. е. +20), чтобы обозначить, что он кислый, указывает на реакцию мясного экстракта.

Примечание. — Стандартные растворы соды должны быть приготовлены путем точных измерительных операций, контролируемых титрованием, из исходного раствора 10N NaOH, который должен быть очень тщательно стандартизирован. Если делается большой запас или потребление невелико, этот исходный раствор должен храниться в аспираторной бутыли, к которой воздух может получить доступ только после того, как он был высушен и освобожден от CO2. Это можно сделать, сначала пропустив его через H2SO4 и натронную известь, или только через натронную известь, с помощью такого устройства, как показано на рисунке 99, который также показывает устройство с постоянной бюреткой для подачи небольших измеренных количеств деканнормального раствора соды.

СТАНДАРТИЗАЦИЯ СРЕД.

Различия в реакции среды, в которой он растет, вызовут не только различия в скорости роста любой данной бактерии, но и хорошо выраженные различия в ее культуральных и морфологических характеристиках; и почти каждый организм, как будет обнаружено, предпочитает определенную «оптимальную реакцию» — точку, которую следует тщательно определить для каждого. Для большинства бактерий, однако, «оптимум» обычно довольно близко приближается к +10; и поскольку эксперимент показал, что эта реакция является наиболее полезной для рутинной лабораторной работы, она является той, которая может быть принята в качестве стандарта для всех питательных сред, полученных из мясного экстракта.

Вкратце, метод стандартизации литра сред до +10 состоит в вычитании 10 из начального титра массы среды; остаток указывает количество кубических сантиметров нормального раствора соды, которое необходимо добавить к среде на литр, чтобы сделать реакцию +10.

Standardising Nutrient Bouillon.—For example, 1000 c.c. bouillon are prepared; at the first titration it is found

1. 25 куб. см требуют добавления 5,50 куб. см n/10 NaOH для нейтрализации.

Два контроля дают следующие результаты:

2. 25 куб. см требуют добавления 5,70 куб. см n/10 NaOH для нейтрализации.

3. 25 куб. см требуют добавления 5,60 куб. см n/10 NaOH для нейтрализации.

Усредняя эти два контроля, 25 куб. см требуют добавления 5,65 куб. см n/10 NaOH для нейтрализации, и поэтому 1000 куб. см требуют добавления 226 куб. см n/10 NaOH, или 22,60 куб. см n/1 NaOH, или 2,26 куб. см n/10 NaOH.

Начальный титр бульона = +22,6, и как таковой требует добавления (22,6 куб. см - 10 куб. см) = 12,6 куб. см n/1 NaOH на литр, чтобы оставить его конечную реакцию +10.

Но три титрования, каждое по 25 куб. см среды, уменьшили исходный объем бульона до (1000 - 75 куб. см) = 925 куб. см. Количество n/1 NaOH, необходимое для того, чтобы сделать реакцию этого количества среды +10, можно вывести следующим образом:

1000 c.c.:925 c.c.::12.6 c.c.:x.

Тогда x = 11,65 куб. см n/1 NaOH.

Всякий раз, когда это возможно, однако, требуемая реакция достигается добавлением деканнормального раствора соды из-за незначительного увеличения, которое он вызывает в объеме, и последующего незначительного нарушения процентного состава среды. С помощью пипетки, градуированной до 0,01 куб. см, можно подавать очень малые количества; но если рассчитанное количество доходит до тысячных долей кубического сантиметра, они заменяются соответствующими количествами нормальной или даже децинормальной соды.

В приведенном выше примере необходимо добавить 11,65 куб. см нормального NaOH или его эквивалент, 1,165 куб. см деканнормального NaOH. Поскольку первое количество слишком велико, а второе неудобно мало для точного измерения, общее количество соды получают путем замены 1,16 куб. см деканнормального раствора соды и либо 0,05 куб. см нормального раствора соды, либо 0,5 куб. см децинормального раствора соды.

Стандартизация питательного агара и желатина. — Метод стандартизации агара и желатина точно такой же, как описанный для бульона.

ФИЛЬТРАЦИЯ СРЕД.

Жидкие среды обычно фильтруют через плотную шведскую фильтровальную бумагу (иногда через фарфоровую фильтровальную свечу), и для ускорения скорости фильтрации фильтровальную бумагу следует складывать в форме, известной как «физиологический фильтр», а не в обычной «квадрантной» форме, так как таким образом для фильтрации доступна большая поверхность и меньшая площадь находится в контакте со стеклянной воронкой, поддерживающей ее.