Электронный текст подготовлен Сюзанной Лайбарджер, Брайаном Джейнсом, Жозефиной Паолуччи и командой онлайн-корректоров проекта «Гутенберг» (http://www.pgdp.net)

 

Примечание корректора: Для чисел и уравнений добавлены скобки для уточнения дробей. Исправлены незначительные опечатки.

 

 

 

 

ОСНОВЫ

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ

ТЕХНИКИ

ЛАБОРАТОРНОЕ РУКОВОДСТВО ДЛЯ СТУДЕНТОВ МЕДИЦИНСКИХ, СТОМАТОЛОГИЧЕСКИХ И ТЕХНИЧЕСКИХ СПЕЦИАЛЬНОСТЕЙ

ДЖ. У. Х. ЭЙРА, M.D., M.S., F.R.S. (Эдинбург)

ДЖ. У. Х. ЭЙРА, M.D., M.S., F.R.S. (Эдинбург)

Директор бактериологического отделения больницы Гая, Лондон, и преподаватель бактериологии в медицинских и стоматологических школах; в прошлом преподаватель бактериологии в медицинской школе больницы Чаринг-Кросс и бактериолог больницы Чаринг-Кросс; в разное время хантерианский профессор Королевского колледжа хирургов, Англия

ВТОРОЕ ИЗДАНИЕ, ПЕРЕРАБОТАННОЕ И ДОПОЛНЕННОЕ
 

 

 

ФИЛАДЕЛЬФИЯ И ЛОНДОН ИЗДАТЕЛЬСТВО У. Б. СОНДЕРСА 1913

Авторское право, 1902 г., У. Б. Сондерс энд Компани. Пересмотрено, полностью перенабрано, переиздано и перерегистрировано в июле 1913 г. Авторское право, 1913 г., У. Б. Сондерс Компани. Зарегистрировано в Стейшнерс-холле, Лондон, Англия. ОТПЕЧАТАНО В АМЕРИКЕ. ТИПОГРАФИЯ У. Б. СОНДЕРС КОМПАНИ, ФИЛАДЕЛЬФИЯ

ПАМЯТИ ДЖОНА УИЧЕНФОРДА УОШБОРНА, C.M.G., M.D., F.R.C.P. Врача больницы Гая и преподавателя бактериологии в медицинской школе, врача Лондонской инфекционной больницы, МОЕГО УЧИТЕЛЯ, ДРУГА И СОТРУДНИКА

ПРЕДИСЛОВИЕ КО ВТОРОМУ ИЗДАНИЮ

Бактериология — это по существу практическая дисциплина, и даже основы ее техники могут быть усвоены только путем личного обучения в лаборатории. Это самоочевидное положение, не требующее подчеркивания, однако я осмелюсь полагать, что предыдущий сборник проверенных и надежных методов уже принес некоторую пользу не только студентам в отсутствие преподавателя, но и специалистам, работающим в одиночку в лабораториях, удаленных от учебных центров, напоминая им о забытых деталях уже освоенных методов. Если это предположение верно, то для настоящего пересмотренного издания, в котором изменения носят главным образом характер дополнений, вызванных необходимостью внедрения новых методов в последние годы, не требуется дальнейших оправданий.

Я пользуюсь этой возможностью, чтобы выразить глубокую признательность моему коллеге по физиологическому отделению нашей медицинской школы г-ну Дж. Х. Райффелю, B. C., B. Sc., который пересмотрел страницы, посвященные анализу продуктов метаболизма жизнедеятельности бактерий; моим коллегам по бактериологическому отделению больницы Гая за их готовность к сотрудничеству при разработке или проверке новых методов; и, наконец, моему главному лаборанту г-ну Дж. К. Тернеру, чья помощь и опыт были для меня чрезвычайно ценны при подготовке этого тома. Я также благодарю миссис Констанс Пондер за многие новые линейные рисунки и за перерисовку ряда оригинальных иллюстраций.

John W. H. Eyre.

Guy's Hospital, S. E.

July, 1913.

ПРЕДИСЛОВИЕ К ПЕРВОМУ ИЗДАНИЮ

На следующих страницах я попытался кратко и лаконично изложить различные методы, используемые в настоящее время для изучения бактерий и прояснения тех аспектов их жизненного цикла, которые являются спорными или до сих пор не установлены.

Из этих методов некоторые являются новыми, другие — нет, но все они надежны; включены только те, которые способны дать удовлетворительные результаты даже в руках начинающих. По сути, большая часть материала представляет собой просто расширение машинописных заметок, распространявшихся среди некоторых моих лабораторных групп по практической и прикладной бактериологии; следовательно, была предпринята попытка представить основы бактериологической техники в их логической последовательности.

Я не приношу извинений за место, отведенное иллюстрациям, почти все из которых были подготовлены специально для этого тома; ведь рисунок, если он хорош, обладает более высокой образовательной ценностью и создает более точное впечатление, чем страница печатного текста; и даже эскизы аппаратуры служат определенной цели, подсказывая студенту те изменения и модификации, которые могут стать необходимыми или желательными в зависимости от характера его лабораторного оборудования.

Я полностью принял превосходную и уместную терминологию, введенную Честером в его недавней работе «Определительная бактериология», поскольку считаю, что ее нужно лишь использовать, чтобы убедиться в ее чрезвычайной полезности, в то время как включение ее в элементарное руководство призвано привить студенту навыки точного наблюдения и лаконичного описания.

За исключением раздела XVII — «Очерки по изучению патогенных бактерий», — введенного с целью завершения тома с точки зрения студента-медика и стоматолога, работа была организована так, чтобы позволить использовать ее в качестве лабораторного руководства техническими специалистами в целом, будь то в области пивоварения, молочного дела или сельского хозяйства.

Я настолько осознаю многие недостатки этой книги, что кажется почти излишним заявлять, что она ни в коем случае не претендует на роль конкурента многим превосходным руководствам по бактериологии, используемым в настоящее время, а лишь стремится дополнить обычно скудные детали техники и научить студента тому, как устанавливать и адаптировать аппаратуру для своей повседневной работы, а также как тщательно и систематически выполнять различные бактериоскопические анализы, которые ежедневно требуются бактериологу со стороны гигиениста.

Наконец, с большим удовольствием выражаю признательность за ценную помощь, полученную от моего бывшего ассистента г-на Дж. Б. Галла, A. I. C., при подготовке раздела, посвященного химическим продуктам жизнедеятельности бактерий, который был основан на работе Лемана.

John W. H. Eyre.

Guy's Hospital, S. E.

CONTENTS

Страница I. Лабораторные правила 1 II. Стеклянная аппаратура общего пользования 3 Выбор, подготовка и уход за стеклянной посудой 8 — Очистка стеклянной аппаратуры 18 — Закупоривание пробирок и колб 24 III. Методы стерилизации 26 Стерилизующие агенты 26 — Методы применения 27 — Электрические сигнальные часы 38 IV. Микроскоп 49 Основы 49 — Принадлежности 57 — Методы микрометрии 61 V. Микроскопическое исследование бактерий и других микрогрибов 69 Аппаратура и реагенты, используемые при обычном микроскопическом исследовании 69 — Методы исследования 74 VI. Методы окрашивания 90 Бактериальные красители 90 — Контрастные красители 93 — Тканевые красители 95 — Красители для крови 97 — Методы демонстрации структуры бактерий 99 — Дифференциальные методы окрашивания 108 VII. Методы демонстрации бактерий в тканях 114 Метод замораживания 115 — Парафиновый метод 117 — Специальные методы окрашивания срезов 121 VIII. Классификация грибов 126 Морфология гифомицетов 126 — Морфология бластомицетов 129 IX. Шизомицеты 131 Анатомия 134 — Физиология 136 — Биохимия 144 X. Питательные среды 146 Мясной экстракт 148 — Стандартизация сред 154 — Фильтрация сред 156 — Хранение сред в больших количествах 159 — Разлив питательных сред в пробирки 160 XI. Обычные или основные культуральные среды 163 XII. Специальные среды 182 XIII. Инкубаторы 216 XIV. Методы культивирования 221 Аэробные 222 — Анаэробные 236 XV. Методы изоляции 248 XVI. Методы идентификации и изучения 259 Схема изучения 259 — Макроскопическое исследование культур 261 — Микроскопические методы 272 — Биохимические методы 276 — Физические методы 295 — Методы инокуляции 315 — Иммунизация 321 — Активная иммунизация 322 — Приготовление гемолитической сыворотки 327 — Титрование гемолитической сыворотки 328 — Хранение гемолизина 331 XVII. Экспериментальная инокуляция животных 332 Выбор и уход за животными 335 — Методы инокуляции 352 XVIII. Изучение экспериментальных инфекций при жизни 370 Общие наблюдения 371 — Исследования крови 373 — Серологические исследования 378 — Агглютинин 381 — Опсонин 387 — Иммунное тело 393 XIX. Патологоанатомическое вскрытие экспериментальных животных 396 XX. Изучение патогенных бактерий 408 XXI. Бактериологические анализы 415 Бактериологическое исследование воды 416 — Исследование молока 441 — Мороженое 457 — Исследование сливок и масла 457 — Исследование недоброкачественного мяса 460 — Исследование устриц и других моллюсков 463 — Исследование сточных вод и их стоков 466 — Исследование воздуха 468 — Исследование почвы 470 — Тестирование фильтров 478 — Тестирование дезинфицирующих средств 480 Приложение 492 Указатель 505

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА.

I. ЛАБОРАТОРНЫЕ ПРАВИЛА.

Следующие правила установлены для соблюдения в бактериологических лабораториях под руководством автора. Аналогичные правила должны соблюдаться во всех лабораториях, где изучаются патогенные бактерии.

Больница Гая.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ.

ОБРАЩЕНИЕ С ИНФЕКЦИОННЫМИ МАТЕРИАЛАМИ.

Следующие правила были составлены в интересах тех, кто работает в лаборатории, а также широкой общественности, и будут строго соблюдаться.

Их цель — избежать опасностей заражения, которые могут возникнуть из-за пренебрежения необходимыми мерами предосторожности или из-за небрежности.

Каждый должен принять к сведению, что, пренебрегая установленными общими правилами, он не только подвергает серьезному риску себя, но и представляет опасность для других.

ПРАВИЛА.

1. Каждый работник должен носить халат или спецодежду, приобретенную за свой счет, которая должна храниться в лаборатории.

2. Руки необходимо дезинфицировать 2-процентным раствором лизола, 5-процентным раствором карболовой кислоты или 1-промилле раствором сулемы после работы с инфекционным материалом и перед использованием полотенец.

3. Ни в коем случае нельзя использовать лабораторные полотенца или тряпки для вытирания инфекционного материала; если такие полотенца или тряпки загрязнились, их необходимо немедленно стерилизовать кипячением.

4. Для сбора любых отходов предусмотрены специальные ведра с дезинфицирующим средством, и ничего нельзя бросать на пол.

5. Все инструменты должны подвергаться обжигу, кипячению или иной дезинфекции сразу после использования.

6. Этикетки необходимо смачивать водой, а не ртом.

7. Все использованные покровные стекла, предметные стекла и пипетки после работы с инфекционным материалом и т. д. должны помещаться в 2-процентный раствор лизола. Для этой цели на каждом рабочем столе имеется сосуд.

8. Все чашечные и пробирочные культуры патогенных организмов после использования должны помещаться для немедленной дезинфекции в коробки, предусмотренные для этой цели.

9. Никакие жидкости не должны сливаться в раковины или канализацию, если они предварительно не были продезинфицированы.

10. Животных следует вскрывать только после того, как они прибиты к деревянным доскам, а их кожа тщательно промыта дезинфицирующим раствором.

11. Сразу после завершения патологоанатомического вскрытия каждый труп должен быть помещен в цинковый ящик для животных — не снимая тушу с доски для вскрытия — и крышка ящика должна быть закрыта, готовая к отправке в крематорий.

12. Мертвые животные после использования кремируются в крематории, и лабораторный служитель должен быть уведомлен, когда тела готовы к кремации.

13. Никому из работников лаборатории не разрешается входить в помещения для животных без сопровождения специального ответственного служителя, который должен неукоснительно соблюдать те же указания относительно личной дезинфекции, что и работники лабораторий.

14. Никакие культуры не должны выноситься из лаборатории без разрешения заведующего отделением.

15. О всех несчастных случаях, таких как пролитие инфицированного материала, порезы или уколы пальцев, необходимо немедленно сообщать ответственному бактериологу.

II. СТЕКЛЯННАЯ АППАРАТУРА ОБЩЕГО ПОЛЬЗОВАНИЯ.

Оборудование бактериологической лаборатории, что касается стеклянной аппаратуры, мало чем отличается от оборудования химической лаборатории, и чистота аппаратуры столь же важна. Стеклянная посуда, включенная в следующий список, помимо чистоты, должна храниться в стерильном или свободном от микробов состоянии.

Пробирки. — Удобно иметь в запасе пробирки нескольких размеров для удовлетворения особых требований, а именно:

1. 18 × 1,5 см, для содержания сред при обычных пробирочных культурах.

2. 18 × 1,3 см, для содержания сред, используемых для заливки чашечных культур, а также для хранения стерильных «тампонов».

3. 18 × 2 см, для содержания клиньев картофеля, свеклы или других растительных сред.

4. 13 × 1,5 см, для содержания свернутой сыворотки крови.

Пробирки должны быть изготовлены из лучшего немецкого калиевого стекла, «синелинейного», прочного и тяжелого, с краем отверстия пробирки, слегка отогнутым, но не до такой степени, чтобы образовался выраженный ободок. (Стоимость около 1,50 доллара или 6 шиллингов за гросс.) Такие пробирки, правда, дороги, но они достаточно прочны, чтобы выдерживать грубое обращение, обычно не разбиваются, если их случайно уронить (момент, имеющий значение при работе с культурами патогенных бактерий), их можно чистить, стерилизовать и использовать снова и снова, и благодаря длительному сроку службы они полностью оправдывают свои первоначальные затраты.

Следует отметить, что производители редко выпускают такие пробирки абсолютно одинакового калибра, и партия пробирок 18 на 1,5 см обычно содержит такие крайние размеры, как 18 на 2 см и 18 на 1,3 см. Следовательно, если для сравнения хранить набор стандартных пробирок или использовать штангенциркуль, каждую новую поставку так называемых пробирок 18 на 1,5 см можно легко рассортировать по этим трем размерам, что упростит заказ.

5. 5 × 0,7 см, для использования в перевернутом положении внутри пробирок, содержащих углеводные среды, в качестве газосборных трубок.

Эти пробирки, «без ободка», могут быть из обычного тонкого стекла, так как менее двух процентов из них пригодны для использования во второй раз.

Fig. 1.—Bohemian flask.

Fig. 2.—Pear-shaped flask.

Fig. 3.—Erlenmeyer flask (narrow neck).

Богемские колбы (рис. 1). — Это обычные колбы химической лаборатории. Следует иметь в наличии хороший ассортимент емкостью от 250 до 3000 куб. см. Модифицированная форма, известная как «грушевидная» (рис. 2), предпочтительнее для меньших размеров, т. е. 250 и 500 куб. см.

Колбы Эрленмейера (рис. 3). — Колбы Эрленмейера емкостью 75, 100 и 250 куб. см чрезвычайно полезны. Для использования в качестве культуральных колб следует выбирать только те, которые имеют узкое горлышко длиной около 2 см.

Культуральные колбы Колле (рис. 4). — Эти тонкие плоские колбы (для содержания агара или желатина, который застывает слоем на одной стороне) чрезвычайно полезны из-за большой питательной поверхности, доступной для роста. Поверхностная культура в одной из них даст столько же роста, сколько десять или двенадцать «скошенных» пробирочных культур. Широкое горлышко, однако, является недостатком, и для многих целей предпочтительнее тонкие плоские культуральные бутыли, известные как бутыли Ру (рис. 5).

Fig. 4.—Kolle's culture flask.

Fig. 5.—Roux's culture bottle.

Fig. 6.—Guy's culture bottle.

Fig. 7.—Filter flask.

Еще более удобным является образец, используемый в лаборатории автора (рис. 6), так как благодаря большей глубине среды, которую можно получить в этих колбах, возможен чрезвычайно пышный рост; узкое горлышко сводит к минимуму вероятность случайного загрязнения, а общая форма позволяет ставить колбы одну на другую.

Фильтр-колбы или сывороточные колбы Китасато (рис. 7). — Различные размеры, емкостью от 250 до 2000 куб. см. Они должны быть из прочного стекла, чтобы выдерживать давление, которому они подвергаются, но в то же время должны быть тщательно отожжены, чтобы выдержать температуру, необходимую для стерилизации.

