«Основы бактериологической техники»

Fig. 27.—Water sterilizer.

Это прямоугольная медная коробка длиной 26 см, шириной 18 см и глубиной 12 см, установленная на ножках, нагреваемая снизу горелкой Бунзена или радиальной газовой горелкой и содержащая съемный медный проволочный лоток, который на 2 см меньше стерилизатора по каждому измерению и снабжен ручками. Верхняя часть стерилизатора навешена на петли, образуя крышку.

Метод. —

1. Поместите инструменты и т. д., подлежащие стерилизации, внутрь медной корзины и верните корзину в стерилизатор.

2. Налейте достаточное количество воды в стерилизатор, закройте крышку и зажгите газ внизу.

Fig. 28.—Koch's steriliser.

Fig. 29.—Arnold's steriliser.

3. После того как вода закипит и пар будет выходить из-под крышки в течение не менее десяти минут, погасите газ, откройте крышку, выньте проволочную корзину за ручки и положите ее по диагонали на стенки стерилизатора; содержащиеся в ней инструменты и т. д. теперь стерильны и готовы к использованию.

4. После использования или при случайном загрязнении верните инструменты в корзину и поместите ее обратно в стерилизатор; полностью продезинфицируйте путем повторного кипячения в течение пятнадцати минут.

5. После дезинфекции, пока инструменты еще горячие, выньте их, тщательно и немедленно высушите и верните в футляры для хранения.

Текучий пар — т. е. пар при 100° C — уничтожает вегетативные формы бактерий за пятнадцать-двадцать минут, а споровые формы — за один-два часа. Этот метод в основном используется для стерилизации различных питательных сред, предназначенных для культивирования бактерий, и осуществляется в паровом котле специальной конструкции, известном как паровой стерилизатор Коха (рис. 28), или в одной из его многочисленных модификаций, наиболее эффективной из которых является стерилизатор Арнольда (рис. 29).

Паровой стерилизатор в своей простейшей форме состоит из высокого цилиндрического сосуда из луженого железа или меди, разделенного на две неравные части съемной перфорированной металлической диафрагмой; нижняя, меньшая часть служит резервуаром для воды, а верхняя — для размещения проволочных корзин с предметами, подлежащими стерилизации. Сосуд закрывается свободной конической крышкой, снабженной ручками и перфорированной на вершине трубкой; он установлен на штативе-треноге и нагревается снизу горелкой Бунзена. Более сложный стерилизатор обшит войлоком или асбестовым картоном и снабжен водомерным стеклом, а также краном для опорожнения отделения для воды.

Использование парового стерилизатора. —

1. Заполните отделение для воды до уровня перфорированной диафрагмы, установите крышку на место и зажгите горелку Бунзена.

2. После того как вода закипит, дайте достаточно времени для того, чтобы пар вытеснил воздух из стерилизационного отделения, о чем свидетельствует пар, выходящий ровной, непрерывной струей из трубки в крышке.

3. Снимите крышку, быстро опустите проволочную корзину с пробирками со средами и т. д. в стерилизационное отделение, пока она не встанет на диафрагму, и верните крышку на место.

4. Через двадцать минут в случае жидких сред или тридцать минут в случае твердых сред снимите крышку и извлеките корзину с содержимым.

5. Теперь, но не раньше, погасите газ.

Примечание. После извлечения пробирок, колб и т. д. из парового стерилизатора их следует сразу же расставить свободно, чтобы предотвратить конденсацию влаги на ватных пробках и ее просачивание внутрь пробирок.

Эта обработка уничтожит любые вегетативные формы бактерий; в течение часов охлаждения любые присутствующие споры прорастут, и молодые организмы будут уничтожены повторением процесса двадцать четыре часа спустя; третья стерилизация через аналогичный интервал делает результат двойне надежным.

Метод стерилизации путем воздействия текучим паром при 100° C в течение двадцати минут в течение трех последовательных дней называется прерывистой или дробной стерилизацией.

Воздействие пара при 100° C в течение одного или двух часов, или непрерывная стерилизация, не всегда надежно и поэтому не рекомендуется.

Перегретый пар — т. е. пар под давлением (см. таблицу давления-температуры, Приложение, стр. 500) в герметичных сосудах при температуре 115° C — уничтожит как вегетативные, так и споровые формы бактерий в течение пятнадцати минут; если давление увеличить, а температуру поднять до 120° C, та же цель достигается за десять минут. Этот метод ранее использовался для стерилизации сред (и, действительно, до сих пор используется в некоторых лабораториях), но большинство исследователей теперь понимают, что среды, подвергнутые этой высокой температуре под давлением, претерпевают гидролитические изменения, которые делают их непригодными для культивирования более деликатных микроорганизмов. Использование перегретого пара должно быть ограничено почти исключительно дезинфекцией таких загрязненных предметов, старых культур и т. д., которые нельзя обработать сухим жаром или в печи. Стерилизация с помощью перегретого пара осуществляется в специальном котле — автоклаве Шамберлана (рис. 30). Автоклав состоит из прочного медного цилиндра, снабженного медной или латунной крышкой, которая закрепляется на месте с помощью болтов и барашковых винтов, при этом соединение между цилиндром и крышкой герметично уплотняется прокладкой из резины. Крышка перфорирована для разветвленной трубки, несущей вентиляционный кран, манометр и предохранительный клапан. Медный котел установлен в верхней половине цилиндрического корпуса из листового железа — две концентрические круговые ряды горелок Бунзена, каждая из которых имеет независимую подачу газа, занимают нижнюю половину. Внутри котла находится большая съемная проволочная корзина, установленная на ножках, для размещения предметов, подлежащих стерилизации.

Использование автоклава. —

1. Упакуйте предметы, подлежащие стерилизации, в проволочную корзину.

2. Налейте воду в котел до уровня дна корзины; также наполните водой содержащиеся колбы и пробирки.

3. Убедитесь, что резиновая прокладка на месте, затем установите крышку и плотно закрепите ее на автоклаве с помощью барашковых винтов.

4. Откройте вентиляционный кран и зажгите оба кольца горелок.

5. Когда пар будет выходить ровной, непрерывной струей из вентиляционной трубки, закройте вентиляционный кран и погасите внешнее кольцо газовых горелок.

6. Подождите, пока стрелка манометра не покажет температуру 120° C, затем отрегулируйте газ и пружинный предохранительный клапан таким образом, чтобы эта температура поддерживалась, и оставьте в таком состоянии на двадцать минут. В более дорогих моделях автоклавов эта регулировка предохранительного клапана осуществляется автоматически: манометр оснащен регулируемым указателем, который можно установить на любое требуемое давление-температуру и настроить так, чтобы при совпадении стрелки манометра с регулируемым указателем предохранительный клапан открывался.

7. Погасите газ и дайте стрелке манометра упасть до нуля.

Fig. 30.—Chamberland's Autoclave.

8. Теперь медленно откройте вентиляционный кран и дайте внутреннему давлению сравняться с атмосферным.

