1. Добавьте несколько капель слабого раствора аммиака в дистиллированной воде. Если раствор образован кровью, цвет может остаться неизменным или, в крайнем случае, может произойти его легкое усиление. Если раствор аммиака окажется слишком крепким, при наличии крови может образоваться бурый цвет.
2. Нагрейте до кипения, при этом в случае присутствия крови происходят следующие изменения:
(a) Цвет может исчезнуть.
(b) Следует коагуляция.
(c) Выпадает осадок грязно-серого или бурого цвета в зависимости от количества присутствующего красящего вещества.
При добавлении едкого кали к осадку он растворяется, и образовавшийся раствор кажется зеленым в проходящем и красным в отраженном свете. Это явление называется дихроизмом крови. Авторитетные специалисты расходятся во мнениях относительно того, является ли цвет зеленым в проходящем и красным в отраженном свете или наоборот. «На самом деле это явление хамелеоноподобно в отношении цвета, поэтому обе группы наблюдателей можно считать правыми или неправыми» (Глейстер).
Рис. 10. — Фотомикрокрограф эритроцитов домашней птицы, × 250. (Р. Дж. М. Бьюкенен.)
Рис. 11. — Фотомикрокрограф кровяных телец рыбы, × 250. (Р. Дж. М. Бьюкенен.)
Рис. 12. — Фотомикрокрограф кровяных телец из высохшего пятна крови трески, × 250. (Р. Дж. М. Бьюкенен.)
3. Добавьте свежеприготовленную настойку гваякового дерева: в водном растворе образуется непрозрачный кремовый осадок гваяковой смолы. При добавлении озонированного эфира, скипидара или перекиси водорода на стыке жидкостей возникает синий цвет: интенсивность синего цвета меняется в зависимости от количества содержащегося в крови красящего вещества.
Этот тест, известный как проба Дея или Шенбейна, чрезвычайно чувствителен и дает реакцию исключительно на кровь и ни на какое другое цветное вещество.
В случаях, когда пятно крови мало, тест можно применить следующим образом. Смочите чисто белую фильтровальную бумагу каплей дистиллированной воды или одного из растворов, рекомендованных в разделе о физическом исследовании, и коснитесь пятна увлажненной частью. При добавлении капли настойки гваякового дерева, за которой следует капля озонированного эфира на влажную фильтровальную бумагу, возникает синий цвет, который легко распознается на белой поверхности.
Гваяковая проба, несмотря на ее чрезвычайную чувствительность, может приниматься только как предоставление отрицательного доказательства. Отсутствие реакции доказывает отсутствие крови, за исключением очень старых пятен крови, которые могут не реагировать на тест. Возникающий синий цвет указывает на то, что вещество может быть кровью, однако он не может быть принят без подтверждения. Клейковина, сырой картофель, молоко, желчь, пот (Огстон) и другие окисляющие вещества дают синий цвет с гваяком и озонированным эфиром; некоторые вещества дают синий цвет только с гваяком.
Тем не менее для крови тест достаточно чувствителен, чтобы обнаружить одну каплю в шести унциях воды.
4. Азотная кислота, добавленная к части раствора крови в дистиллированной воде, дает белесовато-серый осадок.
Рис. 13. — Фотомикрокрограф крови лягушки, показывающий овальные ядросодержащие эритроциты, × 250. (Р. Дж. М. Бьюкенен.)
5. Кристаллы гемина. — Сгустите часть раствора на предметном стекле, добавьте к нему крошечный кристалл хлорида натрия и несколько капель ледяной уксусной кислоты. Аккуратно нагрейте досуха или до меньшей степени под покровным стеклом; исследуйте под микроскопом; при наличии крови будут обнаружены кристаллы гемина или гидрохлорида гематина. Они имеют цвет от желтовато-красного до буровато-черного с металлическим блеском. Они встречаются в виде ромбических призматических или шестиугольных форм, либо в виде «оселков», часто скоплениями; многие кристаллы имеют выступающую губу с одной стороны. Они известны как кристаллы Тейхмана. Их происхождение из крови полезно верифицировать путем нанесения на них капли перекиси водорода, после чего они будут выделять пузырьки газообразного кислорода.
Они нерастворимы в воде, спирте, разбавленных уксусной и соляной кислотах. Они растворяются в кипящих уксусной или соляной кислотах и едких щелочах. Они дают положительную реакцию на гваяк, а зола, образующаяся при сжигании, указывает на присутствие железа по красному цвету, возникающему при добавлении капли соляной кислоты и раствора сульфоцианида калия.
Получение таких кристаллов описанными методами служит убедительным доказательством присутствия крови.