Все колбы должны быть либо из йенского стекла, либо из почти столь же известного стекла Resistance или R, при этом дополнительные первоначальные затраты оправдываются относительной устойчивостью стекла к поломкам.

Чашки Петри или «чашки» (рис. 8, а). — Они теперь полностью заменили прямоугольные листы стекла, введенные Кохом для пластинчатого метода культивирования. Каждая «чашка» состоит из пары круглых стеклянных дисков с резко загнутыми краями, образующих таким образом неглубокие чашки, одна из которых имеет чуть больший диаметр, чем другая, и поэтому в перевернутом виде образует крышку или колпачок для меньшей. Чашки с внешним диаметром 10 см и высотой 1,5 см являются наиболее общеупотребительными. Партия из восемнадцати таких чашек стерилизуется и хранится в цилиндрической медной коробке (30 см высотой и 12 см диаметром), снабженной «съемной» крышкой. Внутри каждой коробки находится медная скоба с круглым дном, на которой покоятся чашки и с помощью которой каждую из них можно по очереди поднимать к отверстию коробки (рис. 9) для извлечения.

Капсулы (рис. 8, b и c). — Это чашки Петри меньшего диаметра, но большей глубины, чем те, что называются чашками. Особенно полезны будут два размера, а именно: 4 см в диаметре и 2 см в высоту, емкостью около 14 куб. см; и 5 см в диаметре и 2 см в высоту, емкостью около 25 куб. см. Они хранятся в медных цилиндрах аналогичной конструкции, что и для чашек, но размером 20 на 6 см и 20 на 7 см соответственно.

Градуированные пипетки. — Требуется несколько разновидностей, а именно:

1. Пипетки емкостью 1 куб. см, градуированные по 0,1 куб. см.

2. Пипетки емкостью 1 куб. см, градуированные по 0,01 куб. см (рис. 10, а).

Fig. 8.—Petri dish (a), and capsules (b, c).

Fig. 9.—Plate box with stirrup.

3. Пипетки емкостью 10 куб. см, градуированные по 0,1 куб. см (рис. 10, b).

Они должны быть около 30 см в длину (1 и 2 с довольно узким каналом), градуированы до самого кончика и иметь по крайней мере 10 см свободного пространства между первым делением и верхним концом; открытое горлышко должно быть закупорено ватой. Каждая разновидность должна быть стерилизована и храниться в отдельном цилиндрическом медном футляре размером около 36 на 6 см со «съемной» крышкой, на которой четкими цифрами проштампована емкость содержащихся пипеток.

Fig. 10.—Measuring pipettes, a and b.

Лаборатория также должна быть обеспечена полным набором «стандартных» градуированных пипеток, каждая из которых в наборе проштампована и подтверждена сертификатом одной из признанных лабораторий физических измерений, таких как Шарлоттенбург. Эти инструменты дороги и должны быть зарезервированы исключительно для стандартизации пипеток, находящихся в обычном использовании, и для калибровки небольших пипеток, изготовленных в лаборатории. Такой набор должен включать, по крайней мере, пипетки, дозирующие 10, 5, 2,5, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,2, 0,1, 0,05 и 0,01 куб. см соответственно.

В непосредственно следующих разделах описаны небольшие предметы стеклянной аппаратуры, которые следует изготавливать в лаборатории из стеклянных трубок различных размеров. При их подготовке необходимы три предмета: во-первых, трехгранный напильник из твердой стали или, предпочтительно, нож стеклодува из твердой тюрингской стали для резки стеклянных трубок и т. д.; во-вторых, паяльная лампа, так как, хотя многое можно сделать с помощью обычной горелки Бунзена, пламя паяльной лампы способствует быстрой работе; и, наконец, горелка типа «крыло летучей мыши».

Fig. 11.—Glass-cutting knife. a. handle. b. double
edged blade. c. shaft. d. locking nut. e. spanner for nut.

1. Нож для резки стекла. Этот предмет продается в двух формах: настольный нож (рис. 11) и перочинный нож. Первый снабжен лезвием длиной около 8 см и имеет две режущие кромки. Режущая кромка при рассмотрении при сильном освещении оказывается состоящей из мелких, близко расположенных зубцов, подобных тем, что на пиле. Нож следует поддерживать острым путем частой правки на песчаниковом бруске. Перочинная форма, общей длиной около 6 см, состоит из небольшого пружинного лезвия с одной режущей кромкой, установленного в рукоятке, как обычный перочинный нож.

2. Для реального удобства работы паяльная лампа должна быть установлена на специальном столе, соединенном с цилиндрическими мехами, приводимыми в действие педалью. Тот, что изображен на рисунке (рис. 12), изготовлен путем установки тиковой столешницы размером 60 см на стойки закрытых мехов двойного действия (Энфера) и снабжен газовой паяльной лампой Флетчера.

3. Обычная газовая горелка типа «крыло летучей мыши», установленная в дальнем углу столешницы, неоценима при подготовке трубчатой аппаратуры с крутыми изгибами, а также для покрытия только что изготовленной стеклянной аппаратуры слоем сажи, чтобы предотвратить слишком быстрое охлаждение и его обычно связанный результат — растрескивание.

Fig. 12.—Glass blower's table with Enfer's foot
bellows.

6. Седиментационные пробирки 5×0,5 см для реакций осаждения и т. д., а также для содержания небольших количеств жидкости, подлежащей центрифугированию в гематокрите. Они изготавливаются путем взятия 14-сантиметровых отрезков прочной стеклянной трубки требуемого диаметра и нагревания центра в пламени горелки Бунзена или паяльной лампы. Когда центральная часть станет совсем мягкой, быстро разведите концы в стороны, а затем округлите заостренные концы двух таким образом сформированных пробирок. С помощью ножа для резки стекла отрежьте все необходимое с открытых концов, чтобы придать пробиркам требуемую длину.

Прямоугольный блок из «пластилина» (моделирующей глины), в который можно воткнуть конические концы, представляет собой очень удобную подставку для этих маленьких пробирок.

Капиллярные пипетки или пипетки Пастера (рис. 13 а). — Эти маленькие инструменты неоценимы, и их следует иметь в хорошем запасе. Они изготавливаются из трубок мягкого стекла различного калибра (наиболее общеупотребительный размер — 8 мм в диаметре) следующим образом: удерживайте 10-сантиметровый отрезок стеклянной трубки за оба конца и, вращая его, нагревайте центральную часть в пламени горелки Бунзена или паяльной лампы до тех пор, пока стекло не станет красным и мягким. Теперь выньте его из пламени и равномерно разведите концы в стороны, вытягивая таким образом нагретую часть в просторную капиллярную трубку; сломайте капиллярную часть посередине, запаяйте сломанные концы в пламени и округлите края открытого конца каждой пипетки. Свободная ватная пробка в открытом горлышке завершает капиллярную пипетку. После того как их будет подготовлено несколько штук, их стерилизуют и хранят партиями либо в металлических футлярах, подобных тем, что используются для градуированных пипеток, либо в пробирках большого размера — запаянными концами вниз, а закупоренными концами к отверстию футляра.

Fig. 13.—Capillary pipettes. a, b, c.

Наполнение и опорожнение капиллярной пипетки наиболее удовлетворительно осуществляется путем надевания небольшого резинового баллончика (подобного тому, что на детской бутылочке для кормления, но не перфорированного) на верхний конец после отрезания или отламывания запаянного кончика капиллярной части. Если теперь надавить пальцем и большим пальцем на эластичный баллончик, пока капиллярный конец находится под поверхностью жидкости, которую нужно набрать, часть содержащегося воздуха будет вытеснена, а последующее ослабление этого давления (приводящее к образованию частичного вакуума) заставит жидкость подняться по капиллярной трубке. Последующее сжатие баллончика естественным образом приведет к полному вытеснению жидкости из пипетки (рис. 14).

Fig. 14.—Filling the capillary teat-pipette.

Модификация этой пипетки, в которой сужение или короткий отрезок капиллярной трубки введен чуть ниже закупоренного горлышка (рис. 13, b), также окажется чрезвычайно полезной при сборе и хранении патологических экссудатов.

Третья форма, где капиллярная часть имеет длину около 4 или 5 см и составляет лишь малую часть всей длины пипетки (рис. 13, c), также окажется полезной.

«Кровяные» пипетки (рис. 15). — Следует также подготовить специальные пипетки для сбора довольно больших количеств крови (как предложено Пейксом). Они изготавливаются из трубок мягкого стекла диаметром 1 см аналогично пипеткам Пастера, за исключением того, что необходимо использовать кончик пламени паяльной лампы, чтобы получить резкий «плечико» на обоих концах центрального баллона. Терминальные трубки должны сохранять диаметр не менее 1 мм, чтобы избежать капиллярного действия во время сбора жидкости.

Fig. 15.—Blood pipettes and hair-lip pin in a
test-tube.

Fig. 16.—Blood-pipette in metal thermometer case.

Для стерилизации и хранения каждая пипетка помещается внутрь пробирки, опираясь на ватный тампон, и пробирка закупоривается обычным способом. Поскольку эти трубки используются почти исключительно для работы с кровью, принято помещать внутрь пробирки ланцетовидную булавку для заячьей губы или плоскую иглу Хагедорна № 9, чтобы весь комплект можно было стерилизовать за один раз.

Для сбора небольших количеств крови для реакций агглютинации и тому подобного многие предпочитают короткий прямой отрезок узкой стеклянной трубки, вытянутый на обоих концах до почти капиллярных размеров. Такие пипетки общей длиной около 8 см наиболее удобно стерилизовать в обычных металлических футлярах для термометров (рис. 16).

Градуированные капиллярные пипетки (рис. 17). — Их также следует изготавливать в лаборатории — из манометрических трубок — простой, удобной формы и градуировать с помощью «стандартных» пипеток (в сотых долях) для содержания таких количеств, как 10, 50 и 90 куб. мм, и тщательно помечать алмазом для письма. Они, предварительно стерилизованные в больших пробирках, окажутся чрезвычайно полезными при приготовлении точных процентных растворов, когда доступны лишь мельчайшие количества жидкости.

Fig. 17.—Capillary graduated pipettes.

Автоматические («дроссельные») пипетки. — Эти остроумные пипетки, введенные Райтом, могут быть легко откалиброваны в лаборатории и чрезвычайно полезны для градуировки небольших пипеток, для измерения малых количеств жидкостей, при приготовлении разведений сыворотки для реакций агглютинации и т. д. Обычно они изготавливаются из капиллярных пипеток Пастера (рис. 13, а). Следующее описание изготовления пипетки на 5 куб. мм послужит примером того, как калибруются небольшие автоматические пипетки.

1. Выберите пипетку, капиллярная часть которой имеет довольно просторный канал и обладает ровными стенками, и удалите ватную пробку из открытого конца.

2. Нагрейте капиллярную часть возле свободного конца в пламени байпаса горелки Бунзена и вытяните ее в очень тонкую, волосовидную трубку и сломайте ее. Этот волосовидный кончик позволит проходить воздуху, но слишком тонок для прохождения металлической ртути.

3. С помощью стандартной градуированной пипетки отмерьте 5 куб. мм чистой ртути в верхнюю широкую часть пипетки.

4. Прикрепите резиновый баллончик к пипетке и, надавливая на него, постепенно загоняйте ртуть неразрывным столбиком вниз по капиллярной трубке, пока она не остановится у нитевидного кончика.

5. Отрежьте капиллярную трубку точно на верхнем уровне столбика ртути, переверните ее и дайте ртути вытечь.

6. Отломите остаток капиллярной трубки от широкой верхней части пипетки, которая теперь предназначена для формирования покрывающей трубки или воздушной камеры, или того, что мы можем назвать «стволом». Этот ствол теперь имеет нижний конец в форме усеченного конуса, а верхний конец обрезан под прямым углом. Снимите баллончик.

7. Введите капиллярную трубку в этот ствол нитевидным кончиком вверх, а обрезанный под прямым углом конец должен выступать примерно на 0,5 см за сужающийся конец ствола.

Fig. 18.—Throttle pipette—small capacity.

8. Бросьте небольшой кусочек сургуча в ствол сбоку от капиллярной трубки, а затем нагрейте трубку в газовом пламени до тех пор, пока воск не размягчится и не создаст воздухонепроницаемое соединение между капиллярной трубкой и концом ствола.

9. Наденьте резиновый баллончик на открытый конец ствола и таким образом завершите пипетку, на которую можно положиться, что она всегда будет всасывать и доставлять ровно 5 куб. мм жидкости.

Небольшая модификация этой процедуры необходима при изготовлении трубок для измерения объемов, превышающих, скажем, 75 куб. мм. Так, чтобы сделать дроссельную пипетку для измерения 100 куб. мм:

1. Возьмите короткий отрезок трубки и вытяните один конец в просторный капиллярный стержень, а затем снова вытяните кончик в тонкую волосовидную точку, сформировав таким образом небольшую пипетку Пастера с волосовидным капиллярным кончиком.

2. С помощью стандартной пипетки отмерьте 100 куб. мм в горлышко этой пипетки и сделайте царапину алмазом для письма на верхнем уровне (a) ртутного мениска (рис. 19, A).

Fig. 19.—Making throttle pipettes—large capacity

Теперь протолкните ртуть вниз в капиллярный стержень настолько, насколько это возможно, чтобы оставить верхнюю часть трубки в области алмазной царапины пустой (рис. 19, B).

3. Нагрейте трубку в области алмазной царапины в пламени паяльной лампы и, вынув трубку из пламени, вытяните ее так, чтобы алмазная царапина теперь занимала положение где-то около центра этой новой капиллярной части (рис. 19, C).

4. Нагрейте трубку в этом положении в пламени горелки Бунзена и вытяните ее в волосовидный кончик. Отломите стеклянную трубку, оставив около 5 мм волосовидного кончика, прикрепленного к верхней капиллярной части (рис. 19, D). Дайте стеклу остыть.

5. Поднимите баллон за длинный капиллярный стержень и дайте ртути вернуться в исходное положение — операция, которая будет облегчена отламыванием волосовидного кончика от длинного куска капиллярной трубки.

6. Отметьте на капиллярном стержне жирным карандашом положение конца столбика ртути (рис. 19, E).

7. Нагрейте капиллярную трубку в этом месте в пламени горелки Бунзена и вытяните ее совсем немного, чтобы при разрезании в этом положении получился заостренный кончик.

8. С помощью ножа для резки стекла разрежьте капиллярную трубку в точке «b» и дайте ртути вытечь.

9. Теперь нанесите толстый слой сургуча на горлышко баллона.

10. Возьмите кусок стеклянной трубки с каналом 5 мм и вытяните его, как если бы вы делали обычную пипетку Пастера.

11. Отломите капиллярную часть так, чтобы оставить покрывающую трубку, подобную той, что уже использовалась для меньших градуированных пипеток. В эту покрывающую трубку опустите градуированный баллон и протащите капиллярный стержень вниз через конический кончик, пока дальнейшее продвижение не будет остановлено слоем сургуча.

12. Нагрейте пипетку в газовом пламени, чтобы расплавить сургуч и создать воздухонепроницаемое соединение.

13. Наденьте резиновый баллончик на открытый конец покрывающей трубки, и автоматическая пипетка готова к использованию (рис. 19, F).

Седиментационные пипетки (рис. 20). — Они изготавливаются из 10-сантиметровых отрезков узкой стеклянной трубки путем запаивания одного конца, выдувания небольшого баллона в центре и закупоривания открытого конца ватой; после стерилизации открытый конец снабжается коротким куском резиновой трубки и стеклянным мундштуком. Когда необходимо наблюдать реакции осаждения в очень малых количествах жидкости, эти трубки окажутся гораздо удобнее, чем упомянутые ранее пробирки 5 на 0,5 см.

Fig. 20.—Sedimentation pipette.

Пипетки Пастера, снабженные резиновыми баллончиками, также окажутся полезными для седиментационных тестов при работе с мельчайшими количествами сыворотки и т. д.

Fig. 21.—Fermentation tubes.

Ферментационные трубки (рис. 21). — Они используются для сбора и анализа газов, выделяющихся из сред во время роста некоторых разновидностей бактерий, и могут быть либо простыми (а), либо градуированными (b). Простая форма (рис. 21, c) может быть изготовлена из 14-сантиметровых отрезков трубки мягкого стекла диаметром 1,5 см. Пламя горелки Бунзена прикладывается к точке на расстоянии около 5 см от одного конца такого куска трубки, и трубка слегка вытягивается, образуя сужение; суженная часть сгибается в пламени горелки типа «крыло летучей мыши» под острым углом, а открытый конец длинного плеча запаивается в пламени паяльной лампы. Открытый конец короткого плеча округляется, а затем закупоривается ватой, и трубка готова к стерилизации.