9. Снимите крышку и извлеките стерилизованное содержимое.

Периоды стерилизации. — Чрезвычайно полезным устройством для отсчета периодов стерилизации (и, действительно, для многих других операций в лаборатории) является

ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ СИГНАЛЬНЫЕ ЧАСЫ.

Это часы американского типа, циферблат которых окружен металлической пластиной с рядом из 60 отверстий на равном расстоянии друг от друга, соответствующих минутам на циферблате. Эта пластина соединена с одним из полюсов сухой батареи, другой полюс которой соединен с металлическим корпусом часов для приведения в действие обычного магнитного звонка. В центре каждого из отверстий в пластине закреплен металлический стержень, который затем проходит через изолирующее кольцо и выступает внутри циферблата часов, где он контактирует с часовой стрелкой. Часы установлены на тяжелом основании с клавиатурой, содержащей 20 пронумерованных штекеров. Если один из штекеров вставлен в отверстие в пластине, он контактирует со стержнем, и когда часовая стрелка часов касается другого конца, цепь замыкается и звонок начинает звонить. Период этого фрикционного контакта составляет примерно 20 секунд. Таким образом, часы можно использовать для электрической фиксации периодов времени от одной минуты с интервалом в одну минуту до одного часа.

Fig. 31.—Electric signal timing clock.

Фильтрация. — (а) Ватный фильтр. — Практически единственным методом, используемым в лаборатории для стерилизации воздуха или газа, является фильтрация через сухую вату или стекловату, волокна которой запутывают микроорганизмы и предотвращают их прохождение.

Пожалуй, лучшим примером такого фильтра является ватная пробка, закрывающая горлышко пробирки с культурой. Через нее происходит не только обычная диффузия, но если пробирку, закупоренную обычным образом ватой, извлечь из горячего инкубатора, температура содержащегося в ней воздуха быстро падает до температуры лаборатории, и образуется частичный вакуум; воздух проходит в пробирку через ватную пробку, чтобы восстановить равновесие, и, пока пробка остается сухой, в стерильном состоянии. Если, однако, пробка становится влажной, либо в результате поглощения из атмосферы, либо из-за контакта с жидкостями, микроорганизмы (особенно плесневые грибы) начинают размножаться, и длинные нитевидные формы быстро проникают в толщу пробки, проникают внутрь и загрязняют содержимое пробирки.

Fig. 32.—Cotton-wool air filter.

Метод. —

Если желательно стерилизовать газы перед подачей в сосуд, содержащий чистую культуру микроорганизма, как, например, при пропускании тока кислорода над или через бульонную культуру дифтерийной палочки, это можно легко осуществить следующим образом:

1. Возьмите отрезок стеклянной трубки диаметром, скажем, 1,5 см, в центре которой выдута колба, наполните колбу сухой ватой (рис. 32), оберните слой ваты вокруг каждого конца трубки и закрепите на месте витком тонкой медной проволоки или ниткой; затем стерилизуйте этот кусок аппаратуры в сушильном шкафу.

2. Подготовьте культуру в колбе Руффера или Вудхеда (рис. 33), входная трубка которой имеет свободный конец, обернутый слоем ваты, закрепленным ниткой или проволокой, в то время как выходная трубка закупорена обычным образом.

Fig. 33.—Ruffer's flask.

3. Стерилизуйте короткий отрезок резиновой трубки путем кипячения. Перенесите его из кипящей воды в стакан с абсолютным спиртом.

4. Когда все будет готово, извлеките резиновую трубку из спирта с помощью пинцета, тщательно слейте жидкость и пронесите через пламя горелки Бунзена, чтобы сжечь последние следы спирта.

5. Снимите ватные обертки с входной трубки колбы и с одного конца фильтрующей трубки и быстро соедините их с помощью стерильной резиновой трубки.

6. Соедините другой конец колбовой трубки с подающей трубкой от газового резервуара.

Газ при прохождении через сухую стерильную вату в колбе фильтрующей трубки будет очищен от любых содержащихся микроорганизмов и поступит в колбу в стерильном состоянии.

(б) Фарфоровый фильтр. — Стерилизация жидкостей путем фильтрации осуществляется путем пропускания их через цилиндрический сосуд, закрытый с одного конца, как пробирка, и изготовленный либо из пористого «бисквитного» фарфора, твердообожженного и неглазурованного (система Шамберлана), либо из кизельгура, тонкой диатомовой земли (система Беркефельда), и называемый «бужи» или «свеча» (рис. 34).

Примечание. При выборе свечей для использования в лаборатории избегайте тех, у которых есть металлические фитинги, так как во время стерилизации на стыке металла и кремнистого материала возникают трещины из-за неравномерного расширения.

В этом методе бактерии задерживаются в порах фильтра, в то время как жидкость проходит через него в стерильном состоянии.

Очевидно, что для эффективности поры фильтра должны быть чрезвычайно мелкими, и поэтому скорость фильтрации обычно будет низкой. Фильтрующие свечи Шамберлана обладают более тонкими каналами, чем свечи Беркефельда, и, следовательно, фильтруют гораздо медленнее. Чтобы преодолеть этот недостаток, для ускорения процесса можно использовать аспирацию, давление или комбинацию этих двух сил.

Следует отметить, что белые фарфоровые фильтры Doulton столь же эффективны, как и свечи Шамберлана, и фильтруют несколько быстрее.

Необходимая аппаратура. —

1. Делительная воронка, содержащая нефильтрованную жидкость.

2. Стерильная фильтрующая свеча (рис. 34), открытый конец которой снабжен резиновой пробкой (рис. 34, а), перфорированной для приема подающей трубки делительной воронки, а ее горлышко пропущено через большую резиновую шайбу (рис. 34, b), которая плотно прилегает к горлышку фильтровальной колбы.

3. Стерильная фильтровальная колба подходящего размера для приема отфильтрованной жидкости, горлышко которой закрыто ватной пробкой.

4. Водоструйный насос Спренгеля (см. рис. 38, c) или насос Герика (воздушный насос, работающий по гидравлическому принципу, герметизированный маслом с низким давлением паров, рис. 35).

Если используется последний, между фильтровальной колбой и насосом необходимо поместить склянку Вульфа, оснащенную как промывная склянка и содержащую серную кислоту, чтобы предотвратить попадание влажного воздуха в масло в насосе.

5. Воздушный фильтр (см. стр. 40), стерилизованный.

6. Шланг высокого давления.

7. Винтовые зажимы (рис. 36).

Метод. —

1. Соедините выхлопную трубу всасывающего насоса с боковой трубкой фильтровальной колбы (предварительно удалив ватную пробку из последней) с помощью шланга высокого давления, при необходимости поместив между ними промывную склянку с серной кислотой.

Fig. 34.—Porcelain filter candle.

Fig. 35.—Geryk air pump.

2. Удалите ватную пробку из горлышка фильтровальной колбы и установите фарфоровую свечу на место.