Спектроскопическое исследование
К части цветного раствора, при необходимости отфильтрованной, следует применить спектроскопические пробы. При проведении спектроскопического исследования необходимо помнить о следующих моментах:
(a) Красящим веществом свежей крови является гемоглобин, и он может существовать в двух состояниях в зависимости от степени его соединения с кислородом.
В артериальной крови он присутствует в виде окисленного гемоглобина, то же самое наблюдается в крови, которая подвергалась воздействию воздуха при определенных условиях и в течение варьирующего периода времени.
Рис. 14. — Фотомикрокрограф кристаллов гемина, × 250. (Р. Дж. М. Бьюкенен.)
В венозной крови, особенно полученной в условиях, препятствующих окислению, например из полости сердца только что задохнувшегося животного, он присутствует в виде дезоксидированного гемоглобина.
(b) В сухих пятнах, особенно если они подвергались воздействию загрязненного воздуха, содержащего продукты сгорания угля, красящее вещество превращается в метгемоглобин, или гемоглобин, соединение которого с кислородом изменено таким образом, что ток нейтрального газа, такого как водород или азот, не сможет диссоциировать его, как это происходит с оксигемоглобином. Такие пятна имеют буроватый цвет и могут давать кислую реакцию.
(c) В пятнах, сохранивших влагу из-за нахождения во влажных местах, гемоглобин превращается в гематин. То же самое изменение происходит в сухих пятнах по прошествии более длительного времени.
При исследовании раствора красящего вещества из пятна крови с помощью спектроскопа спектр будет варьировать в зависимости от его состояния и природы используемого растворителя.
Спектры гемоглобина и его производных характерны и дают убедительные доказательства присутствия крови. Тем не менее спектры должны быть распознаны более чем в одном состоянии. Другие вещества могут давать спектры, очень похожие на спектр оксигемоглобина, но при проведении определенных тестов они изменяются иначе. Их нельзя заставить дать спектры восстановленного гемоглобина и восстановленного гематина, а любое красящее вещество, способное давать спектры восстановленного гемоглобина и восстановленного гематина, происходит из крови.
Спектры крови
1. Окисленный гемоглобин (O₂Hb) характеризуется присутствием в его солнечном спектре двух полос поглощения между линиями D и E. Первая полоса начинается у линии D и простирается на небольшое расстояние к E. Вторая начинается на небольшом расстоянии от нее и заканчивается у линии E; она примерно в два раза шире первой. Полоса у D выражена четче остальных (рис. 15, 1).
2. Дезоксидированный или восстановленный гемоглобин представляет собой одну широкую полосу, занимающую почти все пространство между D и E чуть слева от этих линий (рис. 15, 2).
3. Метгемоглобин представляет две полосы между D и E в том же положении, что и полосы O₂Hb, но вдобавок третью полосу между C и D и близко к первой (рис. 15, 3).
Раствор оксигемоглобина или метгемоглобина может быть восстановлен добавлением восстанавливающего агента, такого как реактив Стокса, состоящий из сульфата железа с небольшим количеством винной кислоты, растворенных в воде и подщелоченных во время использования аммиаком, или, что еще лучше, добавлением сульфида аммония. Спектр изменится на спектр восстановленного гемоглобина.
4. Кислый гематин представляет спектр с полосой между D и E, начинающейся на небольшом расстоянии от D и заканчивающейся у E, а также более узкой полосой между C и D, начинающейся у C. Это трудный для получения спектр.
5. Щелочной гематин представляет спектр с одной полосой между C и D вблизи линии D. Его получить сложнее, чем спектр кислого гематина.
Тем не менее нет необходимости получать именно эти спектры, т. е. 5 и 6, но необходимо восстанавливать растворы как кислого, так и щелочного гематина для получения спектра восстановленного гематина. Для этого действуйте следующим образом. К части раствора красящего вещества, полученного из пятна, добавьте небольшое количество 20-процентного раствора едкого натра; раствор изменит цвет, и спектр O₂Hb или MetHb исчезнет. При добавлении к этому раствору щелочного гематина нескольких капель сульфида аммония или жидкости Стокса он приобретает цвет бордо, и при исследовании со спектроскопом будет виден спектр восстановленного гематина. Это самый ярко выраженный из всех спектров крови. Его появление можно ускорить легким подогревом раствора.
Если пятно старое и уже превратилось в гематин, его раствор будет давать спектр кислого гематина, а при добавлении сульфида аммония или жидкости Стокса без предварительного ощелачивания — спектр восстановленного гематина.
6. Восстановленный гематин представляет спектр с темной полосой примерно посередине между D и E, а широкая, но более бледная полоса начинается около линии E и простирается до линии b (рис. 15, 4).