ОЧИСТКА СТЕКЛЯННОЙ АППАРАТУРЫ.

Вся стеклянная посуда, используемая в бактериологической лаборатории, должна быть тщательно очищена перед использованием, и это правило относится как к новой, так и к старой аппаратуре, хотя используемые методы могут незначительно различаться.

Для очистки новых пробирок. —

1. Поместите пробирки в ведро или другую удобную емкость, наполните водой и добавьте горсть «Сапона» или другого мыльного порошка. Убедитесь, что пробирки полны и погружены в воду.

2. Поставьте ведро над большим пламенем горелки Бунзена и кипятите в течение тридцати минут — или кипятите в автоклаве в течение аналогичного периода времени.

3. Очистите внутреннюю часть пробирок с помощью щеток для пробирок и тщательно промойте в холодной воде.

4. Переверните пробирки и дайте им полностью стечь.

5. Высушите пробирки и отполируйте стекло внутри и снаружи мягкой тканью, такой как селвит.

Новые колбы, чашки и капсулы должны быть очищены аналогичным образом.

Для очистки новых градуированных пипеток. —

1. Поместите пипетки в удобную емкость, наполненную водой, в которую добавлен мыльный порошок.

2. Энергично кипятите воду в течение двадцати минут над пламенем горелки Бунзена.

3. Промойте пипетки в проточной воде и дайте стечь.

4. Пропустите дистиллированную воду через пипетки и дайте стечь.

5. Пропустите ректификованный спирт через пипетку и дайте стечь как можно полнее.

6. Поместите пипетки в сушильный шкаф (см. стр. 31), закройте дверцу, откройте вентиляционную заслонку и медленно поднимите температуру примерно до 80° C. Выключите газ и дайте шкафу остыть.

Или 6а. Присоединяйте каждую пипетку по очереди к резиновой трубке ножных мехов или воздушного потока паяльной лампы и продувайте воздух через пипетку, пока внутренняя часть не станет сухой.

Стеклянная посуда, которая уже была в употреблении, считается инфицированной и обрабатывается немного иначе.

Инфицированные пробирки. —

1. Упакуйте пробирки в проволочную корзину автоклава (предварительно удалив ватные пробки, колпачки и т. д.) в вертикальном положении, и перед тем, как заменить корзину, убедитесь, что на дне котла достаточно воды. Теперь прикрепите кусок резиновой трубки к ближайшему водопроводному крану и с его помощью наполните каждую пробирку водой.

2. Полностью продезинфицируйте, подвергнув пробирки и т. д. воздействию температуры 120° C в течение двадцати минут (см. стр. 37).

(Если автоклав недоступен, пробирки необходимо поместить в дигестор или даже в большую кастрюлю или ведро с плотно прилегающей крышкой и энергично кипятить в течение тридцати-сорока пяти минут для обеспечения дезинфекции.)

3. Пока они еще горячие, опорожните каждую пробирку по очереди и грубо очистите ее внутреннюю часть жесткой щеткой для пробирок.

4. Поместите пробирки в ведро или другую удобную емкость, наполните водой и добавьте горсть «Сапона» или другого мыльного порошка. Убедитесь, что пробирки полны и погружены в воду.

5. Поставьте ведро над большим пламенем горелки Бунзена и кипятите в течение тридцати минут.

6. Очистите внутреннюю часть пробирок с помощью щеток для пробирок и тщательно промойте в холодной воде.

7. Слейте воду и погрузите пробирки в большую банку, содержащую воду, подкисленную 2–5-процентной соляной кислотой. Оставьте их там примерно на пятнадцать минут.

8. Выньте из банки с кислотой, дайте стечь, тщательно промойте в проточной воде, затем дистиллированной водой.

9. Переверните пробирки и дайте им полностью стечь.

Высушите пробирки и отполируйте стекло внутри и снаружи мягкой тканью, такой как селвит.

Инфицированные колбы, чашки и капсулы должны обрабатываться аналогичным образом.

Колбы, которые использовались только при приготовлении сред, должны быть очищены сразу после окончания работы с ними. Наполните каждую колбу водой, в которую добавлены мыльный порошок и несколько кристаллов перманганата калия, и дайте прокипеть над открытым пламенем. Внутреннюю часть колбы обычно можно идеально очистить с помощью щетки для колб, но в некоторых случаях необходимо взболтать внутри колбы воду, подкисленную 5-процентной азотной кислотой, или большой ватный тампон, предварительно обвалянный в серебряном песке, после чего тщательно промыть чистой водой, высушить и отполировать.

Инфицированные пипетки. —

1. Погружайте инфицированные пипетки сразу после использования в высокие стеклянные цилиндры, содержащие 2-процентный раствор лизола, и оставляйте их там на несколько дней.

2. Выньте из банки и дайте стечь. Кипятите в воде, в которую добавлено немного мыла, в течение тридцати минут.

3. Тщательно промойте в холодной воде.

4. Погрузите в 5-процентную азотную кислоту на час или два.

5. Снова промойте в проточной воде, чтобы удалить все следы кислоты.

6. Завершите очистку, как описано в разделе «новые пипетки».

При работе с градуированными капиллярными пипетками, используемыми для работы с кровью или сывороткой (новыми или инфицированными), много времени уходит на различные этапы, начиная с 5-го, и процесс очистки можно существенно ускорить, если применить следующее устройство.

Присоедините фильтр-колбу Китасато большого размера к всасывающему насосу Шпренгеля или воздушному насосу Герика (см. стр. 43). К боковому тубусу фильтр-колбы прикрепите 20-сантиметровый отрезок резиновой напорной трубки, имеющей канал, достаточно большой, чтобы вместить концы пипеток.

Затем наполните небольшой стакан дистиллированной водой. Присоедините первую пипетку к свободному концу резиновой трубки, поместите кончик пипетки вниз в стакан с водой и запустите насос (рис. 22).

Fig. 22.—Cleaning blood pipettes.

Когда вся вода будет аспирирована через пипетку в фильтр-колбу, наполните стакан ректификованным спиртом, а когда он закончится, снова наполните эфиром. Отсоедините пипетку и высушите в сушильном шкафу.

Предметные и покровные стекла (рис. 23) при первой покупке имеют «жирные» поверхности, на которых вода собирается в мельчайшие капли и эффективно препятствует растеканию тонких, ровных пленок.

Микроскопические предметные стекла. — Предметные стекла общего пользования — это те, что известны как «три на один» (размером 3 дюйма на 1 дюйм, или 76 на 26 мм), и должны быть из хорошего белого кронгласа, с матовыми краями.

Новые предметные стекла следует оставить в спирте, подкисленном 5-процентной соляной кислотой, на несколько часов, промыть в проточной воде, грубо обсушить на полотенце, высушить и, наконец, отполировать тканью селвит.

Fig. 23.—Slides and cover-slips, actual size.

Если для немедленного использования требуется лишь несколько предметных стекол, хороший способ — протереть поверхность ювелирной наждачной бумагой (Hubert's 00). Кусок твердого дерева размером 76×26×26 мм с приклеенным к нему куском этой наждачной бумаги является чрезвычайно полезным предметом на столе микроскописта.

Покровные стекла. Наиболее удобными размерами являются квадраты 19 мм для обычных мазков на покровных стеклах и прямоугольники 38 на 19 мм для мазков крови и серийных срезов; оба вида должны быть толщиной «№ 1», которая варьируется от 0,15 до 0,22 мм, чтобы их можно было использовать с иммерсионными объективами большой мощности.

Покровные стекла следует очищать следующим образом:

1. Опускайте покровные стекла по одному в эмалированную железную емкость или высокий стеклянный стакан, содержащий 10-процентный раствор хромовой кислоты.

2. Нагрейте на пламени горелки Бунзена и дайте кислоте слабо кипеть в течение двадцати минут.

Примечание. В стакан можно положить несколько кусочков глиняной трубки или пемзы, чтобы предотвратить «разбрызгивание» хромовой кислоты.

3. Переложите покровные стекла в плоскую стеклянную чашку и промывайте под проточной водой из-под крана, пока не исчезнут все следы желтого цвета. Во время промывки поддерживайте движение покровных стекол, придавая чашке вращательное движение.

4. Промойте дистиллированной водой аналогичным образом.

5. Промойте ректификованным спиртом.

6. Перенесите покровные стекла с помощью чистых пинцетов, предварительно прокаленных в пламени горелки Бунзена для удаления следов жира, в небольшой стакан с абсолютным спиртом.

Слейте спирт и перенесите покровные стекла с помощью пинцета в стеклянную банку с широким горлышком, содержащую абсолютный спирт, в котором они будут храниться, и плотно закройте пробкой.

Примечание. После того как покровные стекла были помещены в хромовую кислоту, к ним ни в коем случае нельзя прикасаться пальцами.

Использованные предметные и покровные стекла. Использованные предметные стекла с препаратами под покровным стеклом, а также покровные стекла, использованные для препаратов «висячая капля», при утилизации следует бросать в емкость, содержащую 2-процентный раствор лизола.

После выдерживания в нем в течение недели или около того даже покровные стекла, смонтированные на канадском бальзаме, можно легко отделить от предметных стекол.

Предметные стекла. —

1. Тщательно промойте предметные стекла в проточной воде.

2. Кипятите предметные стекла в воде с добавлением «сапона» в течение получаса.

3. Тщательно ополосните в холодной воде.

4. Высушите и отполируйте сухой тканью.

Покровные стекла. —

1. Тщательно промойте покровные стекла в проточной воде.

2. Прокипятите покровные стекла в 10-процентном растворе хромовой кислоты, как для новых покровных стекол.

3. Тщательно промойте в проточной воде.

4. Отберите те покровные стекла, на которых осталось много грязи, и потрите их между большим и указательным пальцами под струей воды из-под крана. Грязь обычно легко стирается, так как она стала хрупкой от контакта с хромовой кислотой.

5. Верните все покровные стекла в стакан, залейте свежим раствором хромовой кислоты и обработайте как новые покровные стекла.

Примечание. Пробирки, чашки, капсулы и т. д., которые от длительного использования стали поцарапанными и мутными или которые невозможно очистить иным способом, можно обработать, погрузив их на десять минут в эмалированную железную ванну, содержащую воду, подкисленную до 1 процента плавиковой кислотой, затем тщательно промыть водой, высушить и отполировать.

ЗАКУПОРКА ПРОБИРОК И КОЛБ.

Перед стерилизацией все пробирки и колбы должны быть тщательно закупорены ватой; для этой цели следует использовать лучшую гигроскопическую вату (предпочтительно ту, которая выпускается в цилиндрических фунтовых упаковках и проложена папиросной бумагой — так называемая хирургическая вата).

1. Для пробирки или небольшой колбы оторвите от рулона полоску ваты размером около 10 см в длину и 2 см в ширину.

2. Аккуратно подогните края и слегка скатайте полоску ваты между большими и указательными пальцами обеих рук, чтобы сформировать длинный цилиндр.

3. Сложите его пополам и вставьте получившийся закругленный конец в открытое горлышко пробирки или колбы.

4. Теперь, придерживая вату между большим и указательными пальцами правой руки, вращайте пробирку пальцами левой руки и постепенно ввинчивайте ватную пробку в горлышко на глубину около 2,5 см, оставляя примерно такую же длину ваты снаружи.

Fig 24..—Plugging test-tubes: a, cylinder of wool
being rolled; b, cylinder of wool being doubled; c, cylinder of wool
being inserted in tube.

Пробка должна быть плотной и довольно туго входить в пробирку или колбу, достаточно туго, чтобы выдержать вес стекла вместе с объемом среды, который сосуд должен содержать, но не настолько туго, чтобы ее нельзя было легко извлечь вращательным движением, захватив между четвертым или третьим и четвертым пальцами и ладонью.

Для большой колбы необходимо взять аналогичную, но более крупную полоску ваты; метод изготовления и вставки пробки идентичен.

III. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ.

СТЕРИЛИЗУЮЩИЕ АГЕНТЫ.

Стерилизация, т. е. удаление или уничтожение микроорганизмов, может быть осуществлена с помощью различных агентов. Применительно к практическим требованиям бактериологической лаборатории многие из этих агентов, такие как электричество, солнечный свет и т. д., малоценны, другие ограничены в своем применении; третьи же настолько хорошо подходят для конкретных целей, что их использование почти полностью ограничивается ими.

Наиболее часто используемые стерилизующие агенты:

Химические реагенты. — Дезинфицирующие средства (для дезинфекции стеклянной и металлической аппаратуры и патологических тканей).

Физические агенты. Тепло. — (а) Сухой жар:

1. Открытое пламя (для стерилизации платиновых игл и т. д.).

2. Муфельная печь (для стерилизации фильтрующих свечей и для уничтожения патологических тканей).

3. Горячий воздух (для стерилизации всей стеклянной посуды и металлической аппаратуры).

(б) Влажное тепло:

1. Вода при 56° C (для стерилизации некоторых альбуминовых жидкостей).

2. Вода при 100° C (для стерилизации хирургических инструментов, резиновых трубок, пробок и т. д.).

3. Текучий пар при 100° C (для стерилизации сред).

4. Перегретый пар при 115° C или 120° C (для дезинфекции загрязненных предметов и уничтожения старых культур бактерий).

Фильтрация. —

1. Ватные фильтры (для стерилизации воздуха и газов).

2. Фарфоровые фильтры (для стерилизации различных жидкостей).

МЕТОДЫ ПРИМЕНЕНИЯ.

Химические реагенты, такие как антисептики (т. е. вещества, которые подавляют рост, но не уничтожают бактериальную жизнь), очевидно, бесполезны. Дезинфицирующие средства или гермициды (т. е. вещества, которые уничтожают бактериальную жизнь), с другой стороны, ценны при дезинфекции патологического материала, а также различных частей аппаратуры, таких как пипетки, до их очистки и полной стерилизации другими процессами. К этому классу (в порядке общей полезности) относятся:

Lysol, 2 per cent. solution;

Perchloride of mercury, 0.1 per cent. solution;

Carbolic acid, 5 per cent. solution;

Absolute alcohol;

Ether;

Chloroform;

Camphor;

Thymol;

Toluol;

Volatile oils, such as oil of mustard, oil of garlic.

Формальдегид является мощным гермицидом, но его проникающий пар ограничивает его использование. Эти дезинфицирующие средства мало используются при окончательной стерилизации аппаратуры, главным образом из-за трудности их полного удаления, поскольку присутствие даже следов этих химикатов достаточно для того, чтобы подавить или изменить рост бактерий, что делает недействительными последующие эксперименты, проводимые с помощью аппаратуры, стерилизованной таким образом.

Примечание. Пробирки, колбы, фильтровальные колбы, пипетки, стеклянные трубки и т. д. в экстренных случаях можно быстро стерилизовать, промыв их по очереди дистиллированной водой, раствором сулемы, спиртом и эфиром, просушив и, наконец, осторожно нагрев над газовым пламенем, чтобы полностью удалить пары эфира. Хлороформ или другие летучие дезинфицирующие средства могут быть добавлены к различным жидкостям для уничтожения содержащихся в них бактерий, и когда это сделано, их можно полностью удалить из жидкости путем осторожного нагревания.

Сухой жар. — Открытое пламя горелки Бунзена неизменно используется для стерилизации платиновых игл (которые нагреваются докрасна) и может применяться для стерилизации кончиков пинцетов или других мелких инструментов, покровных стекол, пипеток и т. д., при этом достаточно очень короткого воздействия этого тепла.

Эфирное пламя. — В экстренных случаях мелкие инструменты, иглы и т. д. можно стерилизовать, окунув их в эфир, а после извлечения поджечь прилипшую жидкость и дать ей выгореть с поверхности инструментов. Повторите процесс дважды. После этого можно с уверенностью считать, что обработанная таким образом аппаратура стерильна.

Fig. 25.—Muffle furnace.

Муфельная печь (рис. 25). — Хотя этот вид нагрева в основном используется для уничтожения трупов мелких инфицированных животных, патологических тканей и т. д., он также применяется для стерилизации фарфоровых фильтрующих свечей (см. стр. 42).

Фильтрующие свечи дезинфицируют сразу после использования путем кипячения в стакане с водой в течение пятнадцати-двадцати минут. Однако эта обработка оставляет мертвые тела бактерий на поверхности и блокирует поры фильтра.