Fig. 36.—Screw clamps.

3. Присоедините наконечник делительной воронки к фильтрующей свече с помощью перфорированной резиновой пробки (рис. 37).

Fig. 37.—Apparatus arranged for filtering—aspiration.

4. Откройте кран воронки и откачайте воздух из фильтровальной колбы и промывной склянки; поддерживайте вакуум до завершения фильтрации.

5. По завершении фильтрации закройте кран воронки; установите винтовой зажим на шланг высокого давления, прикрепленный к боковому отводу фильтровальной колбы; плотно затяните его и отсоедините промывную склянку с кислотой.

6. Присоедините воздушный фильтр к открытому концу шланга высокого давления; постепенно откройте винтовой зажим и дайте отфильтрованному воздуху войти в колбу, чтобы устранить отрицательное давление.

7. Отсоедините резиновую трубку от бокового отвода колбы, прокалите конец отвода в горелке Бунзена и закупорьте его отверстие стерильной ватой.

8. Извлеките фильтрующую свечу из горлышка колбы, прокалите горлышко и закупорьте его стерильной ватой.

9. Продезинфицируйте фильтрующую свечу и делительную воронку путем кипячения.

Если необходимо использовать давление в дополнение к всасыванию или вместо него, вставьте перфорированную резиновую пробку в горлышко делительной воронки и закрепите ее медной проволокой; затем вставьте кусок стеклянной трубки через пробку и соедините внешнее отверстие с каким-либо насосом для нагнетания воздуха (обычный ножной насос, такой как используется для накачивания велосипедных шин, является одним из наиболее полезных для этой цели) или с баллоном со сжатым воздухом или другим газом.

Для очень быстрой фильтрации большого объема жидкости необходимо использовать более высокое давление, чем то, которое выдержит стекло, и в этих случаях следует использовать металлический резервуар, разработанный Пейксом (рис. 38, a), для размещения самой фильтрующей свечи, а также жидкости, подлежащей фильтрации. (Во время всего процесса в фильтровальной колбе также должен поддерживаться вакуум с помощью вытяжного насоса.)

Этот аппарат состоит из латунного цилиндра емкостью 2500 куб. см с двумя плечиками и отверстием в горлышке на каждом конце, снабженным винтовой резьбой.

Гайка, несущая манометр, ввинчивается в верхнюю резьбу; а в нижнюю ввинчивается латунный цилиндр, несущий фильтрующую свечу и продолженный вниз в подающую трубку. Утечка предотвращается с помощью резиновых прокладок.

В верхнее плечико вставлена трубка, изогнутая под прямым углом и снабженная краном. Все латунные детали изнутри луженые (рис. 38, a). При использовании резервуар обычно устанавливается на штатив-треногу.

Стерилизация. —

1. Вставьте фильтрующую свечу в ее цилиндр и неплотно ввинтите его.

Fig. 38.—Pakes' filtering reservoir—pressure and aspiration.

2. Оберните слой ваты вокруг подающей трубки и закрепите на месте.

3. Снимите гайку с манометром и закупорьте горлышко ватой.

4. Нагрейте весь аппарат в автоклаве при 120° C в течение двадцати минут.

Метод. —

1. Извлеките аппарат из автоклава и дайте ему остыть.

2. Плотно закрутите корпус, несущий бужи.

3. Установите аппарат в рабочее положение так, чтобы его подающая трубка (с которой была снята ватная обертка) проходила через перфорированную резиновую пробку в горлышке фильтровальной колбы.

Fig. 39.—Closed candle arranged for filtering.

4. Залейте жидкость, подлежащую фильтрации, в цилиндр и навинтите гайку с манометром. (Эту гайку следует погрузить в кипящую воду на несколько минут перед навинчиванием, чтобы стерилизовать ее.)

5. Соедините горизонтальный отвод входной трубки с баллоном со сжатым кислородом (или углекислым газом, рис. 38, b) с помощью шланга высокого давления.

6. Соедините боковой отвод фильтровальной колбы с вытяжным насосом (рис. 38, c) и запустите последний.

7. Откройте кран газового баллона; затем откройте кран на входной трубке фильтрующего цилиндра и повышайте давление внутри него, пока на манометре не будет зафиксирована желаемая точка. Поддерживайте это давление, обычно одну или полторы атмосферы, до завершения фильтрации, регулируя кран на входной трубке.

Некоторые формы фильтрующих свечей изготавливаются с открытым концом, суженным в подающий наконечник, который покрыт глазурью. В этом случае аппарат собирается немного иначе; жидкость, подлежащую фильтрации, помещают в открытый цилиндр, в который погружают свечу, а ее подающий наконечник соединяют с фильтровальной колбой с помощью куска гибкого шланга высокого давления (предварительно стерилизованного кипячением), как на рисунке 39.

IV. МИКРОСКОП.

Основные требования к микроскопу для бактериологической работы можно кратко суммировать следующим образом:

Fig. 40.—Microscope stand.

Инструмент монокулярного типа должен быть хорошего качества изготовления и хорошо отделан, жестким, устойчивым и свободным от вибрации не только в вертикальном положении, но и при наклоне под углом или в горизонтальном положении. Различные шарниры и механизмы должны работать плавно и точно, будучи одинаково свободными от дефектов «люфта» и «проскальзывания». Все винты и т. д. должны соответствовать стандарту Королевского микроскопического общества. Он также должен быть оснащен хорошими линзами и достаточно большим предметным столиком. Детали его составных частей, на которые следует обратить особое внимание, следующие:

Fig. 41.—Foot, three types.

1. Основание или ножка (рис. 40, a). — Две элементарные формы — штатив (рис. 41, a) и вертикальная колонна, установленная на пластине, известной как «подкова» (рис. 41, b), — служат образцами для бесчисленных модификаций формы и размера этой части штатива. Главные пожелания — устойчивость и простота манипуляций — достигаются в первой за счет «размаха» трех ножек, которые обычно подбиты пробкой; во второй — за счет собственного веса опорной пластины. Штатив является механически более правильной формой, и для практического использования он предпочтительнее. Его главный конкурент, ножка Джексона (рис. 41, c), основан на том же принципе, и с точки зрения внешнего вида его можно рекомендовать.

2. Тубус (рис. 40, b) может быть либо так называемым «длинным» или «английским» (длина 250 мм), либо «коротким» или «континентальным» (длина 160 мм). Ни одна из длин, по-видимому, не обладает существенным преимуществом перед другой, но абсолютно необходимо обеспечить объективы, изготовленные для выбранной длины тубуса. В высококлассных микроскопах наших дней тубус обычно короче континентального, но снабжен выдвижной трубкой, которая при полном выдвижении дает длину тубуса больше английской, тем самым позволяя использовать любую форму объектива.

Fig. 42.—Coarse adjustment.

Fig. 43.—Fine adjustment.

