Нетоксичные основные красители, наиболее часто используемые для прижизненного окрашивания бактерий, — это
Neutral red,}in 0.5 per cent. aqueous solutions. Quinoleine blue} Methylene green} Vesuvin,}
Негативное окрашивание (Бурри). — При этом методе демонстрации внешний вид, представляемый при освещении темного поля (с помощью параболоидного конденсора), близко имитируется, поскольку мельчайшие частицы, бактерии, клетки крови или гноя и т. д. выделяются как ярко-белые или бесцветные тела на темно-серо-коричневом фоне.
Требуемый реактив:
Любые жидкие водостойкие черные чернила для рисования (Chin-chin, Pelican и т. д.). Они готовятся к использованию следующим образом:
Отмерьте и смешайте:
Liquid black ink,25 c.c. Tincture of iodine1 c.c.
Дайте смеси постоять 24 часа, тщательно центрифугируйте, отпипетируйте надосадочную жидкость в чистую бутылку, а затем добавьте кристалл тимола или одну каплю формалина в качестве консерванта.
Метод. —
1. Стерилизованной петлей нанесите одну каплю жидких чернил близко к одному концу предметного стекла 3 на 1 дюйм.
2. Стерилизованной петлей нанесите каплю жидкой культуры (или эмульсии из твердой культуры) рядом с каплей чернил (рис. 69, a); тщательно смешайте две капли с помощью петли.
3. Стерилизуйте петлю.
4. Крепко держите предметное стекло на столе большим и указательным пальцами левой руки, приложенными к концу, ближайшему к капле жидкости.
5. Возьмите другое чистое предметное стекло 3 на 1 дюйм в правую руку и опустите его короткий конец под углом (под углом около 60°) поперек смешанных чернил и культуры на первом стекле, и позвольте жидкости растечься по стеклу и заполнить угол падения.
6. Сохраняя исходный угол, твердо и равномерно потяните второе стекло вдоль первого к концу, наиболее удаленному от левой руки (рис. 69, b).
7. Бросьте второе стекло в банку с дезинфицирующим средством; дайте первому стеклу высохнуть на воздухе.
Fig. 69.—Spreading negative film.
8. Поместите каплю иммерсионного масла в центр пленки, опустите 1/12-дюймовый объектив в масло и исследуйте микроскопически без использования покровного стекла.
(Пленку чернил можно покрыть длинным покровным стеклом и ксилоловым бальзамом в качестве постоянного препарата.)
(b) Препарат «висячая капля». —
1. Нанесите слой стерильного вазелина на верхнюю поверхность кольцевой ячейки предметного стекла для «висячей капли» с помощью стеклянной палочки, прилагаемой к бутылке с вазелином, и поместите стекло на кусок фильтровальной бумаги.
2. «Обожгите» покровное стекло и поместите его на фильтровальную бумагу рядом с предметным стеклом для «висячей капли».
3. Поместите каплю воды в центр покровного стекла с помощью платиновой петли.
4. Получите небольшое количество материала, который необходимо исследовать, способом, описанным выше (шаги 2–11 на страницах 74–76 должны выполняться полностью и с величайшей точностью всякий раз, когда обрабатывается содержимое пробирки), и смешайте его с каплей воды на покровном стекле.
5. Поднимите покровное стекло кончиками пинцета и быстро переверните его на кольцевую ячейку предметного стекла для «висячей капли» так, чтобы капля жидкости занимала центр кольца. (Тщательно избегайте контакта между каплей жидкости и кольцевой ячейкой или слоем вазелина. Если это произойдет, инфицированное предметное стекло для «висячей капли» и его покровное стекло должны быть брошены в банку с лизолом, а препарат сделан заново.)
6. Плотно прижмите покровное стекло к вазелину на верхней части кольцевой ячейки. (Это распределяет вазелин в тонкий слой и, помимо обеспечения адгезии покровного стекла, герметизирует ячейки и тем самым замедляет испарение.)
7. Исследуйте микроскопически.
Исследование «свежего» препарата или препарата «висячая капля» направлено на определение следующих данных:
1. Природа присутствующих бактерий — например, кокки, бациллы и т. д.
2. Чистота культуры; это можно определить только тогда, когда существуют значительные морфологические различия между присутствующими организмами.
3. Наличие или отсутствие спор; при наличии споры очень хорошо проявляют свою типичную преломляющую способность этим методом.
4. Наличие или отсутствие подвижности. В препарате «висячая капля» практически всегда можно наблюдать ту или иную форму движения, и ее характер должен быть тщательно определен путем отслеживания относительных положений соседних микроорганизмов.
(a) Броуновское или молекулярное движение. Мельчайшие частицы твердого вещества (включая бактерии), будучи взвешенными в жидкости, всегда будут демонстрировать вибрационное движение, затрагивающее все поле, но никогда не изменяющее относительные положения бактерий. (Кокки демонстрируют это движение, но, за исключением Micrococcus agilis, кокки неподвижны.)