Чтобы уничтожить органическое вещество и подготовить фильтрующую свечу к дальнейшему использованию, действуйте следующим образом:

1. Оберните каждую свечу куском асбестовой ткани, закрепите концы ткани несколькими витками медной проволоки и поместите внутрь муфеля (небольшой муфель размером 76×88×163 мм вместит, возможно, четыре небольшие фильтрующие свечи).

2. Зажгите газ и доведите содержимое муфеля до белого каления; поддерживайте эту температуру в течение пяти минут.

3. Погасите газ, и когда муфель полностью остынет, извлеките фильтрующие свечи и храните их (не снимая асбестовую обертку) в стерильных металлических коробках.

Примечание. Слишком быстрое охлаждение свечей, которое происходит, если их извлечь из муфеля до того, как он остынет до комнатной температуры, может привести к появлению микроскопических трещин и дефектов, которые эффективно уничтожат их эффективность.

Горячий воздух. — Горячий воздух при 150° C уничтожает все бактерии, споры и т. д. примерно за тридцать минут; кратковременное воздействие температуры от 175° до 180° C даст тот же результат и является более удобным методом стерилизации. Этот метод применим только к стеклянным и металлическим веществам, а также к небольшому количеству ваты, содержащейся в пробках пробирок и т. д. Большие массы ткани не стерилизуются эффективно сухим жаром — если не обугливать их, — так как его проникающая способность невелика.

Стерилизация горячим воздухом осуществляется в сушильном шкафу (рис. 18). Это прямоугольная металлическая коробка с двойными стенками, установленная на подставке и нагреваемая снизу большой горелкой Бунзена. Внутри шкафа имеются съемные полки, на которых размещаются предметы для стерилизации, либо по отдельности, либо упакованные в квадратные проволочные корзины или ящики, хранящиеся специально для этой цели. Одна из сторон навешена на петли, образуя дверцу. Центральная часть металлического дна, на которую направлено пламя Бунзена, вырезана и заменена огнеупорными кирпичными пластинами, которые вставляются в металлические пазы и легко заменяются при поломке или износе. Верхняя часть шкафа снабжена перфорированной вентиляционной заслонкой и двумя трубками: одна для установки ртутного термометра, градуированного до 200° или 250° C, другая для терморегулятора. Можно использовать обычный ртутный терморегулятор, но предпочтительнее использовать регулирующую капсулу типа Хирсона (см. стр. 219) с пружинным рычагом, прикрепленным к рычагу так, чтобы при достижении температуры кипения капсулы (например, 175° C) подача газа полностью прекращалась, и горелку нельзя было снова зажечь, пока пружинный рычаг не будет переустановлен вручную. Терморегулятор отнюдь не является необходимостью и может быть заменен термометром с большим диаметром канала и подвижным платиновым контактом, соединенным с электрическим звонком, который можно легко настроить на срабатывание при любой заданной температуре. Даже если стерилизатор оснащен капсульным регулятором, описанным выше, следует также установить контактный термометр.

Fig. 26.—Hot-air oven.

Использование сушильного шкафа. —

1. Поместите ящики с пробирками, металлические футляры с чашками и пипетками, незакрепленную аппаратуру и т. д. внутрь шкафа, следя за тем, чтобы ватные пробки не соприкасались со стенками, иначе тепло, передаваемое металлом, обуглит или даже подожжет их.

Чтобы подготовить проволочный ящик для пробирок и т. д., покройте дно слоем толстой асбестовой ткани; или возьмите немного асбестового волокна, смочите его небольшим количеством воды и замесите в пасту; нанесите пасту на дно ящика, втирая ее в ячейки и разглаживая поверхность пестиком. Когда несколько ящиков будут таким образом обработаны, поместите их внутрь сушильного шкафа, закройте дверцу, откройте вентиляционную заслонку, зажгите газ и поднимите температуру внутри до 160° C. Через десять минут погасите газ, откройте дверцу шкафа и дайте содержимому остыть. Асбест теперь образует гладкий, сухой, губчатый слой на дне, который прослужит много месяцев, прежде чем потребуется его обновление, и значительно уменьшит потери пробирок из-за поломок.

Медные цилиндры и большие пробирки, предназначенные для пипеток, подготавливаются аналогичным образом, чтобы защитить кончики этих предметов от повреждений.

2. Закройте дверцу шкафа и откройте вентиляционную заслонку, чтобы влага, оставшаяся в пробирках и т. д., могла выйти; зажгите газ внизу; установите электрический сигнал на срабатывание при 100° C.

3. Когда температура в шкафу достигнет 100° C, закройте вентиляционную заслонку; переустановите сигнал на срабатывание при 175° C.

4. Поднимите температуру до 175° C.

5. Немедленно погасите газ и дайте аппаратуре остыть.

6. Когда температура внутри, зафиксированная термометром, упадет до 60° C — но не раньше — дверцу можно открыть, а стерильные предметы извлечь и убрать на хранение.

Примечание. Пренебрежение этим предварительным охлаждением шкафа до 60° C приведет к многочисленным трещинам и поломкам пробирок.

После извлечения из шкафа ватные пробки, вероятно, будут слегка коричневого цвета.

Металлические инструменты, такие как ножи, ножницы и пинцеты, можно стерилизовать в сушильном шкафу, как описано выше, но воздействие 175° C может серьезно повлиять на закалку стали и, безусловно, затупит режущие кромки. Если, однако, желательно стерилизовать хирургические инструменты горячим воздухом, их следует упаковать в металлический ящик или ящики, нагреть до 130° C и выдержать при этой температуре около тридцати минут.

Влажное тепло. — Вода при 56° C. — Эта температура, если поддерживать ее в течение тридцати минут, достаточна для уничтожения вегетативных форм бактерий, но практически не влияет на споры. Ее использование ограничивается стерилизацией таких альбуминовых «жидких» сред, которые коагулируют при более высокой температуре.

Метод. —

1. Подготовьте водяную баню, нагреваемую пламенем горелки Бунзена, которое регулируется терморегулятором, так чтобы температура воды оставалась на уровне 56° C.

2. Погрузите пробирки или колбы с альбуминовой жидкостью в водяную баню так, чтобы верхний уровень этой жидкости был как минимум на 2 см ниже уровня воды. (Температура бани теперь немного упадет, но через несколько минут снова поднимется до 56° C).

3. После тридцати минут воздействия при 56° C погасите газ, извлеките пробирки или колбы из бани и подвергните их воздействию проточной воды, чтобы их содержимое быстро охладилось.

4. Поскольку вегетативные формы бактерий, присутствующие в жидкости, убиты, оставьте ее на двадцать четыре часа в прохладном темном месте; по истечении этого времени некоторые из спор, которые могут присутствовать, прорастут и примут вегетативную форму.

5. Уничтожьте эти новые вегетативные формы аналогичным воздействием при 56° C на второй день, в то время как другие, с более медленным прорастанием, могут быть уничтожены на третий день и так далее.

6. Чтобы обеспечить тщательную стерилизацию, повторяйте процесс в течение шести последовательных дней.

Этот метод воздействия на жидкости температурой 56° C на водяной бане в течение получаса в течение шести последовательных дней называется дробной стерилизацией.

Вода при 100° C уничтожает вегетативные формы бактерий почти мгновенно, а споры — за пять-пятнадцать минут. Этот метод стерилизации применим к металлическим инструментам, таким как ножи, пинцеты и т. д., используемым в экспериментах на животных; шприцам, резиновым пробкам, резиновым и стеклянным трубкам и другой мелкой аппаратуре, и осуществляется в том, что обычно называют «водяным стерилизатором» (рис. 27).

Fig. 27.—Water sterilizer.

Это прямоугольная медная коробка длиной 26 см, шириной 18 см и глубиной 12 см, установленная на ножках, нагреваемая снизу горелкой Бунзена или радиальной газовой горелкой и содержащая съемный медный проволочный лоток, который на 2 см меньше стерилизатора по каждому измерению и снабжен ручками. Верхняя часть стерилизатора навешена на петли, образуя крышку.

Метод. —

1. Поместите инструменты и т. д., подлежащие стерилизации, внутрь медной корзины и верните корзину в стерилизатор.

2. Налейте достаточное количество воды в стерилизатор, закройте крышку и зажгите газ внизу.

Fig. 28.—Koch's steriliser.

Fig. 29.—Arnold's steriliser.

3. После того как вода закипит и пар будет выходить из-под крышки в течение не менее десяти минут, погасите газ, откройте крышку, выньте проволочную корзину за ручки и положите ее по диагонали на стенки стерилизатора; содержащиеся в ней инструменты и т. д. теперь стерильны и готовы к использованию.

4. После использования или при случайном загрязнении верните инструменты в корзину и поместите ее обратно в стерилизатор; полностью продезинфицируйте путем повторного кипячения в течение пятнадцати минут.

5. После дезинфекции, пока инструменты еще горячие, выньте их, тщательно и немедленно высушите и верните в футляры для хранения.

Текучий пар — т. е. пар при 100° C — уничтожает вегетативные формы бактерий за пятнадцать-двадцать минут, а споровые формы — за один-два часа. Этот метод в основном используется для стерилизации различных питательных сред, предназначенных для культивирования бактерий, и осуществляется в паровом котле специальной конструкции, известном как паровой стерилизатор Коха (рис. 28), или в одной из его многочисленных модификаций, наиболее эффективной из которых является стерилизатор Арнольда (рис. 29).

Паровой стерилизатор в своей простейшей форме состоит из высокого цилиндрического сосуда из луженого железа или меди, разделенного на две неравные части съемной перфорированной металлической диафрагмой; нижняя, меньшая часть служит резервуаром для воды, а верхняя — для размещения проволочных корзин с предметами, подлежащими стерилизации. Сосуд закрывается свободной конической крышкой, снабженной ручками и перфорированной на вершине трубкой; он установлен на штативе-треноге и нагревается снизу горелкой Бунзена. Более сложный стерилизатор обшит войлоком или асбестовым картоном и снабжен водомерным стеклом, а также краном для опорожнения отделения для воды.

Использование парового стерилизатора. —

1. Заполните отделение для воды до уровня перфорированной диафрагмы, установите крышку на место и зажгите горелку Бунзена.

2. После того как вода закипит, дайте достаточно времени для того, чтобы пар вытеснил воздух из стерилизационного отделения, о чем свидетельствует пар, выходящий ровной, непрерывной струей из трубки в крышке.

3. Снимите крышку, быстро опустите проволочную корзину с пробирками со средами и т. д. в стерилизационное отделение, пока она не встанет на диафрагму, и верните крышку на место.

4. Через двадцать минут в случае жидких сред или тридцать минут в случае твердых сред снимите крышку и извлеките корзину с содержимым.

5. Теперь, но не раньше, погасите газ.

Примечание. После извлечения пробирок, колб и т. д. из парового стерилизатора их следует сразу же расставить свободно, чтобы предотвратить конденсацию влаги на ватных пробках и ее просачивание внутрь пробирок.

Эта обработка уничтожит любые вегетативные формы бактерий; в течение часов охлаждения любые присутствующие споры прорастут, и молодые организмы будут уничтожены повторением процесса двадцать четыре часа спустя; третья стерилизация через аналогичный интервал делает результат двойне надежным.

Метод стерилизации путем воздействия текучим паром при 100° C в течение двадцати минут в течение трех последовательных дней называется прерывистой или дробной стерилизацией.

Воздействие пара при 100° C в течение одного или двух часов, или непрерывная стерилизация, не всегда надежно и поэтому не рекомендуется.

Перегретый пар — т. е. пар под давлением (см. таблицу давления-температуры, Приложение, стр. 500) в герметичных сосудах при температуре 115° C — уничтожит как вегетативные, так и споровые формы бактерий в течение пятнадцати минут; если давление увеличить, а температуру поднять до 120° C, та же цель достигается за десять минут. Этот метод ранее использовался для стерилизации сред (и, действительно, до сих пор используется в некоторых лабораториях), но большинство исследователей теперь понимают, что среды, подвергнутые этой высокой температуре под давлением, претерпевают гидролитические изменения, которые делают их непригодными для культивирования более деликатных микроорганизмов. Использование перегретого пара должно быть ограничено почти исключительно дезинфекцией таких загрязненных предметов, старых культур и т. д., которые нельзя обработать сухим жаром или в печи. Стерилизация с помощью перегретого пара осуществляется в специальном котле — автоклаве Шамберлана (рис. 30). Автоклав состоит из прочного медного цилиндра, снабженного медной или латунной крышкой, которая закрепляется на месте с помощью болтов и барашковых винтов, при этом соединение между цилиндром и крышкой герметично уплотняется прокладкой из резины. Крышка перфорирована для разветвленной трубки, несущей вентиляционный кран, манометр и предохранительный клапан. Медный котел установлен в верхней половине цилиндрического корпуса из листового железа — две концентрические круговые ряды горелок Бунзена, каждая из которых имеет независимую подачу газа, занимают нижнюю половину. Внутри котла находится большая съемная проволочная корзина, установленная на ножках, для размещения предметов, подлежащих стерилизации.

Использование автоклава. —

1. Упакуйте предметы, подлежащие стерилизации, в проволочную корзину.

2. Налейте воду в котел до уровня дна корзины; также наполните водой содержащиеся колбы и пробирки.

3. Убедитесь, что резиновая прокладка на месте, затем установите крышку и плотно закрепите ее на автоклаве с помощью барашковых винтов.

4. Откройте вентиляционный кран и зажгите оба кольца горелок.

5. Когда пар будет выходить ровной, непрерывной струей из вентиляционной трубки, закройте вентиляционный кран и погасите внешнее кольцо газовых горелок.

6. Подождите, пока стрелка манометра не покажет температуру 120° C, затем отрегулируйте газ и пружинный предохранительный клапан таким образом, чтобы эта температура поддерживалась, и оставьте в таком состоянии на двадцать минут. В более дорогих моделях автоклавов эта регулировка предохранительного клапана осуществляется автоматически: манометр оснащен регулируемым указателем, который можно установить на любое требуемое давление-температуру и настроить так, чтобы при совпадении стрелки манометра с регулируемым указателем предохранительный клапан открывался.

7. Погасите газ и дайте стрелке манометра упасть до нуля.

Fig. 30.—Chamberland's Autoclave.

8. Теперь медленно откройте вентиляционный кран и дайте внутреннему давлению сравняться с атмосферным.

9. Снимите крышку и извлеките стерилизованное содержимое.

Периоды стерилизации. — Чрезвычайно полезным устройством для отсчета периодов стерилизации (и, действительно, для многих других операций в лаборатории) является

ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ СИГНАЛЬНЫЕ ЧАСЫ.

Это часы американского типа, циферблат которых окружен металлической пластиной с рядом из 60 отверстий на равном расстоянии друг от друга, соответствующих минутам на циферблате. Эта пластина соединена с одним из полюсов сухой батареи, другой полюс которой соединен с металлическим корпусом часов для приведения в действие обычного магнитного звонка. В центре каждого из отверстий в пластине закреплен металлический стержень, который затем проходит через изолирующее кольцо и выступает внутри циферблата часов, где он контактирует с часовой стрелкой. Часы установлены на тяжелом основании с клавиатурой, содержащей 20 пронумерованных штекеров. Если один из штекеров вставлен в отверстие в пластине, он контактирует со стержнем, и когда часовая стрелка часов касается другого конца, цепь замыкается и звонок начинает звонить. Период этого фрикционного контакта составляет примерно 20 секунд. Таким образом, часы можно использовать для электрической фиксации периодов времени от одной минуты с интервалом в одну минуту до одного часа.

Fig. 31.—Electric signal timing clock.

Фильтрация. — (а) Ватный фильтр. — Практически единственным методом, используемым в лаборатории для стерилизации воздуха или газа, является фильтрация через сухую вату или стекловату, волокна которой запутывают микроорганизмы и предотвращают их прохождение.

Пожалуй, лучшим примером такого фильтра является ватная пробка, закрывающая горлышко пробирки с культурой. Через нее происходит не только обычная диффузия, но если пробирку, закупоренную обычным образом ватой, извлечь из горячего инкубатора, температура содержащегося в ней воздуха быстро падает до температуры лаборатории, и образуется частичный вакуум; воздух проходит в пробирку через ватную пробку, чтобы восстановить равновесие, и, пока пробка остается сухой, в стерильном состоянии. Если, однако, пробка становится влажной, либо в результате поглощения из атмосферы, либо из-за контакта с жидкостями, микроорганизмы (особенно плесневые грибы) начинают размножаться, и длинные нитевидные формы быстро проникают в толщу пробки, проникают внутрь и загрязняют содержимое пробирки.