Для практических целей длина тубуса = расстояние от конца револьверной головки до глазной линзы окуляра. Это измерение, на которое ссылаются, говоря о «длинном» или «коротком» тубусе.

3. Грубая настройка (рис. 40, c) должна представлять собой реечно-шестереночный механизм, при этом устойчивость и плавность хода обеспечиваются точно подогнанными направляющими типа «ласточкин хвост» и идеальным соответствием между зубьями рейки и зубьями шестерни (рис. 42). Также следует предусмотреть возможность устранения «люфта» (например, с помощью винтов AA, рис. 42).

4. Тонкая настройка (рис. 40, d) ни в коем случае не должна зависеть от прямого действия пружин, а должна быть рычажного типа, предпочтительно Нельсона (рис. 43). В этой форме неравная длина плеч рычага обеспечивает очень деликатное движение, и, кроме того, лишь небольшая часть веса тубуса передается на резьбу вертикального винта, приводящего в действие механизм.

Fig. 44.—Spindle head to fine adjustment.

Микрометрический винт со шпинделем (рис. 44) окажется очень полезным устройством, если его установить вместо обычного винта, управляющего тонкой настройкой. В этом приспособлении ось винта продолжена вверх в виде короткой колонки, диаметр которой составляет одну шестую диаметра головки. Шпиндель можно быстро вращать пальцами для настройки средних увеличений, в то время как большую головку можно медленно перемещать при фокусировке больших увеличений.

5. Предметный столик (рис. 40, e) должен быть квадратной формы и иметь большую площадь — не менее 12 см, — быть плоским и жестким, чтобы служить надежной опорой для чашки Петри, используемой при культивировании на пластинках; он должен быть снабжен пружинными зажимами (которые можно снимать по желанию) для фиксации предметных стекол размером 3 на 1 дюйм.

Механический столик следует считать скорее необходимостью, чем роскошью, насколько это касается бактериолога, так как при работе с большими увеличениями, и особенно при исследовании препаратов «висячая капля», практически невозможно выполнять достаточно тонкие движения пальцами. При выборе механического столика предпочтение следует отдавать тому, который является неотъемлемой частью инструмента (рис. 45), а не тому, который нужно каждый раз прикреплять к обычному простому столику, когда это требуется, и его перемещения должны контролироваться неподвижными головками с накаткой (рис. 45, AA'). Форма апертуры — немаловажный момент; она должна быть квадратной, чтобы обеспечить свободное движение над конденсором. В механическом столике должны быть нарезаны отверстия для трех (съемных) винтовых штифтов, используемых вместо подвижной планки, чтобы при желании можно было использовать верньерный искатель (рис. 45, BB'), которым обычно оснащается этот класс столиков, или искатель Мальтвуда.

Fig. 45.—Mechanical stage.

Fig. 46.—Iris diaphragm.

6. Диафрагма. — Следует избегать отдельных простых диафрагм; предпочтительнее вращающаяся пластина с отверстиями разного размера, закрепленная под столиком, но, несомненно, лучшей формой является «ирисовая» диафрагма (рис. 46), которая входит в конструкцию конденсора.

7. Конденсор является необходимой частью оптического оснащения. Его цель — собрать пучок параллельных лучей света, отраженных плоским зеркалом, с помощью короткофокусной системы линз в конус с большой апертурой (уменьшаемой по желанию с помощью ирисовой диафрагмы, установленной как часть конденсора), который можно точно сфокусировать на плоскости объекта. Эта фокусировка должна выполняться заново для каждого объекта из-за различий в толщине предметных стекол.

Наиболее распространенной формой является так называемый конденсор Аббе (рис. 47), состоящий из плосковыпуклой линзы, установленной над двояковыпуклой линзой. Эта комбинация находится в центрирующем держателе, известном как подстольное устройство, расположенном под столиком микроскопа (рис. 40, f), и должна быть точно отрегулирована так, чтобы ее оптическая ось совпадала с осью объектива. Вертикальное перемещение всего подстольного устройства, осуществляемое с помощью реечного механизма, является несомненным преимуществом, и должны быть предусмотрены средства для временного выведения конденсора из оптической оси микроскопа.

Fig. 47—Optical part of Abbé illuminator.

Однако при работе с иммерсионным объективом следует использовать ахроматический конденсор, дающий освещающий конус около 0,9, если необходимо получить полную отдачу от линзы. Обычно считается, что хороший объектив требует освещающего конуса, эквивалентного двум третям его числовой апертуры. Лучший конденсор Аббе пропускает конус около 0,45, в то время как апертура 1/12-дюймовых иммерсионных линз разных производителей варьируется от 1,0 до 1,4, следовательно, эффективность этих линз значительно снижается, если конденсор — просто Аббе. Эти улучшенные конденсоры должны быть абсолютно центрированы по отношению к объективу и способны к очень точной фокусировке, иначе большая часть их ценности теряется.

8. Зеркала. — Под конденсором прикреплен карданный подвес, несущий вращающуюся круглую рамку с плоским зеркалом с одной стороны и вогнутым зеркалом с другой (рис. 40, g). Обычно используется плоское зеркало, но иногда, например, при использовании малых увеличений, когда конденсор опущен и выведен из оптической оси, используется вогнутое зеркало.

9. Окуляры. — Те, что известны как окуляры Гюйгенса (рис. 48), будут достаточны для всей обычной работы без прибегания к более дорогим «компенсационным» окулярам. Два или три окуляра, увеличивающие «реальное» изображение (сформированное объективом) в четыре, шесть или восемь раз соответственно, составляют полезное оснащение.

В качестве принадлежности окуляр Эрлиха является очень полезным аппаратом, когда необходимо проводить подсчет клеток или бактерий. Это обычный окуляр, оснащенный регулируемой квадратной диафрагмой, управляемой рычагом, выступающим сбоку оправы. На одной из сторон квадрата сделаны три выемки, и при перемещении рычага квадратную апертуру можно уменьшить до трех четвертей, одной второй или одной четверти от исходного размера.

10. Объективы. — Необходимы три объектива: один для работы с малым увеличением — например, 1 дюйм, 2/3 дюйма или 1/2 дюйма; один для работы с большим увеличением — например, 1/12-дюймовая масляная иммерсионная линза; и промежуточная линза «среднего увеличения» — например, 1/6 дюйма или 1/8 дюйма (сухая). Эти линзы должны быть тщательно отобраны, при этом особое внимание следует уделить следующим пунктам:

(a) Исправление сферической аберрации. — Сферическая аберрация приводит к нечеткому изображению из-за того, что центральные и периферические лучи фокусируются в разных точках.

(b) Исправление хроматической аберрации. — Хроматическая аберрация приводит к появлению цветной каймы вокруг краев объектов из-за того, что лучи спектра разного цвета обладают разной преломляющей способностью и простая линза действует на них как призма.