Рис. 15. — Спектры крови.
1. Oxyhæmoglobin. 3. Methæmoglobin. 5. CO hæmoglobin.
2. Reduced hæmoglobin. 4. Reduced hæmatin. 6. CO hæmoglobin and
reduced hæmoglobin.
В случаях смерти от асфиксии, при которых гемоглобин находится в комбинации с CO₂, кровь при извлечении и исследовании сразу после смерти дает спектр восстановленного гемоглобина, но при воздействии воздуха быстро превращается в оксигемоглобин. Период после смерти, в который кровь обычно представляется на судебно-медицинское исследование, достаточно позден, чтобы позволить этому изменению произойти, и тем самым препятствует возможности определения смерти от асфиксии путем спектроскопического исследования крови. Когда смерть вызвана действием монооксида углерода, кровь имеет вишнево-красный цвет и сохраняет этот цвет неизменным в течение долгого времени, фактически годами, благодаря стабильному соединению CO и гемоглобина, называемому карбоксигемоглобином. Такая кровь дает очень характерный спектр с двумя полосами, похожими на полосы O₂Hb, но ближе к фиолетовому концу (рис. 15, 6). Их положение должно быть подтверждено точным измерением и сравнением со спектром O₂Hb. Однако карбоксигемоглобин не поддается восстановлению; при добавлении сульфида аммония или жидкости Стокса полосы остаются неизменными.
В случаях, когда количество жидкости, доступное для исследования, очень мало, приходится прибегать к микроспектроскопу, используя кювету Сорби для удержания жидкости и заменяя окуляр микроскопа специально сконструированным спектроскопом, устроенным так, чтобы проецировать спектр известного раствора красящего вещества крови рядом со спектром исследуемого раствора. Следует использовать искусственное освещение и определять положение линии D, помещая в пламя платиновую проволоку с солью натрия.
Биологические пробы на кровь
Результаты экспериментальных исследований Фриденталя [3], Дойча [4], Уленхута [5], Вассермана и Шютце [6], Натталла [7], Таркетти [8], Грюнбаума [9], Мечникова [10] и МакВини [11], касающиеся «кровяного родства», привели к предложению нового метода — «биологической пробы», с помощью которой можно различать различные виды крови млекопитающих друг от друга. Их эксперименты в общих чертах показывают, что «сыворотка животного, которому внутрибрюшинно вводили ту или иную органическую жидкость, при смешивании в небольшом количестве с разбавленным раствором жидкости, использованной для инъекции, вызывает более или менее определенный осадок». Если человеческую дефибринированную кровь ввести в брюшную полость кролика, сыворотка, полученная из крови кролика, при смешивании с прозрачным раствором крови человека или обезьяны вызовет осадок и агглютинирует эритроциты, если они присутствуют; такая же реакция не последует, если добавить такую сыворотку к раствору крови любого другого животного.
Введение в организм животного веществ белковой или протеиновой природы, которые могут быть усвоены его клетками в качестве пищи, вызывает в организме животного выработку ряда веществ, называемых антителами, одно из которых обозначается как преципитин из-за его способности образовывать осадок с введенным веществом. Введенное органическое вещество, способное вызывать образование антител, называется антигеном. Преципитин образуется и присутствует в сыворотке крови инокулированного животного.
Металлические яды, алкалоиды и углеводы не вызывают образования антител; некоторые растительные протеины способны на это.
Сыворотка, содержащая преципитин, называется антисывороткой.
Преципитин в антисыворотке является специфичным и производит эффект только со своим собственным антигеном, а не с антигеном, происходящим из другого биологического вида животных, однако будет действовать с веществом, происходящим из близкородственного вида, например человека и высших человекообразных обезьян, овцы и козы.
Чтобы исключить это, антиген следует развести до 1:1000.
Кровь, используемая в качестве антигена, может быть высушена и стерилизована, благодаря чему она может храниться в течение долгого времени и при необходимости использования растворяться в физрастворе.
Наиболее удобным человеческим антигеном для общего применения является асцитическая или плевральная жидкость, которая может сохраняться в хорошем состоянии при смешивании с небольшим количеством хлороформа.
Для получения антисыворотки от 3 до 10 куб. см сыворотки-антигена вводят в вену или брюшную полость кролика и повторяют с интервалом в четыре-пять дней, пока не будет введено 25 куб. см. Затем сыворотку кролика проверяют с антигеном, разведенным 1:100. После этого инъекции продолжают до введения 70–80 куб. см. Затем животное умерщвляют, кровь собирают и выдерживают в холодильнике для отделения сыворотки. После этого ее набирают в стерильные пипетки, запаивают и хранят в холоде. В целях консервации перед пипетированием можно добавить одну десятую ее объема 5-процентного фенола. Антисыворотку можно высушить на полосках черной бумаги для дальнейшего использования.