Fig. 32.—Cotton-wool air filter.

Метод. —

Если желательно стерилизовать газы перед подачей в сосуд, содержащий чистую культуру микроорганизма, как, например, при пропускании тока кислорода над или через бульонную культуру дифтерийной палочки, это можно легко осуществить следующим образом:

1. Возьмите отрезок стеклянной трубки диаметром, скажем, 1,5 см, в центре которой выдута колба, наполните колбу сухой ватой (рис. 32), оберните слой ваты вокруг каждого конца трубки и закрепите на месте витком тонкой медной проволоки или ниткой; затем стерилизуйте этот кусок аппаратуры в сушильном шкафу.

2. Подготовьте культуру в колбе Руффера или Вудхеда (рис. 33), входная трубка которой имеет свободный конец, обернутый слоем ваты, закрепленным ниткой или проволокой, в то время как выходная трубка закупорена обычным образом.

Fig. 33.—Ruffer's flask.

3. Стерилизуйте короткий отрезок резиновой трубки путем кипячения. Перенесите его из кипящей воды в стакан с абсолютным спиртом.

4. Когда все будет готово, извлеките резиновую трубку из спирта с помощью пинцета, тщательно слейте жидкость и пронесите через пламя горелки Бунзена, чтобы сжечь последние следы спирта.

5. Снимите ватные обертки с входной трубки колбы и с одного конца фильтрующей трубки и быстро соедините их с помощью стерильной резиновой трубки.

6. Соедините другой конец колбовой трубки с подающей трубкой от газового резервуара.

Газ при прохождении через сухую стерильную вату в колбе фильтрующей трубки будет очищен от любых содержащихся микроорганизмов и поступит в колбу в стерильном состоянии.

(б) Фарфоровый фильтр. — Стерилизация жидкостей путем фильтрации осуществляется путем пропускания их через цилиндрический сосуд, закрытый с одного конца, как пробирка, и изготовленный либо из пористого «бисквитного» фарфора, твердообожженного и неглазурованного (система Шамберлана), либо из кизельгура, тонкой диатомовой земли (система Беркефельда), и называемый «бужи» или «свеча» (рис. 34).

Примечание. При выборе свечей для использования в лаборатории избегайте тех, у которых есть металлические фитинги, так как во время стерилизации на стыке металла и кремнистого материала возникают трещины из-за неравномерного расширения.

В этом методе бактерии задерживаются в порах фильтра, в то время как жидкость проходит через него в стерильном состоянии.

Очевидно, что для эффективности поры фильтра должны быть чрезвычайно мелкими, и поэтому скорость фильтрации обычно будет низкой. Фильтрующие свечи Шамберлана обладают более тонкими каналами, чем свечи Беркефельда, и, следовательно, фильтруют гораздо медленнее. Чтобы преодолеть этот недостаток, для ускорения процесса можно использовать аспирацию, давление или комбинацию этих двух сил.

Следует отметить, что белые фарфоровые фильтры Doulton столь же эффективны, как и свечи Шамберлана, и фильтруют несколько быстрее.

Необходимая аппаратура. —

1. Делительная воронка, содержащая нефильтрованную жидкость.

2. Стерильная фильтрующая свеча (рис. 34), открытый конец которой снабжен резиновой пробкой (рис. 34, а), перфорированной для приема подающей трубки делительной воронки, а ее горлышко пропущено через большую резиновую шайбу (рис. 34, b), которая плотно прилегает к горлышку фильтровальной колбы.

3. Стерильная фильтровальная колба подходящего размера для приема отфильтрованной жидкости, горлышко которой закрыто ватной пробкой.

4. Водоструйный насос Спренгеля (см. рис. 38, c) или насос Герика (воздушный насос, работающий по гидравлическому принципу, герметизированный маслом с низким давлением паров, рис. 35).

Если используется последний, между фильтровальной колбой и насосом необходимо поместить склянку Вульфа, оснащенную как промывная склянка и содержащую серную кислоту, чтобы предотвратить попадание влажного воздуха в масло в насосе.

5. Воздушный фильтр (см. стр. 40), стерилизованный.

6. Шланг высокого давления.

7. Винтовые зажимы (рис. 36).

Метод. —

1. Соедините выхлопную трубу всасывающего насоса с боковой трубкой фильтровальной колбы (предварительно удалив ватную пробку из последней) с помощью шланга высокого давления, при необходимости поместив между ними промывную склянку с серной кислотой.

Fig. 34.—Porcelain filter candle.

Fig. 35.—Geryk air pump.

2. Удалите ватную пробку из горлышка фильтровальной колбы и установите фарфоровую свечу на место.

Fig. 36.—Screw clamps.

3. Присоедините наконечник делительной воронки к фильтрующей свече с помощью перфорированной резиновой пробки (рис. 37).

Fig. 37.—Apparatus arranged for filtering—aspiration.

4. Откройте кран воронки и откачайте воздух из фильтровальной колбы и промывной склянки; поддерживайте вакуум до завершения фильтрации.

5. По завершении фильтрации закройте кран воронки; установите винтовой зажим на шланг высокого давления, прикрепленный к боковому отводу фильтровальной колбы; плотно затяните его и отсоедините промывную склянку с кислотой.

6. Присоедините воздушный фильтр к открытому концу шланга высокого давления; постепенно откройте винтовой зажим и дайте отфильтрованному воздуху войти в колбу, чтобы устранить отрицательное давление.

7. Отсоедините резиновую трубку от бокового отвода колбы, прокалите конец отвода в горелке Бунзена и закупорьте его отверстие стерильной ватой.

8. Извлеките фильтрующую свечу из горлышка колбы, прокалите горлышко и закупорьте его стерильной ватой.

9. Продезинфицируйте фильтрующую свечу и делительную воронку путем кипячения.

Если необходимо использовать давление в дополнение к всасыванию или вместо него, вставьте перфорированную резиновую пробку в горлышко делительной воронки и закрепите ее медной проволокой; затем вставьте кусок стеклянной трубки через пробку и соедините внешнее отверстие с каким-либо насосом для нагнетания воздуха (обычный ножной насос, такой как используется для накачивания велосипедных шин, является одним из наиболее полезных для этой цели) или с баллоном со сжатым воздухом или другим газом.

Для очень быстрой фильтрации большого объема жидкости необходимо использовать более высокое давление, чем то, которое выдержит стекло, и в этих случаях следует использовать металлический резервуар, разработанный Пейксом (рис. 38, a), для размещения самой фильтрующей свечи, а также жидкости, подлежащей фильтрации. (Во время всего процесса в фильтровальной колбе также должен поддерживаться вакуум с помощью вытяжного насоса.)

Этот аппарат состоит из латунного цилиндра емкостью 2500 куб. см с двумя плечиками и отверстием в горлышке на каждом конце, снабженным винтовой резьбой.

Гайка, несущая манометр, ввинчивается в верхнюю резьбу; а в нижнюю ввинчивается латунный цилиндр, несущий фильтрующую свечу и продолженный вниз в подающую трубку. Утечка предотвращается с помощью резиновых прокладок.

В верхнее плечико вставлена трубка, изогнутая под прямым углом и снабженная краном. Все латунные детали изнутри луженые (рис. 38, a). При использовании резервуар обычно устанавливается на штатив-треногу.

Стерилизация. —

1. Вставьте фильтрующую свечу в ее цилиндр и неплотно ввинтите его.

Fig. 38.—Pakes' filtering reservoir—pressure and
aspiration.

2. Оберните слой ваты вокруг подающей трубки и закрепите на месте.

3. Снимите гайку с манометром и закупорьте горлышко ватой.

4. Нагрейте весь аппарат в автоклаве при 120° C в течение двадцати минут.

Метод. —

1. Извлеките аппарат из автоклава и дайте ему остыть.

2. Плотно закрутите корпус, несущий бужи.

3. Установите аппарат в рабочее положение так, чтобы его подающая трубка (с которой была снята ватная обертка) проходила через перфорированную резиновую пробку в горлышке фильтровальной колбы.

Fig. 39.—Closed candle arranged for filtering.

4. Залейте жидкость, подлежащую фильтрации, в цилиндр и навинтите гайку с манометром. (Эту гайку следует погрузить в кипящую воду на несколько минут перед навинчиванием, чтобы стерилизовать ее.)

5. Соедините горизонтальный отвод входной трубки с баллоном со сжатым кислородом (или углекислым газом, рис. 38, b) с помощью шланга высокого давления.

6. Соедините боковой отвод фильтровальной колбы с вытяжным насосом (рис. 38, c) и запустите последний.

7. Откройте кран газового баллона; затем откройте кран на входной трубке фильтрующего цилиндра и повышайте давление внутри него, пока на манометре не будет зафиксирована желаемая точка. Поддерживайте это давление, обычно одну или полторы атмосферы, до завершения фильтрации, регулируя кран на входной трубке.

Некоторые формы фильтрующих свечей изготавливаются с открытым концом, суженным в подающий наконечник, который покрыт глазурью. В этом случае аппарат собирается немного иначе; жидкость, подлежащую фильтрации, помещают в открытый цилиндр, в который погружают свечу, а ее подающий наконечник соединяют с фильтровальной колбой с помощью куска гибкого шланга высокого давления (предварительно стерилизованного кипячением), как на рисунке 39.

IV. МИКРОСКОП.

Основные требования к микроскопу для бактериологической работы можно кратко суммировать следующим образом:

Fig. 40.—Microscope stand.

Инструмент монокулярного типа должен быть хорошего качества изготовления и хорошо отделан, жестким, устойчивым и свободным от вибрации не только в вертикальном положении, но и при наклоне под углом или в горизонтальном положении. Различные шарниры и механизмы должны работать плавно и точно, будучи одинаково свободными от дефектов «люфта» и «проскальзывания». Все винты и т. д. должны соответствовать стандарту Королевского микроскопического общества. Он также должен быть оснащен хорошими линзами и достаточно большим предметным столиком. Детали его составных частей, на которые следует обратить особое внимание, следующие:

Fig. 41.—Foot, three types.

1. Основание или ножка (рис. 40, a). — Две элементарные формы — штатив (рис. 41, a) и вертикальная колонна, установленная на пластине, известной как «подкова» (рис. 41, b), — служат образцами для бесчисленных модификаций формы и размера этой части штатива. Главные пожелания — устойчивость и простота манипуляций — достигаются в первой за счет «размаха» трех ножек, которые обычно подбиты пробкой; во второй — за счет собственного веса опорной пластины. Штатив является механически более правильной формой, и для практического использования он предпочтительнее. Его главный конкурент, ножка Джексона (рис. 41, c), основан на том же принципе, и с точки зрения внешнего вида его можно рекомендовать.

2. Тубус (рис. 40, b) может быть либо так называемым «длинным» или «английским» (длина 250 мм), либо «коротким» или «континентальным» (длина 160 мм). Ни одна из длин, по-видимому, не обладает существенным преимуществом перед другой, но абсолютно необходимо обеспечить объективы, изготовленные для выбранной длины тубуса. В высококлассных микроскопах наших дней тубус обычно короче континентального, но снабжен выдвижной трубкой, которая при полном выдвижении дает длину тубуса больше английской, тем самым позволяя использовать любую форму объектива.

Fig. 42.—Coarse adjustment.

Fig. 43.—Fine adjustment.

Для практических целей длина тубуса = расстояние от конца револьверной головки до глазной линзы окуляра. Это измерение, на которое ссылаются, говоря о «длинном» или «коротком» тубусе.

3. Грубая настройка (рис. 40, c) должна представлять собой реечно-шестереночный механизм, при этом устойчивость и плавность хода обеспечиваются точно подогнанными направляющими типа «ласточкин хвост» и идеальным соответствием между зубьями рейки и зубьями шестерни (рис. 42). Также следует предусмотреть возможность устранения «люфта» (например, с помощью винтов AA, рис. 42).

4. Тонкая настройка (рис. 40, d) ни в коем случае не должна зависеть от прямого действия пружин, а должна быть рычажного типа, предпочтительно Нельсона (рис. 43). В этой форме неравная длина плеч рычага обеспечивает очень деликатное движение, и, кроме того, лишь небольшая часть веса тубуса передается на резьбу вертикального винта, приводящего в действие механизм.

Fig. 44.—Spindle head to fine adjustment.

Микрометрический винт со шпинделем (рис. 44) окажется очень полезным устройством, если его установить вместо обычного винта, управляющего тонкой настройкой. В этом приспособлении ось винта продолжена вверх в виде короткой колонки, диаметр которой составляет одну шестую диаметра головки. Шпиндель можно быстро вращать пальцами для настройки средних увеличений, в то время как большую головку можно медленно перемещать при фокусировке больших увеличений.

5. Предметный столик (рис. 40, e) должен быть квадратной формы и иметь большую площадь — не менее 12 см, — быть плоским и жестким, чтобы служить надежной опорой для чашки Петри, используемой при культивировании на пластинках; он должен быть снабжен пружинными зажимами (которые можно снимать по желанию) для фиксации предметных стекол размером 3 на 1 дюйм.

Механический столик следует считать скорее необходимостью, чем роскошью, насколько это касается бактериолога, так как при работе с большими увеличениями, и особенно при исследовании препаратов «висячая капля», практически невозможно выполнять достаточно тонкие движения пальцами. При выборе механического столика предпочтение следует отдавать тому, который является неотъемлемой частью инструмента (рис. 45), а не тому, который нужно каждый раз прикреплять к обычному простому столику, когда это требуется, и его перемещения должны контролироваться неподвижными головками с накаткой (рис. 45, AA'). Форма апертуры — немаловажный момент; она должна быть квадратной, чтобы обеспечить свободное движение над конденсором. В механическом столике должны быть нарезаны отверстия для трех (съемных) винтовых штифтов, используемых вместо подвижной планки, чтобы при желании можно было использовать верньерный искатель (рис. 45, BB'), которым обычно оснащается этот класс столиков, или искатель Мальтвуда.

Fig. 45.—Mechanical stage.

Fig. 46.—Iris diaphragm.

6. Диафрагма. — Следует избегать отдельных простых диафрагм; предпочтительнее вращающаяся пластина с отверстиями разного размера, закрепленная под столиком, но, несомненно, лучшей формой является «ирисовая» диафрагма (рис. 46), которая входит в конструкцию конденсора.

7. Конденсор является необходимой частью оптического оснащения. Его цель — собрать пучок параллельных лучей света, отраженных плоским зеркалом, с помощью короткофокусной системы линз в конус с большой апертурой (уменьшаемой по желанию с помощью ирисовой диафрагмы, установленной как часть конденсора), который можно точно сфокусировать на плоскости объекта. Эта фокусировка должна выполняться заново для каждого объекта из-за различий в толщине предметных стекол.

Наиболее распространенной формой является так называемый конденсор Аббе (рис. 47), состоящий из плосковыпуклой линзы, установленной над двояковыпуклой линзой. Эта комбинация находится в центрирующем держателе, известном как подстольное устройство, расположенном под столиком микроскопа (рис. 40, f), и должна быть точно отрегулирована так, чтобы ее оптическая ось совпадала с осью объектива. Вертикальное перемещение всего подстольного устройства, осуществляемое с помощью реечного механизма, является несомненным преимуществом, и должны быть предусмотрены средства для временного выведения конденсора из оптической оси микроскопа.

Fig. 47—Optical part of Abbé illuminator.

Однако при работе с иммерсионным объективом следует использовать ахроматический конденсор, дающий освещающий конус около 0,9, если необходимо получить полную отдачу от линзы. Обычно считается, что хороший объектив требует освещающего конуса, эквивалентного двум третям его числовой апертуры. Лучший конденсор Аббе пропускает конус около 0,45, в то время как апертура 1/12-дюймовых иммерсионных линз разных производителей варьируется от 1,0 до 1,4, следовательно, эффективность этих линз значительно снижается, если конденсор — просто Аббе. Эти улучшенные конденсоры должны быть абсолютно центрированы по отношению к объективу и способны к очень точной фокусировке, иначе большая часть их ценности теряется.

8. Зеркала. — Под конденсором прикреплен карданный подвес, несущий вращающуюся круглую рамку с плоским зеркалом с одной стороны и вогнутым зеркалом с другой (рис. 40, g). Обычно используется плоское зеркало, но иногда, например, при использовании малых увеличений, когда конденсор опущен и выведен из оптической оси, используется вогнутое зеркало.

9. Окуляры. — Те, что известны как окуляры Гюйгенса (рис. 48), будут достаточны для всей обычной работы без прибегания к более дорогим «компенсационным» окулярам. Два или три окуляра, увеличивающие «реальное» изображение (сформированное объективом) в четыре, шесть или восемь раз соответственно, составляют полезное оснащение.