(c) Плоскостность поля зрения. — Идеальное поле зрения должно быть большим и, прежде всего, плоским; другими словами, объекты на периферии поля должны быть так же отчетливо «в фокусе», как и объекты в центре. К сожалению, однако, это оптически невозможно, и поле всегда имеет сферическую форму. Некоторым производителям удается обеспечить большую центральную область, которая находится в фокусе одновременно, чем другим, и хотя теоретически это может вызвать бесконечно малое принесение в жертву других качеств, к этому всегда следует стремиться. Последовательные зоны и все периферийное кольцо должны попадать в фокус при изменении точной настройки. Эта одновременная резкость всего круга является признаком идеальной центрировки всех линз в объективе.

Fig. 48.—Huyghenian eyepiece.

(d) Хорошая разрешающая способность. — Фактическое увеличение, конечно, в определенных пределах, менее ценно, чем четкость и высокая разрешающая способность, ибо именно от этих свойств зависит наше знание детальной структуры исследуемых объектов.

(e) Числовая апертура (N. A.). — Числовую апертуру можно определить в общих чертах как отношение эффективного диаметра задней линзы объектива к его эквивалентному фокусному расстоянию. Определение этого параметра — процесс, требующий значительного технического мастерства и математических способностей, и он полностью выходит за рамки возможностей среднего микроскописта. [1]

Хотя с увеличением мощности соответственно трудно совместить все эти исправления в одном объективе, они доведены до высокой степени совершенства в современных «ахроматических» объективах, что устраняет необходимость использования более дорогих и менее долговечных апохроматических линз.

При выборе объективов лучшими «тестовыми» объектами для использования являются:

1. A thin (one cell layer), even} { 1", 2/3", 1/2": "blood film," stained with Jenner's}for{ 1/6", 1/8" or Romanowsky's stain.} { 1/12" oil 2. A thin cover-slip preparation} of a young cultivation of} {1/8" dry B. diphtheriæ (showing}for{ segmentation) stained with} {1/12" oil methylene-blue.

Принадлежности. — Наглазник (рис. 49). — Этот аппарат состоит из грушевидного куска черненого металла или эбонита, прикрепленного на шарнирах к кольцу, которое вращается на верхней части тубуса микроскопа. Его можно использовать для того, чтобы закрыть изображение окружающих предметов от незадействованного глаза, и при проведении длительных наблюдений он окажется весьма полезным.

Револьверное устройство. — Пожалуй, самая полезная принадлежность — это револьвер для двух объективов (рис. 50) или, что еще лучше, для всех трех (рис. 51). Это револьверное устройство, предпочтительно изготовленное из алюминия, должно быть закрытого типа и состоять из изогнутой пластины, прикрепленной к нижнему концу тубуса, — в ней вырезано круглое отверстие, соответствующее просвету тубуса. К нижней поверхности этой пластины на шарнире прикреплена аналогично изогнутая пластина, снабженная тремя трубками, каждая из которых несет объектив. Вращая нижнюю пластину, каждый из объективов можно последовательно вводить в оптическую ось микроскопа.

Fig. 49.—Eye shade.

Однако для критической работы и особенно для фотомикрографии сменный револьвер отнюдь не идеален, так как практически невозможно обеспечить точную центрировку каждой линзы на оптической оси. Поэтому для специальных целей необходимо использовать специальное револьверное устройство, например, производства Zeiss или Leitz, в которое каждый объектив вставляется на своем собственном держателе и на котором он точно центрируется.

Fig. 50.—Double nosepiece.

Fig. 51.—Triple nosepiece.

Термостолик (рис. 52). — Это плоский металлический корпус, содержащий систему трубок, через которые может циркулировать вода любой требуемой температуры. Он крепится к столику микроскопа винтами AA' и имеет большое отверстие, совпадающее с оптической осью микроскопа; короткая трубка B, выступающая с одного конца термостолика, позволяет подавать воду желаемой температуры из резервуара через отрезок резиновой трубки внутрь столика, а аналогичная трубка на другом конце столика B' позволяет отводить отработанную воду. Повышая температуру препаратов «висячая капля» и т. д., помещенных на него, выше температуры окружающей среды, термостолик делает возможными точные наблюдения за прорастанием спор, культивированием в «висячей капле» и т. д.

Fig. 52.—Warm stage.

Лучшей формой является электрический термостолик, разработанный Лоррейн Смит; [2] он требует добавления лампового сопротивления и ползункового реостата, а также чувствительного амперметра с ценой деления 0,01 ампера. Он состоит из деревянной рамы, поддерживающей плоскую стеклянную колбу с длинным горлышком, изогнутым вверх под тупым углом (рис. 53). Колба заполнена жидким парафином, который поднимается в открытом горлышке при расширении от нагрева. В горлышке также размещается термометр. Две катушки из манганиновой проволоки проходят в парафине с противоположных сторон колбы (вне поля зрения), соединенные с латунными клеммами на деревянной раме платиновой проволокой, впаянной в стекло. Сопротивление двух катушек, соединенных последовательно, составляет около 10 Ом. Требуется ток 2,5 ампера, который подводится к катушкам в столике через реостат. С помощью амперметра можно получить и поддерживать любую желаемую температуру до примерно 200° C. Если обеспечить контакт иммерсионного масла между верхней линзой конденсора и нижней поверхностью колбы, этот столик очень хорошо работает с 1/12-дюймовым масляным иммерсионным объективом.

Fig. 53.—Lorrain Smith's warm stage.

Конденсор темного поля или параболоидный конденсор. — Это иммерсионный подстольный конденсор с высокой апертурой, с помощью которого неокрашенные объекты, такие как бактерии, могут быть показаны как ярко-белые частицы на густом черном фоне. Центральные лучи света блокируются непрозрачной заслонкой, в то время как периферические лучи отражаются от параболоидных сторон конденсора и преломляются рассматриваемым объектом. Для получения наилучших результатов с этим типом конденсора необходим мощный источник света — например, небольшая дуговая лампа или лампа накаливания — вместе с отобранными предметными стеклами определенной толщины (указанной для конкретной марки конденсора, но обычно 1 мм) и специально тонкими покровными стеклами (не более 0,17 мм). Объектив не должен иметь числовую апертуру выше 1,0, следовательно, иммерсионные линзы должны быть оснащены внутренней диафрагмой для уменьшения апертуры.

Микрометр. — Также необходима некоторая форма микрометра для измерения бактерий и других объектов. Подробности о тех, что используются в общем порядке, можно найти на следующих страницах.

Fig. 54—Diamond Object marker.

Маркировщик объектов (рис. 54). — Это чрезвычайно полезный аппарат. Сделанный в форме объектива, он имеет линзы, замененные алмазным острием, установленным немного не по центру, которое можно вращать с помощью рифленой пластины. Привинченный к револьверу вместо объектива, вращение алмазного острия прочертит небольшой круг на предметном стекле, чтобы навсегда зафиксировать положение интересной части препарата. Алмаз установлен на пружине, которая регулирует давление, а размер круга можно регулировать с помощью бокового винта.