(b) Потоковое движение. Это происходит из-за токов, возникающих в «висячей капле» в результате сотрясения препарата или испарения, или из-за того, что покровное стекло не идеально ровное, и хотя относительные положения бактерий могут варьироваться, все же потоковое движение большого количества организмов в каком-то одном направлении обычно будет достаточным для демонстрации природы этого движения.
(c) Локомоторное движение, или истинная подвижность, определяется путем наблюдения за какой-то одной конкретной бациллой, меняющей свое положение в поле зрения независимо от других присутствующих организмов и в направлении, противоположном им.
Когда исследование завершено и работа с препаратом закончена, «свежий препарат» — т. е. предметное стекло с прикрепленным покровным стеклом — должен быть брошен в банку с лизолом. Однако в препарате «висячая капля» инфицировано только покровное стекло, и его можно поднять с кольцевой ячейки с помощью пинцета и бросить в дезинфицирующее средство.
Постоянное окрашивание препарата «висячая капля». — Иногда необходимо зафиксировать и окрасить препарат «висячая капля». Это можно сделать следующим образом:
1. Снимите покровное стекло с ячейки с помощью пинцета.
2. Если капля маленькая, зафиксируйте ее, опустив лицевой стороной вниз, пока она еще влажная, на поверхность раствора Гулланда или раствора сулемы (см. стр. 82) в часовом стекле. Если капля большая, поместите ее лицевой стороной вверх на резиновый коврик, накройте перевернутым часовым стеклом и дайте высохнуть. Затем зафиксируйте ее в растворе спирта и эфира (см. стр. 82).
3. Окуните покровное стекло в стакан с горячей водой, чтобы удалить часть вазелина, прилипшего к нему.
4. Промойте последовательно в спирте, ксилоле, эфире и спирте, чтобы удалить последние следы жира.
5. Промойте в воде.
6. Окрасьте, промойте, высушите и смонтируйте, как для обычного пленочного препарата на покровном стекле (см. стр. 83–85).
2. Убитые, окрашенные. — В этом методе необходимы три отдельных процесса:
"Preparing" and "fixing" the film.
Staining.
Mounting.
Подготовка пленки. —
1. Обожгите покровное стекло и поместите его на кусок фильтровальной бумаги.
2. Поместите каплю воды в центр покровного стекла с помощью платиновой петли.
3. Получите небольшое количество материала для исследования на стерилизованную платиновую петлю (см. стр. 74–76, шаги 2–11) и смешайте его с каплями воды на покровном стекле.
4. Распределите каплю эмульсии равномерно по покровному стеклу в форме квадратной пленки на расстоянии до 1 мм от каждого края покровного стекла.
5. Дайте ей полностью высохнуть на воздухе.
Фиксация. — Зафиксируйте, проведя покровное стекло, удерживаемое пальцами, три или четыре раза через пламя Бунзеновской горелки.
В некоторых случаях (например, когда пленки после окрашивания предназначены для микрометрических наблюдений) почти необходимо фиксировать путем воздействия равномерной температуры 115° C в течение двадцати минут. Это лучше всего делать в тщательно регулируемом сушильном шкафу.
Фиксация также может быть осуществлена путем погружения в какую-либо фиксирующую жидкость, например, одну из следующих:
1. Абсолютный спирт, на пять-пятнадцать минут.
2. Абсолютный спирт и эфир в равных частях, на пять-тридцать минут (например, для крови или молока).
3. Osmic acid, 1 per cent. aqueous solution, for thirty seconds.
4. Сулема, насыщенный водный раствор, на пять минут.
5. Сулема (Ланг), на пять минут. Этот раствор готовится путем растворения:
Sodium chloride 0.75 gramme Hydrarg. perchloride 12.00 grammes Acetic acid 5.00 grammes In distilled water100.00 c.c. Filter.
6. Раствор Галланда, на пять минут. Этот раствор готовится путем смешивания:
Absolute alcohol25.0 c.c. Ether25.0 c.c. Corrosive sublimate, 20 per cent. alcoholic solution 0.4 c.c.
7. Формалин, 10-процентный водный раствор (= 4-процентный водный раствор формальдегида, так как формалин представляет собой 40-процентный раствор газа в воде).
Любой из этих методов фиксации коагулирует альбуминовый материал и обеспечивает идеальное прилипание пленки к покровному стеклу.
Осветление. — Тщательно промойте покровное стекло в проточной воде и приступайте к окрашиванию.
Если пленка была приготовлена из бульона, разжиженного желатина, гноя или других патологических экссудатов, пропитайте пленку после фиксации 2-процентным раствором уксусной кислоты и дайте ей подействовать в течение двух минут.