В качестве принадлежности окуляр Эрлиха является очень полезным аппаратом, когда необходимо проводить подсчет клеток или бактерий. Это обычный окуляр, оснащенный регулируемой квадратной диафрагмой, управляемой рычагом, выступающим сбоку оправы. На одной из сторон квадрата сделаны три выемки, и при перемещении рычага квадратную апертуру можно уменьшить до трех четвертей, одной второй или одной четверти от исходного размера.

10. Объективы. — Необходимы три объектива: один для работы с малым увеличением — например, 1 дюйм, 2/3 дюйма или 1/2 дюйма; один для работы с большим увеличением — например, 1/12-дюймовая масляная иммерсионная линза; и промежуточная линза «среднего увеличения» — например, 1/6 дюйма или 1/8 дюйма (сухая). Эти линзы должны быть тщательно отобраны, при этом особое внимание следует уделить следующим пунктам:

(a) Исправление сферической аберрации. — Сферическая аберрация приводит к нечеткому изображению из-за того, что центральные и периферические лучи фокусируются в разных точках.

(b) Исправление хроматической аберрации. — Хроматическая аберрация приводит к появлению цветной каймы вокруг краев объектов из-за того, что лучи спектра разного цвета обладают разной преломляющей способностью и простая линза действует на них как призма.

(c) Плоскостность поля зрения. — Идеальное поле зрения должно быть большим и, прежде всего, плоским; другими словами, объекты на периферии поля должны быть так же отчетливо «в фокусе», как и объекты в центре. К сожалению, однако, это оптически невозможно, и поле всегда имеет сферическую форму. Некоторым производителям удается обеспечить большую центральную область, которая находится в фокусе одновременно, чем другим, и хотя теоретически это может вызвать бесконечно малое принесение в жертву других качеств, к этому всегда следует стремиться. Последовательные зоны и все периферийное кольцо должны попадать в фокус при изменении точной настройки. Эта одновременная резкость всего круга является признаком идеальной центрировки всех линз в объективе.

Fig. 48.—Huyghenian eyepiece.

(d) Хорошая разрешающая способность. — Фактическое увеличение, конечно, в определенных пределах, менее ценно, чем четкость и высокая разрешающая способность, ибо именно от этих свойств зависит наше знание детальной структуры исследуемых объектов.

(e) Числовая апертура (N. A.). — Числовую апертуру можно определить в общих чертах как отношение эффективного диаметра задней линзы объектива к его эквивалентному фокусному расстоянию. Определение этого параметра — процесс, требующий значительного технического мастерства и математических способностей, и он полностью выходит за рамки возможностей среднего микроскописта. [1]

Хотя с увеличением мощности соответственно трудно совместить все эти исправления в одном объективе, они доведены до высокой степени совершенства в современных «ахроматических» объективах, что устраняет необходимость использования более дорогих и менее долговечных апохроматических линз.

При выборе объективов лучшими «тестовыми» объектами для использования являются:

1. A thin (one cell layer), even} { 1", 2/3", 1/2":
"blood film," stained with Jenner's}for{ 1/6", 1/8"
or Romanowsky's stain.} { 1/12" oil
 
2. A thin cover-slip preparation}
of a young cultivation of} {1/8" dry
B. diphtheriæ (showing}for{
segmentation) stained with} {1/12" oil
methylene-blue.

Принадлежности. — Наглазник (рис. 49). — Этот аппарат состоит из грушевидного куска черненого металла или эбонита, прикрепленного на шарнирах к кольцу, которое вращается на верхней части тубуса микроскопа. Его можно использовать для того, чтобы закрыть изображение окружающих предметов от незадействованного глаза, и при проведении длительных наблюдений он окажется весьма полезным.

Револьверное устройство. — Пожалуй, самая полезная принадлежность — это револьвер для двух объективов (рис. 50) или, что еще лучше, для всех трех (рис. 51). Это револьверное устройство, предпочтительно изготовленное из алюминия, должно быть закрытого типа и состоять из изогнутой пластины, прикрепленной к нижнему концу тубуса, — в ней вырезано круглое отверстие, соответствующее просвету тубуса. К нижней поверхности этой пластины на шарнире прикреплена аналогично изогнутая пластина, снабженная тремя трубками, каждая из которых несет объектив. Вращая нижнюю пластину, каждый из объективов можно последовательно вводить в оптическую ось микроскопа.

Fig. 49.—Eye shade.

Однако для критической работы и особенно для фотомикрографии сменный револьвер отнюдь не идеален, так как практически невозможно обеспечить точную центрировку каждой линзы на оптической оси. Поэтому для специальных целей необходимо использовать специальное револьверное устройство, например, производства Zeiss или Leitz, в которое каждый объектив вставляется на своем собственном держателе и на котором он точно центрируется.

Fig. 50.—Double nosepiece.

Fig. 51.—Triple nosepiece.

Термостолик (рис. 52). — Это плоский металлический корпус, содержащий систему трубок, через которые может циркулировать вода любой требуемой температуры. Он крепится к столику микроскопа винтами AA' и имеет большое отверстие, совпадающее с оптической осью микроскопа; короткая трубка B, выступающая с одного конца термостолика, позволяет подавать воду желаемой температуры из резервуара через отрезок резиновой трубки внутрь столика, а аналогичная трубка на другом конце столика B' позволяет отводить отработанную воду. Повышая температуру препаратов «висячая капля» и т. д., помещенных на него, выше температуры окружающей среды, термостолик делает возможными точные наблюдения за прорастанием спор, культивированием в «висячей капле» и т. д.

Fig. 52.—Warm stage.

Лучшей формой является электрический термостолик, разработанный Лоррейн Смит; [2] он требует добавления лампового сопротивления и ползункового реостата, а также чувствительного амперметра с ценой деления 0,01 ампера. Он состоит из деревянной рамы, поддерживающей плоскую стеклянную колбу с длинным горлышком, изогнутым вверх под тупым углом (рис. 53). Колба заполнена жидким парафином, который поднимается в открытом горлышке при расширении от нагрева. В горлышке также размещается термометр. Две катушки из манганиновой проволоки проходят в парафине с противоположных сторон колбы (вне поля зрения), соединенные с латунными клеммами на деревянной раме платиновой проволокой, впаянной в стекло. Сопротивление двух катушек, соединенных последовательно, составляет около 10 Ом. Требуется ток 2,5 ампера, который подводится к катушкам в столике через реостат. С помощью амперметра можно получить и поддерживать любую желаемую температуру до примерно 200° C. Если обеспечить контакт иммерсионного масла между верхней линзой конденсора и нижней поверхностью колбы, этот столик очень хорошо работает с 1/12-дюймовым масляным иммерсионным объективом.

Fig. 53.—Lorrain Smith's warm stage.

Конденсор темного поля или параболоидный конденсор. — Это иммерсионный подстольный конденсор с высокой апертурой, с помощью которого неокрашенные объекты, такие как бактерии, могут быть показаны как ярко-белые частицы на густом черном фоне. Центральные лучи света блокируются непрозрачной заслонкой, в то время как периферические лучи отражаются от параболоидных сторон конденсора и преломляются рассматриваемым объектом. Для получения наилучших результатов с этим типом конденсора необходим мощный источник света — например, небольшая дуговая лампа или лампа накаливания — вместе с отобранными предметными стеклами определенной толщины (указанной для конкретной марки конденсора, но обычно 1 мм) и специально тонкими покровными стеклами (не более 0,17 мм). Объектив не должен иметь числовую апертуру выше 1,0, следовательно, иммерсионные линзы должны быть оснащены внутренней диафрагмой для уменьшения апертуры.

Микрометр. — Также необходима некоторая форма микрометра для измерения бактерий и других объектов. Подробности о тех, что используются в общем порядке, можно найти на следующих страницах.

Fig. 54—Diamond Object marker.

Маркировщик объектов (рис. 54). — Это чрезвычайно полезный аппарат. Сделанный в форме объектива, он имеет линзы, замененные алмазным острием, установленным немного не по центру, которое можно вращать с помощью рифленой пластины. Привинченный к револьверу вместо объектива, вращение алмазного острия прочертит небольшой круг на предметном стекле, чтобы навсегда зафиксировать положение интересной части препарата. Алмаз установлен на пружине, которая регулирует давление, а размер круга можно регулировать с помощью бокового винта.

МЕТОДЫ МИКРОМЕТРИИ.

Единицей длины, применяемой для измерения микроскопических объектов, является одна тысячная часть миллиметра (0,001 мм), называемая микроном (иногда ошибочно называемым микрометром) и обозначаемая при письме греческой буквой µ. Из многих методов, используемых для измерения бактерий, здесь будут описаны только три, а именно:

(a) С помощью камеры-люциды.

(b) С помощью окулярного микрометра.

(c) С помощью филярного микрометра (микрометрический окуляр Рамсдена).

Для каждого из этих методов необходим объект-микрометр. Это стеклянная пластинка размером 3 на 1 дюйм, на которой выгравирована шкала, разделенная на сотые доли миллиметра (0,01 мм), причем каждая десятая линия сделана длиннее промежуточных для облегчения счета; и по этим выгравированным линиям в каждом случае оценивается измерение. Покровное стекло приклеено поверх шкалы для защиты от повреждений.

Fig. 55.—Camera lucida, Abbé pattern.

(a) С помощью камеры-люциды.

1. Прикрепите камеру-люциду (модели Волластона, Била или Аббе) (рис. 55) к окуляру микроскопа.

2. Установите микрометр на предметный столик микроскопа и точно сфокусируйте деления.

3. Проецируйте шкалу объект-микрометра на лист бумаги и пером или карандашом зарисуйте увеличенное изображение, каждое деление которого соответствует 10 µ. Отметьте на бумаге оптическую комбинацию (окуляр, объектив и длину тубуса), использованную для получения этого конкретного увеличения.

4. Повторите эту процедуру для каждой из возможных комбинаций окуляров и объективов, установленных на имеющемся микроскопе, и тщательно сохраните полученные таким образом шкалы.

Чтобы измерить объект этим методом, просто проецируйте изображение на шкалу, соответствующую конкретной оптической комбинации, используемой в данный момент. Считайте количество делений, которое он занимает, и выразите их в микронах.

Вместо сохранения шкалы для каждой оптической комбинации, измеряемый объект и шкалу микрометра можно проецировать и зарисовывать по очереди на одном и том же листе бумаги, при этом тщательно следя за тем, чтобы центр окуляра находился на расстоянии 25 см от бумаги, на которой нарисованы деления.

Fig. 56.—Eyepiece micrometer, ordinary.

Fig. 57.—Eyepiece micrometer, net.

(b) С помощью окулярного микрометра.

Окулярный микрометр представляет собой круглый стеклянный диск, на котором выгравирована шкала, разделенная на десятые доли миллиметра (0,1 мм) (рис. 56), или вся поверхность расчерчена на квадраты 0,1 мм (сетчатый микрометр) (рис. 57). Его можно установить внутри оправы любого окуляра чуть выше апертуры диафрагмы, и он должен быть отрегулирован точно в фокусе глазной линзы.

Некоторые производители монтируют стеклянный диск вместе с круглым покровным стеклом таким образом, что при установке в любой окуляр Гюйгенса их собственного производства шкала оказывается точно в фокусе для нормального зрения. Также можно приобрести специальные окуляры, имеющие подвижную регулировку глазной линзы для фокусировки микрометра.

Значение одного деления шкалы микрометра должно быть сначала определено для каждой оптической комбинации с помощью объект-микрометра, следующим образом:

1. Вставьте окулярный микрометр внутрь окуляра и установите объект-микрометр на предметный столик микроскопа.

2. Точно сфокусируйте шкалу объект-микрометра; линии будут казаться расположенными непосредственно под линиями окулярного микрометра. Сделайте линии на двух микрометрах параллельными, вращая окуляр.

3. Совместите две линии окулярного микрометра с линиями, ограничивающими одно деление объект-микрометра; это достигается увеличением или уменьшением длины тубуса; и отметьте количество включенных делений.

4. Рассчитайте значение каждого деления окулярного микрометра в микронах с помощью следующей формулы:

x = 10 y.

Where x = the number of included divisions of the
eyepiece micrometer.

y = the number of included divisions of the
stage micrometer.

5. Отметьте оптическую комбинацию, использованную в этом эксперименте, и запишите ее вместе с рассчитанным значением микрометра.

Повторите этот процесс для каждой из других комбинаций. Тщательно записывайте результаты.

Чтобы измерить объект этим методом, считайте количество делений окулярного микрометра, которое он занимает, и выразите результат в микронах, обратившись к стандартному значению для конкретной используемой оптической комбинации.

Zeiss готовит компенсационный окулярный микрометр для использования со своими апохроматическими объективами, деления которого вычислены так, что (при длине тубуса 160 мм) значение каждого эквивалентно стольким микронам, сколько миллиметров составляет фокусное расстояние используемого объектива.

Эйконометр Райта — это, по сути, модификация окулярного микрометра для быстрого измерения микроскопических объектов путем прямого осмотра, после предварительного определения увеличительной способности конкретной используемой оптической комбинации. Это небольшой аппарат, напоминающий окуляр, с подвижной глазной линзой, которую можно точно сфокусировать на микрометрической шкале, закрепленной внутри инструмента. При помещении над окуляром микроскопа деления этой шкалы измеряют фактический размер виртуального изображения в миллиметрах.

Чтобы использовать этот инструмент для прямого измерения, сначала необходимо определить увеличительную способность каждой комбинации окуляра, длины тубуса и объектива.

Поместите объект-микрометр, разделенный на сотые доли миллиметра, на предметный столик микроскопа и точно сфокусируйте.

Установите эйконометр на окуляр. Наблюдение через эйконометр показывает его микрометрическую шкалу, наложенную на изображение объект-микрометра.

Вращайте эйконометр до тех пор, пока линии на двух шкалах не станут параллельными, и выполните различные регулировки, чтобы убедиться, что две линии на шкале эйконометра совпадают с двумя линиями на объект-микрометре.

Для иллюстрации можно предположить, что пять делений на объект-микрометре точно заполняют одно из делений шкалы эйконометра; это указывает на увеличительную способность 500 как константу для этой конкретной оптической комбинации, и этот факт следует записать.

Константы увеличения различных других оптических комбинаций следует аналогичным образом определить и записать.

Для измерения любого объекта впоследствии его следует сначала тщательно сфокусировать обычным способом.

Затем следует приложить эйконометр к окуляру и считать размер объекта по шкале эйконометра в миллиметрах, а фактический размер рассчитать, разделив наблюдаемый размер на константу увеличения для конкретной оптической комбинации, использованной при наблюдении.

(c) С помощью филярного микрометра.

Fig. 58.—Ramsden's Filar micrometer.

Fig. 59.—Ramsden's micrometer field, a, fixed wire;
b, reference wire (fixed); c, travelling wire.

Филярный или паутинный микрометр (микрометр Рамсдена) (рис. 58) состоит из окуляра, имеющего тонкую «фиксированную» нить, натянутую горизонтально через поле зрения (рис. 59), вертикальную контрольную нить — фиксированную — отрегулированную под прямым углом к первой; и тонкую нить, параллельную контрольной нити, которую можно перемещать по полю зрения с помощью микрометрического винта; головка барабана разделена на сто частей, которые последовательно проходят мимо фиксированного индекса при вращении головки. В нижней части поля зрения находится гребенка, интервалы между зубцами которой соответствуют одному полному обороту этой винтовой головки.

Как и в предыдущем методе, значение каждого деления шкалы микрометра (т. е. гребенки) должно быть сначала определено для каждой оптической комбинации. Это осуществляется следующим образом:

1. Установите филярный микрометр и объект-микрометр в их соответствующие положения.

2. Вращайте винт филярного микрометра до тех пор, пока подвижная нить не совпадет с фиксированной, а индекс не укажет ноль на головке барабана. (Если при нулевом положении головки барабана две нити не совпадают точно, их необходимо отрегулировать, ослабив винт барабана и переустановив барабан.)

3. Точно сфокусируйте шкалу каждого микрометра и сделайте линии на них параллельными.

4. Вращайте головку микрометрического винта до тех пор, пока подвижная линия не пройдет одно деление объект-микрометра. Отметьте количество полных оборотов (с помощью регистрирующей гребенки) и доли оборота (с помощью шкалы на головке микрометрического винта), которые требуются для измерения 0,01 мм.

5. Сделайте несколько таких оценок и усредните результаты.