МЕТОДЫ МИКРОМЕТРИИ.

Единицей длины, применяемой для измерения микроскопических объектов, является одна тысячная часть миллиметра (0,001 мм), называемая микроном (иногда ошибочно называемым микрометром) и обозначаемая при письме греческой буквой µ. Из многих методов, используемых для измерения бактерий, здесь будут описаны только три, а именно:

(a) С помощью камеры-люциды.

(b) С помощью окулярного микрометра.

(c) С помощью филярного микрометра (микрометрический окуляр Рамсдена).

Для каждого из этих методов необходим объект-микрометр. Это стеклянная пластинка размером 3 на 1 дюйм, на которой выгравирована шкала, разделенная на сотые доли миллиметра (0,01 мм), причем каждая десятая линия сделана длиннее промежуточных для облегчения счета; и по этим выгравированным линиям в каждом случае оценивается измерение. Покровное стекло приклеено поверх шкалы для защиты от повреждений.

Fig. 55.—Camera lucida, Abbé pattern.

(a) С помощью камеры-люциды.

1. Прикрепите камеру-люциду (модели Волластона, Била или Аббе) (рис. 55) к окуляру микроскопа.

2. Установите микрометр на предметный столик микроскопа и точно сфокусируйте деления.

3. Проецируйте шкалу объект-микрометра на лист бумаги и пером или карандашом зарисуйте увеличенное изображение, каждое деление которого соответствует 10 µ. Отметьте на бумаге оптическую комбинацию (окуляр, объектив и длину тубуса), использованную для получения этого конкретного увеличения.

4. Повторите эту процедуру для каждой из возможных комбинаций окуляров и объективов, установленных на имеющемся микроскопе, и тщательно сохраните полученные таким образом шкалы.

Чтобы измерить объект этим методом, просто проецируйте изображение на шкалу, соответствующую конкретной оптической комбинации, используемой в данный момент. Считайте количество делений, которое он занимает, и выразите их в микронах.

Вместо сохранения шкалы для каждой оптической комбинации, измеряемый объект и шкалу микрометра можно проецировать и зарисовывать по очереди на одном и том же листе бумаги, при этом тщательно следя за тем, чтобы центр окуляра находился на расстоянии 25 см от бумаги, на которой нарисованы деления.

Fig. 56.—Eyepiece micrometer, ordinary.

Fig. 57.—Eyepiece micrometer, net.

(b) С помощью окулярного микрометра.

Окулярный микрометр представляет собой круглый стеклянный диск, на котором выгравирована шкала, разделенная на десятые доли миллиметра (0,1 мм) (рис. 56), или вся поверхность расчерчена на квадраты 0,1 мм (сетчатый микрометр) (рис. 57). Его можно установить внутри оправы любого окуляра чуть выше апертуры диафрагмы, и он должен быть отрегулирован точно в фокусе глазной линзы.

Некоторые производители монтируют стеклянный диск вместе с круглым покровным стеклом таким образом, что при установке в любой окуляр Гюйгенса их собственного производства шкала оказывается точно в фокусе для нормального зрения. Также можно приобрести специальные окуляры, имеющие подвижную регулировку глазной линзы для фокусировки микрометра.

Значение одного деления шкалы микрометра должно быть сначала определено для каждой оптической комбинации с помощью объект-микрометра, следующим образом:

1. Вставьте окулярный микрометр внутрь окуляра и установите объект-микрометр на предметный столик микроскопа.

2. Точно сфокусируйте шкалу объект-микрометра; линии будут казаться расположенными непосредственно под линиями окулярного микрометра. Сделайте линии на двух микрометрах параллельными, вращая окуляр.

3. Совместите две линии окулярного микрометра с линиями, ограничивающими одно деление объект-микрометра; это достигается увеличением или уменьшением длины тубуса; и отметьте количество включенных делений.

4. Рассчитайте значение каждого деления окулярного микрометра в микронах с помощью следующей формулы:

x = 10 y.

Where x = the number of included divisions of the eyepiece micrometer.

y = the number of included divisions of the stage micrometer.

5. Отметьте оптическую комбинацию, использованную в этом эксперименте, и запишите ее вместе с рассчитанным значением микрометра.

Повторите этот процесс для каждой из других комбинаций. Тщательно записывайте результаты.

Чтобы измерить объект этим методом, считайте количество делений окулярного микрометра, которое он занимает, и выразите результат в микронах, обратившись к стандартному значению для конкретной используемой оптической комбинации.

Zeiss готовит компенсационный окулярный микрометр для использования со своими апохроматическими объективами, деления которого вычислены так, что (при длине тубуса 160 мм) значение каждого эквивалентно стольким микронам, сколько миллиметров составляет фокусное расстояние используемого объектива.

Эйконометр Райта — это, по сути, модификация окулярного микрометра для быстрого измерения микроскопических объектов путем прямого осмотра, после предварительного определения увеличительной способности конкретной используемой оптической комбинации. Это небольшой аппарат, напоминающий окуляр, с подвижной глазной линзой, которую можно точно сфокусировать на микрометрической шкале, закрепленной внутри инструмента. При помещении над окуляром микроскопа деления этой шкалы измеряют фактический размер виртуального изображения в миллиметрах.

Чтобы использовать этот инструмент для прямого измерения, сначала необходимо определить увеличительную способность каждой комбинации окуляра, длины тубуса и объектива.

Поместите объект-микрометр, разделенный на сотые доли миллиметра, на предметный столик микроскопа и точно сфокусируйте.

Установите эйконометр на окуляр. Наблюдение через эйконометр показывает его микрометрическую шкалу, наложенную на изображение объект-микрометра.

Вращайте эйконометр до тех пор, пока линии на двух шкалах не станут параллельными, и выполните различные регулировки, чтобы убедиться, что две линии на шкале эйконометра совпадают с двумя линиями на объект-микрометре.

Для иллюстрации можно предположить, что пять делений на объект-микрометре точно заполняют одно из делений шкалы эйконометра; это указывает на увеличительную способность 500 как константу для этой конкретной оптической комбинации, и этот факт следует записать.

Константы увеличения различных других оптических комбинаций следует аналогичным образом определить и записать.

Для измерения любого объекта впоследствии его следует сначала тщательно сфокусировать обычным способом.

Затем следует приложить эйконометр к окуляру и считать размер объекта по шкале эйконометра в миллиметрах, а фактический размер рассчитать, разделив наблюдаемый размер на константу увеличения для конкретной оптической комбинации, использованной при наблюдении.

(c) С помощью филярного микрометра.

Fig. 58.—Ramsden's Filar micrometer.

Fig. 59.—Ramsden's micrometer field, a, fixed wire; b, reference wire (fixed); c, travelling wire.