В судебно-медицинских целях антисыворотку всегда следует испытывать с ее антигеном для подтверждения ее эффективности.
Испытуемый антиген следует развести по меньшей мере 1:1000, поскольку сильные антисыворотки могут давать реакции с крепкими растворами антигенов, происходящих от других биологических видов животных. Различные антисыворотки можно получать путем инокуляции кроликов сывороткой разных животных.
Мечников показал, что внутрибрюшинная инъекция не является абсолютно необходимой для получения антисыворотки: скармливание кролику крови подействует точно так же.
Процедура исследования пятна заключается в следующем. Прежде всего должно быть доказано, что пятно является кровью, с помощью обычных методов; это необходимо потому, что антисыворотка будет давать реакции с другими белковыми веществами, например слизью, гноем, спермой, молоком или белковой мочой, происходящими от животного, предоставившего антиген.
Доказав, что пятно является кровью, следует приготовить его раствор в физиологическом растворе, достаточно концентрированный, чтобы давать реакцию HNO₃ на белок или пениться при взбалтывании. Если количество раствораневелико, тесты можно проводить в капиллярных трубках или пипетках. Раствор пятна необходимо очистить фильтрованием или центрифугированием.
Тесты должны контролироваться сравнением с известной человеческой кровью и кровью нескольких домашних животных. Для этой цели следует иметь в наличии различные антисыворотки.
Используются два набора, A и B, по шесть маленьких пробирок, в каждую из пробирок набора A помещают 0,05 куб. см человеческой антисыворотки от сенсибилизированного кролика. В каждую пробирку набора A затем добавляют удвоенное количество разбавленного антигена следующим образом:
Set A — 1. Receives extract of known human blood -stain.
2. “ “ “ ox “ “
3. “ “ “ horse “ “
4. “ “ “ sheep “ “
5. “ “ “ pig “ “
6. “ “ “ stain under observation.
Набор B теперь заполняется следующим образом:
Set B — 1. Receives normal rabbit serum 0.05 c.c.
2. “ human antiserum 0.05 “
3. “ ox “ 0.05 “
4. “ horse “ 0.05 “
5. “ sheep “ 0.05 “
6. “ pig “ 0.05 “
В каждую пробирку набора B теперь добавляется около 0,1 куб. см экстракта предполагаемого пятна.
Таким образом, видно, что в наборе A известный антиген добавляется к известному преципитину, за исключением пробирки 6, в которую помещается предполагаемый антиген, в то время как в наборе B предполагаемый антиген добавляется к известным антисывороткам, за исключением пробирки № 1, содержащей нормальную кроличью сыворотку.
Пробирки осматривают через час и фиксируют результаты. Если пятно является человеческой кровью, положительные реакции появятся в пробирках 1 и 6 штатива A и в пробирке 2 штатива B.
Отрицательные реакции в других пробирках штатива А доказывают, что используемая антисыворотка специфична и будет реагировать только со своим собственным антигеном; в штативе В — что пятно состоит из специфического человеческого антигена, реагирующего только со своей собственной антисывороткой.
Если исследуемое пятно окажется нечеловеческого происхождения и получено от одного из других животных, использованных для получения антисыворотки в штативе В, то положительная реакция возникнет в соответствующей пробирке. [12] В настоящее время эта реакция признана очень чувствительной и надежной, она также применима для обнаружения тканей или жидкостей животных и таким образом использовалась для выявления мясных продуктов.
Таркетти рекомендует следующую процедуру при исследовании пятен крови: растворите пятно в нескольких каплях 0,9-процентного водного раствора хлорида натрия, отфильтруйте и разделите фильтрат на две части; к одной (a) добавьте 0,5 куб. см подготовленной кроличьей сыворотки (так называемой антисыворотки); к другой (b) — сыворотку кролика, которому не вводили человеческую кровь. Обе пробирки следует поместить в термостат при температуре 37 °C на один час. К этому времени, если раствор пятна имеет человеческое или антропоидное происхождение, содержимое пробирки (a) станет мутным, а содержимое пробирки (b) останется прозрачным. На основании серии экспериментов с пятнами крови человека и других животных на различных материалах Таркетти утверждает, что этот метод надежен. Было показано, что приготовленная кроличья «человеческая антисыворотка» не дает такой реакции с кровью свиньи, быка, теленка, мыши или крысы.