6. Отметьте оптическую комбинацию, использованную в этом эксперименте, и тщательно запишите ее вместе со значением микрометра в микронах.

7. Повторите этот процесс для каждой из различных оптических комбинаций и запишите результаты.

Чтобы измерить объект этим методом, просто отметьте количество оборотов и долей оборота винтовой головки, необходимых для прохождения такого объекта от края до края, и выразите результат в микронах, обратившись к записанным значениям для этой конкретной оптической комбинации.

Осветитель микроскопа. — В тропических и субтропических регионах лучшим источником света является рассеянный дневной свет. Однако в умеренном климате дневной свет в желаемом количестве доступен не всегда, и приходится прибегать к масляным лампам, газовым лампам — предпочтительно с калильными сетками — и электричеству; и из них последнее, несомненно, является лучшим. Удобный держатель для лампы, который можно изготовить в лаборатории, показан на рис. 60. Он состоит из базовой доски, утяжеленной свинцом, к которой прикреплен обычный бытовой патрон для лампы, а позади него закреплен изогнутый отражатель из листового железа. Матовая лампа с металлической нитью накаливания мощностью около 16 свечей дает наиболее подходящий свет, и если нужен монохроматический свет, синий жирный карандаш наносится штрихами на сторону лампы, ближайшую к микроскопу; включается ток, и когда стеклянная колба нагреется, протирание ватным тампоном легко распределит синий жирный материал ровной пленкой по матовому стеклу.

Fig. 60.—Electric microscope lamp.

СНОСКИ:

[1] Однако ее важность будет осознана, если привести слова покойного профессора Аббе: «Числовая апертура линзы определяет все ее существенные качества; яркость изображения увеличивается при заданном увеличении и прочих равных условиях как квадрат апертуры; разрешающая и определяющая способности напрямую связаны с ней, фокусная глубина дифференциации глубин изменяется обратно пропорционально апертуре и так далее».

[2] Изготовлено г-ном Отто Баумбахом, 10, Лайм Гроув, Манчестер.

V. МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИЙ И ДРУГИХ МИКРОГРИБОВ.

АППАРАТУРА И РЕАКТИВЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ОБЫЧНОМ МИКРОСКОПИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ.

Ниже перечислены основные аппараты и реактивы для рутинной работы, которыми должен быть обеспечен каждый студент.

1. Резиновый «коврик для смены», на котором можно оставлять покровные стекла во время процесса окрашивания.

2. Квадраты промокательной бумаги размером около 10 см для сушки покровных и предметных стекол.

(Фильтровальная бумага, известная как «немецкая линованная» — хорошо впитывающая, плотно сплетенная бумага с ровной поверхностью и без рыхлого «пуха», который мог бы прилипнуть к препаратам, — является наиболее полезной для этой цели.)

Fig. 61.—Disinfectant Jar.

3. Стеклянная банка, наполненная 2-процентным раствором лизола, для приема инфицированных покровных стекол, инфицированных пипеток и т. д.

4. Квадратная глазурованная глиняная коробка со свободной подкладкой, содержащая 2-процентный раствор лизола, для приема инфицированного материала и использованных предметных стекол. Дно подкладки перфорировано, так что, когда она заполнена, подкладку с ее содержимым можно целиком вынуть из коробки, при этом дезинфицирующий раствор стекает, а предметные стекла и т. д. можно легко высыпать. Затем пустую подкладку возвращают в коробку с ее дезинфицирующим раствором (рис. 61).

5. Бунзеновская горелка, снабженная байпасом для «дежурного пламени».

6. Фарфоровый лоток, вмещающий пять или шесть предметных стекол для «висячей капли» (рис. 62).

Fig. 62.—Hanging-drop slides: a, Double cell seen from
above; b, single cell seen from the side.

Лучшей формой предметного стекла для «висячей капли» является модификация стекла с кольцом Бёттхера, которая готовится путем приклеивания круглой ячейки из олова диаметром 13–15 мм и высотой 1–2 мм к центру предметного стекла 3 на 1 дюйм с помощью канадского бальзама. Часто бывает чрезвычайно удобно иметь две такие ячейки, приклеенные близко друг к другу на одном стекле (рис. 62, a).

Существует еще одна форма предметного стекла для «висячей капли», в которой круглое или овальное углубление или «ячейка» вышлифовывается в центре стекла 3 на 1 дюйм. Они дороже, с ними менее удобно работать, они легче загрязняются каплями исследуемого материала, и их следует тщательно избегать.

7. Три алюминиевых стержня (рис. 63), каждый длиной около 25 см, несущие кусок платино-иридиевой проволоки калибра 0,015 длиной 7,5 см. Конец одной из проволок загнут, образуя овальную петлю с коротким диаметром около 1 мм, и называется петлей или «озе»; терминальные 3 или 4 мм другой проволоки сплющены путем постукивания по гладкой железной поверхности, образуя «шпатель»; третья оставлена нетронутой или заострена с помощью напильника. Эти инструменты используются для инокуляции пробирок с культурой и подготовки препаратов для микроскопического исследования.

Fig. 63.—Ends of platinum rods. a, loop; b, spatula;
c, needle.

Метод крепления этих проволок можно описать следующим образом:

Возьмите кусок алюминиевой проволоки длиной 25 см и диаметром около 0,25 см и просверлите тонкое отверстие полностью через проволоку на расстоянии около сантиметра от одного конца. Проделайте прямой узкий канал вдоль одной стороны проволоки, по ее длинной оси, от отверстия до ближайшего конца, сначала неглубокий, но постепенно становящийся глубже.

На противоположной стороне проволоки сделайте короткий разрез длиной 2 мм, ведущий от отверстия в том же направлении. [Использование тонкого стоматологического бора и маленькой циркулярной пилы, приводимых в действие стоматологическим мотором, облегчает изготовление этих инструментов с алюминиевыми ручками.]

Теперь пропустите один конец платиновой проволоки через отверстие, отогните около 2 мм под прямым углом и вдавите короткий кусок в короткий разрез. Резко поверните длинный конец проволоки, также под прямым углом, и утопите его в длинный канал так, чтобы он выходил примерно из центра срезанного конца алюминиевой проволоки (рис. 63). Несколько резких ударов часовым молотком теперь закроют стороны двух каналов поверх проволоки и надежно удержат ее.

Fig. 64.—Platinum rod in aluminium handle—method of
mounting.

The platinum wire may be fused into the end of a piece of glass rod, but
such a handle is vastly inferior to aluminium and is not to be
recommended.

8. Две пары остроконечных пружинных пинцетов (длиной 10 см), один из которых должен содержаться в идеальной чистоте и предназначаться для работы с чистыми покровными стеклами, а другой — для использования во время операций окрашивания.

9. Коробка чистых предметных стекол 3 на 1 дюйм.

10. Стеклянная капсула с плотно прилегающей (притертой) стеклянной крышкой, содержащая чистые покровные стекла в абсолютном спирте.

11. Один из «жирных карандашей» Фабера (желтый, красный или синий) для письма по стеклу.

12. Деревянная стойка (рис. 65) с двенадцатью капельницами (рис. 66) емкостью по 60 куб. см каждая, содержащими

Aniline water.

Gentian violet, saturated alcoholic solution.

Lugol's (Gram's) iodine.

Absolute alcohol.

Methylene-blue, }

Fuchsin, basic, } saturated alcoholic solution.

Neutral red, 1 per cent. aqueous solution.

Leishman's modified Romanowsky stain.

Carbolic acid, 5 per cent. aqueous solution.

Acetic acid, 1 per cent. solution.

Sulphuric acid, 25 per cent. solution.

Xylol.

Fig. 65.—Staining rack, rubber change mat and lysol
pot.

Fig. 66.—Drop bottle.

Fig. 67.—Canada balsam pot.

И две банки с герметичными стеклянными крышками (рис. 67), каждая снабжена стеклянной палочкой и наполнена соответственно канадским бальзамом, растворенным в ксилоле, и стерильным вазелином.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Бактерии и т. д. исследуются микроскопически.

1. In the living state, unstained, or stained.

2. In the "fixed" condition (i. e., fixed, killed,
and stained by suitable methods).

Подготовку препарата из пробирочной культуры для исследования этими методами можно описать следующим образом:

1. Живые, неокрашенные. — (a) «Свежий» препарат. —

1. Очистите и высушите предметное стекло 3 на 1 дюйм и поместите его на один из квадратов фильтровальной бумаги. Нанесите каплю воды (предпочтительно дистиллированной) или каплю 1-процентного раствора едкого кали в центр стекла с помощью платиновой петли.

Fig. 68.—Holding tubes for removing bacterial growth, as
seen from the front.

Техника открывания и закрывания пробирки с культурой.

2. Извлеките пробирочную культуру из стойки или банки левой рукой и подожгите ватную пробку, поднеся ее к пламени Бунзеновской горелки. Потушите пламя, подув на пробку, вращая при этом пробирку вокруг ее длинной оси, горлышком вертикально вверх, между большим и остальными пальцами. (Эта операция называется «обжигом пробки» и предназначена для уничтожения любых микроорганизмов, которые могли запутаться в рыхлых волокнах ваты и которые, если их не уничтожить таким образом, могли бы упасть в пробирку при снятии пробки и случайно загрязнить культуру.)

3. Держите пробирку за центр или около него между концами большого и двух первых пальцев левой руки и позвольте запаянному концу опираться на тыльную сторону кисти между большим и указательным пальцами, при этом пробка должна быть направлена вправо. Держите пробирку как можно ближе к горизонтальному положению, насколько это совместимо с безопасностью, чтобы уменьшить риск случайного попадания организмов (рис. 68).

4. Возьмите ручку петли между большим и указательным пальцами правой руки, держа инструмент в положении, аналогичном тому, которое занимает ручка или кисть для рисования, и стерилизуйте платиновую часть, удерживая ее в пламени Бунзеновской горелки докрасна. Стерилизуйте прилегающую часть алюминиевой ручки, быстро проведя ею два или три раза через пламя. После стерилизации петлю нельзя выпускать из рук или позволять ей касаться чего-либо, кроме материала, предназначенного для исследования, пока работа с ней не будет закончена и она не будет снова стерилизована.

5. Зажмите ватную пробку пробирки между мизинцем и ладонью правой руки (продолжая держать петлю, как указано в шаге 4) и извлеките ее из горлышка пробирки «винтовым» движением правой руки.

6. Введите платиновую петлю в пробирку и удерживайте ее в этом положении, пока не убедитесь, что она полностью остыла. (Остывание можно ускорить, коснувшись петлей одной из капель влаги, которые обычно обнаруживаются сконденсированными на внутренней стороне стеклянной пробирки, или окунув ее в конденсационную воду на дне; в то же время в случае культур на твердых средах следует соблюдать осторожность, чтобы не коснуться ни среды, ни роста.)

7. Возьмите небольшую часть роста, захватив каплю жидкости в случае жидкой культуры или коснувшись петлей поверхности роста, когда культура находится на твердой среде; и извлеките петлю из пробирки, не касаясь снова среды или стеклянных стенок пробирки.

8. Верните ватную пробку в горлышко пробирки.

9. Верните пробирочную культуру в стойку или банку.

10. Тщательно смешайте содержимое петли с каплей воды на предметном стекле 3 на 1 дюйм.

11. Снова стерилизуйте петлю, как указано в шаге 4, и верните ее на подставку.

12. Извлеките покровное стекло из стеклянной капсулы с помощью пинцета для покровных стекол, подержите его мгновение на ребре на куске фильтровальной бумаги, чтобы удалить излишки спирта, затем проведите его через пламя Бунзеновской горелки. Это сжигает остатки спирта, и покровное стекло, таким образом «обожженное», теперь чистое, сухое и стерильное.

13. Опустите покровное стекло, все еще удерживаемое пинцетом, на поверхность капли жидкости на предметном стекле 3 на 1 дюйм, осторожно и аккуратно, чтобы избежать включения пузырьков воздуха.

14. Исследуйте микроскопически (см. ниже).

Во время микроскопического исследования красители и другие реактивы можно вводить под покровное стекло простым методом: поместить каплю реактива в контакт с одним краем покровного стекла и приложить рваный край куска промокательной бумаги к противоположной стороне. Затем можно наблюдать, как реактив течет через поле зрения и вступает в контакт с теми микроорганизмами, которые лежат на его пути.

Нетоксичные основные красители, наиболее часто используемые для прижизненного окрашивания бактерий, — это

Neutral red,}in 0.5 per cent. aqueous solutions.
Quinoleine blue}
Methylene green}
Vesuvin,}

Негативное окрашивание (Бурри). — При этом методе демонстрации внешний вид, представляемый при освещении темного поля (с помощью параболоидного конденсора), близко имитируется, поскольку мельчайшие частицы, бактерии, клетки крови или гноя и т. д. выделяются как ярко-белые или бесцветные тела на темно-серо-коричневом фоне.

Требуемый реактив:

Любые жидкие водостойкие черные чернила для рисования (Chin-chin, Pelican и т. д.). Они готовятся к использованию следующим образом:

Отмерьте и смешайте:

Liquid black ink,25 c.c.
Tincture of iodine1 c.c.

Дайте смеси постоять 24 часа, тщательно центрифугируйте, отпипетируйте надосадочную жидкость в чистую бутылку, а затем добавьте кристалл тимола или одну каплю формалина в качестве консерванта.

Метод. —

1. Стерилизованной петлей нанесите одну каплю жидких чернил близко к одному концу предметного стекла 3 на 1 дюйм.

2. Стерилизованной петлей нанесите каплю жидкой культуры (или эмульсии из твердой культуры) рядом с каплей чернил (рис. 69, a); тщательно смешайте две капли с помощью петли.

3. Стерилизуйте петлю.

4. Крепко держите предметное стекло на столе большим и указательным пальцами левой руки, приложенными к концу, ближайшему к капле жидкости.

5. Возьмите другое чистое предметное стекло 3 на 1 дюйм в правую руку и опустите его короткий конец под углом (под углом около 60°) поперек смешанных чернил и культуры на первом стекле, и позвольте жидкости растечься по стеклу и заполнить угол падения.

6. Сохраняя исходный угол, твердо и равномерно потяните второе стекло вдоль первого к концу, наиболее удаленному от левой руки (рис. 69, b).

7. Бросьте второе стекло в банку с дезинфицирующим средством; дайте первому стеклу высохнуть на воздухе.

Fig. 69.—Spreading negative film.

8. Поместите каплю иммерсионного масла в центр пленки, опустите 1/12-дюймовый объектив в масло и исследуйте микроскопически без использования покровного стекла.

(Пленку чернил можно покрыть длинным покровным стеклом и ксилоловым бальзамом в качестве постоянного препарата.)

(b) Препарат «висячая капля». —

1. Нанесите слой стерильного вазелина на верхнюю поверхность кольцевой ячейки предметного стекла для «висячей капли» с помощью стеклянной палочки, прилагаемой к бутылке с вазелином, и поместите стекло на кусок фильтровальной бумаги.

2. «Обожгите» покровное стекло и поместите его на фильтровальную бумагу рядом с предметным стеклом для «висячей капли».

3. Поместите каплю воды в центр покровного стекла с помощью платиновой петли.

4. Получите небольшое количество материала, который необходимо исследовать, способом, описанным выше (шаги 2–11 на страницах 74–76 должны выполняться полностью и с величайшей точностью всякий раз, когда обрабатывается содержимое пробирки), и смешайте его с каплей воды на покровном стекле.

5. Поднимите покровное стекло кончиками пинцета и быстро переверните его на кольцевую ячейку предметного стекла для «висячей капли» так, чтобы капля жидкости занимала центр кольца. (Тщательно избегайте контакта между каплей жидкости и кольцевой ячейкой или слоем вазелина. Если это произойдет, инфицированное предметное стекло для «висячей капли» и его покровное стекло должны быть брошены в банку с лизолом, а препарат сделан заново.)

6. Плотно прижмите покровное стекло к вазелину на верхней части кольцевой ячейки. (Это распределяет вазелин в тонкий слой и, помимо обеспечения адгезии покровного стекла, герметизирует ячейки и тем самым замедляет испарение.)

7. Исследуйте микроскопически.

Исследование «свежего» препарата или препарата «висячая капля» направлено на определение следующих данных:

1. Природа присутствующих бактерий — например, кокки, бациллы и т. д.

2. Чистота культуры; это можно определить только тогда, когда существуют значительные морфологические различия между присутствующими организмами.

3. Наличие или отсутствие спор; при наличии споры очень хорошо проявляют свою типичную преломляющую способность этим методом.