Филярный или паутинный микрометр (микрометр Рамсдена) (рис. 58) состоит из окуляра, имеющего тонкую «фиксированную» нить, натянутую горизонтально через поле зрения (рис. 59), вертикальную контрольную нить — фиксированную — отрегулированную под прямым углом к первой; и тонкую нить, параллельную контрольной нити, которую можно перемещать по полю зрения с помощью микрометрического винта; головка барабана разделена на сто частей, которые последовательно проходят мимо фиксированного индекса при вращении головки. В нижней части поля зрения находится гребенка, интервалы между зубцами которой соответствуют одному полному обороту этой винтовой головки.

Как и в предыдущем методе, значение каждого деления шкалы микрометра (т. е. гребенки) должно быть сначала определено для каждой оптической комбинации. Это осуществляется следующим образом:

1. Установите филярный микрометр и объект-микрометр в их соответствующие положения.

2. Вращайте винт филярного микрометра до тех пор, пока подвижная нить не совпадет с фиксированной, а индекс не укажет ноль на головке барабана. (Если при нулевом положении головки барабана две нити не совпадают точно, их необходимо отрегулировать, ослабив винт барабана и переустановив барабан.)

3. Точно сфокусируйте шкалу каждого микрометра и сделайте линии на них параллельными.

4. Вращайте головку микрометрического винта до тех пор, пока подвижная линия не пройдет одно деление объект-микрометра. Отметьте количество полных оборотов (с помощью регистрирующей гребенки) и доли оборота (с помощью шкалы на головке микрометрического винта), которые требуются для измерения 0,01 мм.

5. Сделайте несколько таких оценок и усредните результаты.

6. Отметьте оптическую комбинацию, использованную в этом эксперименте, и тщательно запишите ее вместе со значением микрометра в микронах.

7. Повторите этот процесс для каждой из различных оптических комбинаций и запишите результаты.

Чтобы измерить объект этим методом, просто отметьте количество оборотов и долей оборота винтовой головки, необходимых для прохождения такого объекта от края до края, и выразите результат в микронах, обратившись к записанным значениям для этой конкретной оптической комбинации.

Осветитель микроскопа. — В тропических и субтропических регионах лучшим источником света является рассеянный дневной свет. Однако в умеренном климате дневной свет в желаемом количестве доступен не всегда, и приходится прибегать к масляным лампам, газовым лампам — предпочтительно с калильными сетками — и электричеству; и из них последнее, несомненно, является лучшим. Удобный держатель для лампы, который можно изготовить в лаборатории, показан на рис. 60. Он состоит из базовой доски, утяжеленной свинцом, к которой прикреплен обычный бытовой патрон для лампы, а позади него закреплен изогнутый отражатель из листового железа. Матовая лампа с металлической нитью накаливания мощностью около 16 свечей дает наиболее подходящий свет, и если нужен монохроматический свет, синий жирный карандаш наносится штрихами на сторону лампы, ближайшую к микроскопу; включается ток, и когда стеклянная колба нагреется, протирание ватным тампоном легко распределит синий жирный материал ровной пленкой по матовому стеклу.

Fig. 60.—Electric microscope lamp.

СНОСКИ:

[1] Однако ее важность будет осознана, если привести слова покойного профессора Аббе: «Числовая апертура линзы определяет все ее существенные качества; яркость изображения увеличивается при заданном увеличении и прочих равных условиях как квадрат апертуры; разрешающая и определяющая способности напрямую связаны с ней, фокусная глубина дифференциации глубин изменяется обратно пропорционально апертуре и так далее».

[2] Изготовлено г-ном Отто Баумбахом, 10, Лайм Гроув, Манчестер.

V. МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИЙ И ДРУГИХ МИКРОГРИБОВ.

АППАРАТУРА И РЕАКТИВЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ОБЫЧНОМ МИКРОСКОПИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ.

Ниже перечислены основные аппараты и реактивы для рутинной работы, которыми должен быть обеспечен каждый студент.

1. Резиновый «коврик для смены», на котором можно оставлять покровные стекла во время процесса окрашивания.

2. Квадраты промокательной бумаги размером около 10 см для сушки покровных и предметных стекол.

(Фильтровальная бумага, известная как «немецкая линованная» — хорошо впитывающая, плотно сплетенная бумага с ровной поверхностью и без рыхлого «пуха», который мог бы прилипнуть к препаратам, — является наиболее полезной для этой цели.)

Fig. 61.—Disinfectant Jar.

3. Стеклянная банка, наполненная 2-процентным раствором лизола, для приема инфицированных покровных стекол, инфицированных пипеток и т. д.

4. Квадратная глазурованная глиняная коробка со свободной подкладкой, содержащая 2-процентный раствор лизола, для приема инфицированного материала и использованных предметных стекол. Дно подкладки перфорировано, так что, когда она заполнена, подкладку с ее содержимым можно целиком вынуть из коробки, при этом дезинфицирующий раствор стекает, а предметные стекла и т. д. можно легко высыпать. Затем пустую подкладку возвращают в коробку с ее дезинфицирующим раствором (рис. 61).

5. Бунзеновская горелка, снабженная байпасом для «дежурного пламени».

6. Фарфоровый лоток, вмещающий пять или шесть предметных стекол для «висячей капли» (рис. 62).

Fig. 62.—Hanging-drop slides: a, Double cell seen from above; b, single cell seen from the side.

Лучшей формой предметного стекла для «висячей капли» является модификация стекла с кольцом Бёттхера, которая готовится путем приклеивания круглой ячейки из олова диаметром 13–15 мм и высотой 1–2 мм к центру предметного стекла 3 на 1 дюйм с помощью канадского бальзама. Часто бывает чрезвычайно удобно иметь две такие ячейки, приклеенные близко друг к другу на одном стекле (рис. 62, a).

Существует еще одна форма предметного стекла для «висячей капли», в которой круглое или овальное углубление или «ячейка» вышлифовывается в центре стекла 3 на 1 дюйм. Они дороже, с ними менее удобно работать, они легче загрязняются каплями исследуемого материала, и их следует тщательно избегать.

7. Три алюминиевых стержня (рис. 63), каждый длиной около 25 см, несущие кусок платино-иридиевой проволоки калибра 0,015 длиной 7,5 см. Конец одной из проволок загнут, образуя овальную петлю с коротким диаметром около 1 мм, и называется петлей или «озе»; терминальные 3 или 4 мм другой проволоки сплющены путем постукивания по гладкой железной поверхности, образуя «шпатель»; третья оставлена нетронутой или заострена с помощью напильника. Эти инструменты используются для инокуляции пробирок с культурой и подготовки препаратов для микроскопического исследования.

Fig. 63.—Ends of platinum rods. a, loop; b, spatula; c, needle.

Метод крепления этих проволок можно описать следующим образом:

Возьмите кусок алюминиевой проволоки длиной 25 см и диаметром около 0,25 см и просверлите тонкое отверстие полностью через проволоку на расстоянии около сантиметра от одного конца. Проделайте прямой узкий канал вдоль одной стороны проволоки, по ее длинной оси, от отверстия до ближайшего конца, сначала неглубокий, но постепенно становящийся глубже.