Промойте спиртом, затем оставьте спирт на покровном стекле на две минуты. (Это «осветлит» фон и даст гораздо более четкую и чистую пленку, чем та, которую можно было бы получить в противном случае.)
Если пленка была приготовлена из крови или окрашенной кровью жидкости, после фиксации обработайте ее 2-процентным раствором уксусной кислоты в течение двух минут. Промойте водой, высушите и приступайте к окрашиванию. (Это удалит гемоглобин и облегчит исследование.)
Окрашивание. —
1. Положите покровное стекло пленкой вверх на резиновый коврик.
2. С помощью капельницы покройте сторону покровного стекла с пленкой выбранным красителем, дайте ему подействовать в течение нескольких минут, затем смойте излишки проточной водой.
Проникающая способность красителей повышается (а) физическими средствами — например, нагреванием красителя; (б) химическими средствами — например, добавлением 5-процентного водного раствора карболовой кислоты; 2-процентных водных растворов едких щелочей; воды, насыщенной анилиновым маслом; 0,5-процентного водного раствора буры.
Наиболее часто используемыми красителями для приготовления мазков на покровных стеклах являются анилиновые красители.
(A) Basic:
(a) Methylene-blue.
(b) Gentian violet.
(c) Fuchsin.
Эти красители хранят в насыщенных спиртовых (90-процентных) растворах, чтобы замедлить их разложение.
Две или три капли спиртового раствора этих красителей на, скажем, 4 мл воды обычно создают достаточно сильный окрашивающий раствор для приготовления мазков на покровных стеклах.
Карболовый метиленовый синий (К.М.С.) и карболовый фуксин (К.Ф.) готовят, покрывая покровное стекло 5-процентным раствором карболовой кислоты и добавляя к нему несколько капель насыщенного спиртового раствора метиленового синего или фуксина соответственно. Для анилинового генцианвиолета (А.Г.В.) краситель добавляют к насыщенному раствору анилинового масла в воде.
(d) Thionine blue.
(e) Bismarck brown.
(f) Neutral red.
(B) Acid:
(a) Eosin, aqueous yellowish.
(b) Safranine.
Эти красители хранят в 1-процентном водном растворе, к которому добавлено 5 процентов спирта в качестве консерванта. Обычно их используют в таком виде.
Некоторые ядерные красители (кармин, гематоксилин) иногда используются, особенно при работе с «срезами».
Обесцвечивание. — После перекрашивания пленки можно обесцветить путем промывания в течение более или менее длительного времени в одном из следующих реагентов, расположенных в порядке возрастания их силы:
1. Вода. 2. Хлороформ. 3. Уксусная кислота, 1 процент. 4. Спирт. 5. Абсолютный спирт, равные части. Уксусная кислота, 1 процент, соляная кислота, 1-процентный водный раствор. Соляная кислота, 1-процентный спиртовой (90-процентный) раствор. 6. Минеральные кислоты: серная кислота, 25-процентный водный раствор. Азотная кислота, 33-процентный водный раствор.
Дополнительное окрашивание. — Используйте цвета, которые будут контрастировать с первым красителем; например,
Vesuvin,} Neutral red,}for films stained by methylene-blue or Gram's method. Eosin,} Fuchsin,} Methylene-blue,}for films stained by fuchsin. Gentian violet,}
8. Монтирование. —
1. Тщательно промойте пленку в проточной воде.
2. Удалите излишки воды фильтровальной бумагой или более тщательно высушите между двумя слоями промокательной бумаги.
3. Завершите сушку на воздухе или держа покровное стекло пальцами на безопасном расстоянии над пламенем горелки Бунзена.
4. Поместите каплю ксилолового бальзама в центр чистого предметного стекла размером 3 на 1 дюйм, переверните покровное стекло над бальзамом и осторожно опустите его, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха.
Примечание. — Ксилол предпочтительнее хлороформа для растворения канадского бальзама, так как он не обесцвечивает препарат.
Отпечатки (Klatschpraeparat) готовят из изолированных колоний бактерий, чтобы их характерное строение можно было изучить при более сильном увеличении, чем то, которое можно применить к живой культуре. Их готовят из чашечных культур (см. стр. 230) следующим образом.
1. Достаньте чистое покровное стекло из спиртовки стерильным пинцетом и сожгите спирт.
2. Откройте чашку и положите один край покровного стекла на поверхность среды немного в стороне от выбранной колонии. Осторожно опускайте его над колонией, пока оно не примет горизонтальное положение. Избегайте любого бокового движения или попадания пузырьков воздуха.
3. Слегка надавите вертикально на центр покровного стекла кончиками пинцета, чтобы обеспечить идеальный контакт с колонией.