На противоположной стороне проволоки сделайте короткий разрез длиной 2 мм, ведущий от отверстия в том же направлении. [Использование тонкого стоматологического бора и маленькой циркулярной пилы, приводимых в действие стоматологическим мотором, облегчает изготовление этих инструментов с алюминиевыми ручками.]

Теперь пропустите один конец платиновой проволоки через отверстие, отогните около 2 мм под прямым углом и вдавите короткий кусок в короткий разрез. Резко поверните длинный конец проволоки, также под прямым углом, и утопите его в длинный канал так, чтобы он выходил примерно из центра срезанного конца алюминиевой проволоки (рис. 63). Несколько резких ударов часовым молотком теперь закроют стороны двух каналов поверх проволоки и надежно удержат ее.

Fig. 64.—Platinum rod in aluminium handle—method of mounting.

The platinum wire may be fused into the end of a piece of glass rod, but such a handle is vastly inferior to aluminium and is not to be recommended.

8. Две пары остроконечных пружинных пинцетов (длиной 10 см), один из которых должен содержаться в идеальной чистоте и предназначаться для работы с чистыми покровными стеклами, а другой — для использования во время операций окрашивания.

9. Коробка чистых предметных стекол 3 на 1 дюйм.

10. Стеклянная капсула с плотно прилегающей (притертой) стеклянной крышкой, содержащая чистые покровные стекла в абсолютном спирте.

11. Один из «жирных карандашей» Фабера (желтый, красный или синий) для письма по стеклу.

12. Деревянная стойка (рис. 65) с двенадцатью капельницами (рис. 66) емкостью по 60 куб. см каждая, содержащими

Aniline water.

Gentian violet, saturated alcoholic solution.

Lugol's (Gram's) iodine.

Absolute alcohol.

Methylene-blue, }

Fuchsin, basic, } saturated alcoholic solution.

Neutral red, 1 per cent. aqueous solution.

Leishman's modified Romanowsky stain.

Carbolic acid, 5 per cent. aqueous solution.

Acetic acid, 1 per cent. solution.

Sulphuric acid, 25 per cent. solution.

Xylol.

Fig. 65.—Staining rack, rubber change mat and lysol pot.

Fig. 66.—Drop bottle.

Fig. 67.—Canada balsam pot.

И две банки с герметичными стеклянными крышками (рис. 67), каждая снабжена стеклянной палочкой и наполнена соответственно канадским бальзамом, растворенным в ксилоле, и стерильным вазелином.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Бактерии и т. д. исследуются микроскопически.

1. In the living state, unstained, or stained.

2. In the "fixed" condition (i. e., fixed, killed, and stained by suitable methods).

Подготовку препарата из пробирочной культуры для исследования этими методами можно описать следующим образом:

1. Живые, неокрашенные. — (a) «Свежий» препарат. —

1. Очистите и высушите предметное стекло 3 на 1 дюйм и поместите его на один из квадратов фильтровальной бумаги. Нанесите каплю воды (предпочтительно дистиллированной) или каплю 1-процентного раствора едкого кали в центр стекла с помощью платиновой петли.

Fig. 68.—Holding tubes for removing bacterial growth, as seen from the front.

Техника открывания и закрывания пробирки с культурой.

2. Извлеките пробирочную культуру из стойки или банки левой рукой и подожгите ватную пробку, поднеся ее к пламени Бунзеновской горелки. Потушите пламя, подув на пробку, вращая при этом пробирку вокруг ее длинной оси, горлышком вертикально вверх, между большим и остальными пальцами. (Эта операция называется «обжигом пробки» и предназначена для уничтожения любых микроорганизмов, которые могли запутаться в рыхлых волокнах ваты и которые, если их не уничтожить таким образом, могли бы упасть в пробирку при снятии пробки и случайно загрязнить культуру.)

3. Держите пробирку за центр или около него между концами большого и двух первых пальцев левой руки и позвольте запаянному концу опираться на тыльную сторону кисти между большим и указательным пальцами, при этом пробка должна быть направлена вправо. Держите пробирку как можно ближе к горизонтальному положению, насколько это совместимо с безопасностью, чтобы уменьшить риск случайного попадания организмов (рис. 68).

4. Возьмите ручку петли между большим и указательным пальцами правой руки, держа инструмент в положении, аналогичном тому, которое занимает ручка или кисть для рисования, и стерилизуйте платиновую часть, удерживая ее в пламени Бунзеновской горелки докрасна. Стерилизуйте прилегающую часть алюминиевой ручки, быстро проведя ею два или три раза через пламя. После стерилизации петлю нельзя выпускать из рук или позволять ей касаться чего-либо, кроме материала, предназначенного для исследования, пока работа с ней не будет закончена и она не будет снова стерилизована.

5. Зажмите ватную пробку пробирки между мизинцем и ладонью правой руки (продолжая держать петлю, как указано в шаге 4) и извлеките ее из горлышка пробирки «винтовым» движением правой руки.

6. Введите платиновую петлю в пробирку и удерживайте ее в этом положении, пока не убедитесь, что она полностью остыла. (Остывание можно ускорить, коснувшись петлей одной из капель влаги, которые обычно обнаруживаются сконденсированными на внутренней стороне стеклянной пробирки, или окунув ее в конденсационную воду на дне; в то же время в случае культур на твердых средах следует соблюдать осторожность, чтобы не коснуться ни среды, ни роста.)

7. Возьмите небольшую часть роста, захватив каплю жидкости в случае жидкой культуры или коснувшись петлей поверхности роста, когда культура находится на твердой среде; и извлеките петлю из пробирки, не касаясь снова среды или стеклянных стенок пробирки.

8. Верните ватную пробку в горлышко пробирки.

9. Верните пробирочную культуру в стойку или банку.

10. Тщательно смешайте содержимое петли с каплей воды на предметном стекле 3 на 1 дюйм.

11. Снова стерилизуйте петлю, как указано в шаге 4, и верните ее на подставку.

12. Извлеките покровное стекло из стеклянной капсулы с помощью пинцета для покровных стекол, подержите его мгновение на ребре на куске фильтровальной бумаги, чтобы удалить излишки спирта, затем проведите его через пламя Бунзеновской горелки. Это сжигает остатки спирта, и покровное стекло, таким образом «обожженное», теперь чистое, сухое и стерильное.

13. Опустите покровное стекло, все еще удерживаемое пинцетом, на поверхность капли жидкости на предметном стекле 3 на 1 дюйм, осторожно и аккуратно, чтобы избежать включения пузырьков воздуха.

14. Исследуйте микроскопически (см. ниже).

Во время микроскопического исследования красители и другие реактивы можно вводить под покровное стекло простым методом: поместить каплю реактива в контакт с одним краем покровного стекла и приложить рваный край куска промокательной бумаги к противоположной стороне. Затем можно наблюдать, как реактив течет через поле зрения и вступает в контакт с теми микроорганизмами, которые лежат на его пути.