4. Придержите один край покровного стекла пинцетом, пропустите кончик препаровальной иглы под противоположный край и осторожно поднимите покровное стекло; колония прилипнет к нему. Когда оно будет почти вертикально, возьмите покровное стекло пинцетом и снимите его с чашки. Закройте чашку.
5. Положите покровное стекло пленкой вверх на резиновый коврик и накройте его перевернутым часовым стеклом до высыхания.
6. Зафиксируйте путем погружения в одну из фиксирующих жидкостей, упомянутых ранее (см. стр. 82).
7. Осветлите уксусной кислотой и спиртом.
8. Окрасьте и смонтируйте как обычный мазок на покровном стекле, стараясь выполнять все операции промывки с особой осторожностью.
Микроскопическое исследование неокрашенных препаратов. —
1. Установите тубус микроскопа в вертикальное положение.
2. Расположите предметное стекло с висячей каплей на предметном столике микроскопа так, чтобы капля жидкости находилась на оптической оси инструмента, и закрепите ее в этом положении с помощью пружинных зажимов.
3. Используйте объектив 1/6 дюйма, опустите тубус с помощью кремальеры до тех пор, пока передняя линза объектива не окажется почти в контакте с покровным стеклом — то есть значительно ближе его фокусного расстояния. Лучше всего это делать, наклонив голову в сторону от микроскопа так, чтобы глаза находились на уровне предметного столика.
4. Приложите глаз к окуляру и установите плоское зеркало в положение, обеспечивающее наилучшее освещение.
5. Слегка опустите конденсор и уменьшите апертуру ирисовой диафрагмы так, чтобы свет, хотя и равномерный, был тусклым.
6. Поднимите тубус с помощью грубой настройки до тех пор, пока бактерии не появятся в поле зрения; затем сфокусируйте точно с помощью микрометрического винта.
Иногда поначалу возникают трудности с поиском висячей капли, и если первая попытка оказалась неудачной, студент ни в коем случае не должен, не отрывая глаза от окуляра, опускать тубус (ибо при этом велика вероятность того, что передняя линза объектива будет вдавлена в покровное стекло, что не только испортит препарат, но и загрязнит объектив); напротив, следует отвести глаз, поднять тубус и начать снова с шага 2.
Темнопольное освещение. —
1. Установите штатив микроскопа в вертикальное положение и вставьте самый сильный из имеющихся окуляров.
2. Снимите револьверную головку с тубуса микроскопа и установите на место объектив 2/3 дюйма.
3. Снимите конденсор и замените его темнопольным конденсором.
4. Установите источник освещения на расстоянии 30-50 см от микроскопа. (Это должна быть дуговая лампа «Лилипут» (Leitz), лампа Нернста или лампа накаливания; если используются две последние, между светом и микроскопом необходимо поместить конденсор для получения параллельных лучей); отрегулируйте осветитель и микроскоп так, чтобы плоское зеркало конденсора было полностью заполнено светом.
5. Сфокусируйте два концентрических кольца, выгравированных на верхней поверхности конденсора, и точно отцентрируйте их с помощью центрирующих винтов.
6. Подготовьте «свежий» препарат (см. стр. 74-76) материала, который необходимо наблюдать, используя отборные новые предметные стекла 3 на 1 дюйм толщиной менее 1 мм и покровные стекла № 1 (толщиной 0,17 мм), которые следует очистить куском мягкой замши, а не наждачной бумагой, так как царапины на стекле создают мутность в препарате.
7. Нанесите большую каплю иммерсионного масла (или чистой воды) на верхнюю поверхность конденсора и опустите его на несколько миллиметров.
8. Установите свежий препарат на предметный столик микроскопа и закрепите его зажимами.
9. Поднимайте конденсор до тех пор, пока иммерсионная жидкость не войдет в контакт с нижней поверхностью предметного стекла; избегайте образования пузырьков воздуха.
10. Отрегулируйте зеркало конденсора так, чтобы свет отражался вверх. На свежем препарате в центре поля зрения будет видно яркое пятно.
11. Замените объектив 2/3 дюйма на масляно-иммерсионный объектив 1/12 дюйма, оснащенный специальной диафрагмой для уменьшения его числовой апертуры; поместите каплю иммерсионного масла в центр покровных стекол свежего препарата и опускайте тубус микроскопа до тех пор, пока передняя линза объектива не войдет в каплю масла.
12. Сфокусируйтесь на ярком пятне, упомянутом в шаге 10. Если оно больше не занимает центр поля зрения, изменяйте угол наклона зеркала конденсора, пока оно не окажется в центре.
13. Теперь точно сфокусируйте объектив на пленке, осторожно изменяя высоту темнопольного конденсора, пока не будет найдено наилучшее положение. Интенсивно освещенные бактерии будут выделяться ярким контрастом на темном фоне.
Fig. 70.—Immersion oil bottle.