4. Наличие или отсутствие подвижности. В препарате «висячая капля» практически всегда можно наблюдать ту или иную форму движения, и ее характер должен быть тщательно определен путем отслеживания относительных положений соседних микроорганизмов.

(a) Броуновское или молекулярное движение. Мельчайшие частицы твердого вещества (включая бактерии), будучи взвешенными в жидкости, всегда будут демонстрировать вибрационное движение, затрагивающее все поле, но никогда не изменяющее относительные положения бактерий. (Кокки демонстрируют это движение, но, за исключением Micrococcus agilis, кокки неподвижны.)

(b) Потоковое движение. Это происходит из-за токов, возникающих в «висячей капле» в результате сотрясения препарата или испарения, или из-за того, что покровное стекло не идеально ровное, и хотя относительные положения бактерий могут варьироваться, все же потоковое движение большого количества организмов в каком-то одном направлении обычно будет достаточным для демонстрации природы этого движения.

(c) Локомоторное движение, или истинная подвижность, определяется путем наблюдения за какой-то одной конкретной бациллой, меняющей свое положение в поле зрения независимо от других присутствующих организмов и в направлении, противоположном им.

Когда исследование завершено и работа с препаратом закончена, «свежий препарат» — т. е. предметное стекло с прикрепленным покровным стеклом — должен быть брошен в банку с лизолом. Однако в препарате «висячая капля» инфицировано только покровное стекло, и его можно поднять с кольцевой ячейки с помощью пинцета и бросить в дезинфицирующее средство.

Постоянное окрашивание препарата «висячая капля». — Иногда необходимо зафиксировать и окрасить препарат «висячая капля». Это можно сделать следующим образом:

1. Снимите покровное стекло с ячейки с помощью пинцета.

2. Если капля маленькая, зафиксируйте ее, опустив лицевой стороной вниз, пока она еще влажная, на поверхность раствора Гулланда или раствора сулемы (см. стр. 82) в часовом стекле. Если капля большая, поместите ее лицевой стороной вверх на резиновый коврик, накройте перевернутым часовым стеклом и дайте высохнуть. Затем зафиксируйте ее в растворе спирта и эфира (см. стр. 82).

3. Окуните покровное стекло в стакан с горячей водой, чтобы удалить часть вазелина, прилипшего к нему.

4. Промойте последовательно в спирте, ксилоле, эфире и спирте, чтобы удалить последние следы жира.

5. Промойте в воде.

6. Окрасьте, промойте, высушите и смонтируйте, как для обычного пленочного препарата на покровном стекле (см. стр. 83–85).

2. Убитые, окрашенные. — В этом методе необходимы три отдельных процесса:

"Preparing" and "fixing" the film.

Staining.

Mounting.

Подготовка пленки. —

1. Обожгите покровное стекло и поместите его на кусок фильтровальной бумаги.

2. Поместите каплю воды в центр покровного стекла с помощью платиновой петли.

3. Получите небольшое количество материала для исследования на стерилизованную платиновую петлю (см. стр. 74–76, шаги 2–11) и смешайте его с каплями воды на покровном стекле.

4. Распределите каплю эмульсии равномерно по покровному стеклу в форме квадратной пленки на расстоянии до 1 мм от каждого края покровного стекла.

5. Дайте ей полностью высохнуть на воздухе.

Фиксация. — Зафиксируйте, проведя покровное стекло, удерживаемое пальцами, три или четыре раза через пламя Бунзеновской горелки.

В некоторых случаях (например, когда пленки после окрашивания предназначены для микрометрических наблюдений) почти необходимо фиксировать путем воздействия равномерной температуры 115° C в течение двадцати минут. Это лучше всего делать в тщательно регулируемом сушильном шкафу.

Фиксация также может быть осуществлена путем погружения в какую-либо фиксирующую жидкость, например, одну из следующих:

1. Абсолютный спирт, на пять-пятнадцать минут.

2. Абсолютный спирт и эфир в равных частях, на пять-тридцать минут (например, для крови или молока).

3. Osmic acid, 1 per cent. aqueous solution, for thirty seconds.

4. Сулема, насыщенный водный раствор, на пять минут.

5. Сулема (Ланг), на пять минут. Этот раствор готовится путем растворения:

Sodium chloride  0.75 gramme
Hydrarg. perchloride 12.00 grammes
Acetic acid  5.00 grammes
In distilled water100.00 c.c.
Filter.

6. Раствор Галланда, на пять минут. Этот раствор готовится путем смешивания:

Absolute alcohol25.0 c.c.
Ether25.0 c.c.
Corrosive sublimate, 20 per cent. alcoholic solution 0.4 c.c.

7. Формалин, 10-процентный водный раствор (= 4-процентный водный раствор формальдегида, так как формалин представляет собой 40-процентный раствор газа в воде).

Любой из этих методов фиксации коагулирует альбуминовый материал и обеспечивает идеальное прилипание пленки к покровному стеклу.

Осветление. — Тщательно промойте покровное стекло в проточной воде и приступайте к окрашиванию.

Если пленка была приготовлена из бульона, разжиженного желатина, гноя или других патологических экссудатов, пропитайте пленку после фиксации 2-процентным раствором уксусной кислоты и дайте ей подействовать в течение двух минут.

Промойте спиртом, затем оставьте спирт на покровном стекле на две минуты. (Это «осветлит» фон и даст гораздо более четкую и чистую пленку, чем та, которую можно было бы получить в противном случае.)

Если пленка была приготовлена из крови или окрашенной кровью жидкости, после фиксации обработайте ее 2-процентным раствором уксусной кислоты в течение двух минут. Промойте водой, высушите и приступайте к окрашиванию. (Это удалит гемоглобин и облегчит исследование.)

Окрашивание. —

1. Положите покровное стекло пленкой вверх на резиновый коврик.

2. С помощью капельницы покройте сторону покровного стекла с пленкой выбранным красителем, дайте ему подействовать в течение нескольких минут, затем смойте излишки проточной водой.

Проникающая способность красителей повышается (а) физическими средствами — например, нагреванием красителя; (б) химическими средствами — например, добавлением 5-процентного водного раствора карболовой кислоты; 2-процентных водных растворов едких щелочей; воды, насыщенной анилиновым маслом; 0,5-процентного водного раствора буры.

Наиболее часто используемыми красителями для приготовления мазков на покровных стеклах являются анилиновые красители.

(A) Basic:

(a) Methylene-blue.

(b) Gentian violet.

(c) Fuchsin.

Эти красители хранят в насыщенных спиртовых (90-процентных) растворах, чтобы замедлить их разложение.

Две или три капли спиртового раствора этих красителей на, скажем, 4 мл воды обычно создают достаточно сильный окрашивающий раствор для приготовления мазков на покровных стеклах.

Карболовый метиленовый синий (К.М.С.) и карболовый фуксин (К.Ф.) готовят, покрывая покровное стекло 5-процентным раствором карболовой кислоты и добавляя к нему несколько капель насыщенного спиртового раствора метиленового синего или фуксина соответственно. Для анилинового генцианвиолета (А.Г.В.) краситель добавляют к насыщенному раствору анилинового масла в воде.

(d) Thionine blue.

(e) Bismarck brown.

(f) Neutral red.

(B) Acid:

(a) Eosin, aqueous yellowish.

(b) Safranine.

Эти красители хранят в 1-процентном водном растворе, к которому добавлено 5 процентов спирта в качестве консерванта. Обычно их используют в таком виде.

Некоторые ядерные красители (кармин, гематоксилин) иногда используются, особенно при работе с «срезами».

Обесцвечивание. — После перекрашивания пленки можно обесцветить путем промывания в течение более или менее длительного времени в одном из следующих реагентов, расположенных в порядке возрастания их силы:

1. Вода. 2. Хлороформ. 3. Уксусная кислота, 1 процент. 4. Спирт. 5. Абсолютный спирт, равные части. Уксусная кислота, 1 процент, соляная кислота, 1-процентный водный раствор. Соляная кислота, 1-процентный спиртовой (90-процентный) раствор. 6. Минеральные кислоты: серная кислота, 25-процентный водный раствор. Азотная кислота, 33-процентный водный раствор.

Дополнительное окрашивание. — Используйте цвета, которые будут контрастировать с первым красителем; например,

Vesuvin,}
Neutral red,}for films stained by methylene-blue or Gram's method.
Eosin,}
Fuchsin,}
 
Methylene-blue,}for films stained by fuchsin.
Gentian violet,}

8. Монтирование. —

1. Тщательно промойте пленку в проточной воде.

2. Удалите излишки воды фильтровальной бумагой или более тщательно высушите между двумя слоями промокательной бумаги.

3. Завершите сушку на воздухе или держа покровное стекло пальцами на безопасном расстоянии над пламенем горелки Бунзена.

4. Поместите каплю ксилолового бальзама в центр чистого предметного стекла размером 3 на 1 дюйм, переверните покровное стекло над бальзамом и осторожно опустите его, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха.

Примечание. — Ксилол предпочтительнее хлороформа для растворения канадского бальзама, так как он не обесцвечивает препарат.

Отпечатки (Klatschpraeparat) готовят из изолированных колоний бактерий, чтобы их характерное строение можно было изучить при более сильном увеличении, чем то, которое можно применить к живой культуре. Их готовят из чашечных культур (см. стр. 230) следующим образом.

1. Достаньте чистое покровное стекло из спиртовки стерильным пинцетом и сожгите спирт.

2. Откройте чашку и положите один край покровного стекла на поверхность среды немного в стороне от выбранной колонии. Осторожно опускайте его над колонией, пока оно не примет горизонтальное положение. Избегайте любого бокового движения или попадания пузырьков воздуха.

3. Слегка надавите вертикально на центр покровного стекла кончиками пинцета, чтобы обеспечить идеальный контакт с колонией.

4. Придержите один край покровного стекла пинцетом, пропустите кончик препаровальной иглы под противоположный край и осторожно поднимите покровное стекло; колония прилипнет к нему. Когда оно будет почти вертикально, возьмите покровное стекло пинцетом и снимите его с чашки. Закройте чашку.

5. Положите покровное стекло пленкой вверх на резиновый коврик и накройте его перевернутым часовым стеклом до высыхания.

6. Зафиксируйте путем погружения в одну из фиксирующих жидкостей, упомянутых ранее (см. стр. 82).

7. Осветлите уксусной кислотой и спиртом.

8. Окрасьте и смонтируйте как обычный мазок на покровном стекле, стараясь выполнять все операции промывки с особой осторожностью.

Микроскопическое исследование неокрашенных препаратов. —

1. Установите тубус микроскопа в вертикальное положение.

2. Расположите предметное стекло с висячей каплей на предметном столике микроскопа так, чтобы капля жидкости находилась на оптической оси инструмента, и закрепите ее в этом положении с помощью пружинных зажимов.

3. Используйте объектив 1/6 дюйма, опустите тубус с помощью кремальеры до тех пор, пока передняя линза объектива не окажется почти в контакте с покровным стеклом — то есть значительно ближе его фокусного расстояния. Лучше всего это делать, наклонив голову в сторону от микроскопа так, чтобы глаза находились на уровне предметного столика.

4. Приложите глаз к окуляру и установите плоское зеркало в положение, обеспечивающее наилучшее освещение.

5. Слегка опустите конденсор и уменьшите апертуру ирисовой диафрагмы так, чтобы свет, хотя и равномерный, был тусклым.

6. Поднимите тубус с помощью грубой настройки до тех пор, пока бактерии не появятся в поле зрения; затем сфокусируйте точно с помощью микрометрического винта.

Иногда поначалу возникают трудности с поиском висячей капли, и если первая попытка оказалась неудачной, студент ни в коем случае не должен, не отрывая глаза от окуляра, опускать тубус (ибо при этом велика вероятность того, что передняя линза объектива будет вдавлена в покровное стекло, что не только испортит препарат, но и загрязнит объектив); напротив, следует отвести глаз, поднять тубус и начать снова с шага 2.

Темнопольное освещение. —

1. Установите штатив микроскопа в вертикальное положение и вставьте самый сильный из имеющихся окуляров.

2. Снимите револьверную головку с тубуса микроскопа и установите на место объектив 2/3 дюйма.

3. Снимите конденсор и замените его темнопольным конденсором.

4. Установите источник освещения на расстоянии 30-50 см от микроскопа. (Это должна быть дуговая лампа «Лилипут» (Leitz), лампа Нернста или лампа накаливания; если используются две последние, между светом и микроскопом необходимо поместить конденсор для получения параллельных лучей); отрегулируйте осветитель и микроскоп так, чтобы плоское зеркало конденсора было полностью заполнено светом.

5. Сфокусируйте два концентрических кольца, выгравированных на верхней поверхности конденсора, и точно отцентрируйте их с помощью центрирующих винтов.

6. Подготовьте «свежий» препарат (см. стр. 74-76) материала, который необходимо наблюдать, используя отборные новые предметные стекла 3 на 1 дюйм толщиной менее 1 мм и покровные стекла № 1 (толщиной 0,17 мм), которые следует очистить куском мягкой замши, а не наждачной бумагой, так как царапины на стекле создают мутность в препарате.

7. Нанесите большую каплю иммерсионного масла (или чистой воды) на верхнюю поверхность конденсора и опустите его на несколько миллиметров.

8. Установите свежий препарат на предметный столик микроскопа и закрепите его зажимами.

9. Поднимайте конденсор до тех пор, пока иммерсионная жидкость не войдет в контакт с нижней поверхностью предметного стекла; избегайте образования пузырьков воздуха.

10. Отрегулируйте зеркало конденсора так, чтобы свет отражался вверх. На свежем препарате в центре поля зрения будет видно яркое пятно.

11. Замените объектив 2/3 дюйма на масляно-иммерсионный объектив 1/12 дюйма, оснащенный специальной диафрагмой для уменьшения его числовой апертуры; поместите каплю иммерсионного масла в центр покровных стекол свежего препарата и опускайте тубус микроскопа до тех пор, пока передняя линза объектива не войдет в каплю масла.

12. Сфокусируйтесь на ярком пятне, упомянутом в шаге 10. Если оно больше не занимает центр поля зрения, изменяйте угол наклона зеркала конденсора, пока оно не окажется в центре.

13. Теперь точно сфокусируйте объектив на пленке, осторожно изменяя высоту темнопольного конденсора, пока не будет найдено наилучшее положение. Интенсивно освещенные бактерии будут выделяться ярким контрастом на темном фоне.

Fig. 70.—Immersion oil bottle.

Микроскопическое исследование окрашенного препарата. — (Тубус микроскопа может быть вертикальным или наклоненным под углом.)

1. Закрепите предметное стекло на столике микроскопа с помощью пружинных зажимов.

2. Поместите каплю кедрового масла в центр покровного стекла.

Иммерсионное масло представляет собой чистое кедровое масло и хранится в небольшом флаконе из толстого стекла (рис. 70), полость которого имеет форму перевернутого конуса и снабжена предохранительной воронкой (чтобы масло не вылилось, если флакон случайно опрокинется) и пылезащитным колпачком из самшита, снабженным деревянной палочкой, с помощью которой капля масла наносится на покровное стекло или линзу.

3. Используйте масляно-иммерсионный объектив 1/12 дюйма. Опускайте тубус до тех пор, пока передняя линза объектива не окажется в контакте с маслом и почти не коснется покровного стекла.

4. Поднимите конденсор до тех пор, пока он не войдет в контакт с нижней поверхностью предметного стекла.

5. Приложите глаз к окуляру и установите плоское зеркало так, чтобы получить максимально возможное количество света.

6. Поднимайте тубус до тех пор, пока окрашенная пленка не появится в поле зрения.

7. Точно сфокусируйте конденсор на пленке.

8. Точно сфокусируйте пленку с помощью микрометрического винта.

VI. МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ.

На следующих страницах собраны различные «стандартные» красители, ежедневно используемые в бактериологической лаборатории, а также подборка наиболее удобных и общеприменимых методов окрашивания для демонстрации определенных структур или дифференциации групп бактерий. Используемые красители должны быть либо приготовлены Грюблером из Лейпцига, либо Мерком из Дармштадта. Методы, напечатанные обычным шрифтом, — это те, которые многолетний опыт показал как наиболее надежные и дающие наилучшие результаты; те, что приведены мелким шрифтом, включают методы, которые не столь общеприменимы, но дают отличные результаты в руках опытного работника.

КРАСИТЕЛИ ДЛЯ БАКТЕРИЙ.

Метиленовый синий. —

1. Насыщенный водный раствор.

Отвесьте

Methylene-blue1.5 grammes

Поместите в закупоренную бутыль емкостью от 150 до 200 мл и добавьте

Distilled water100.0 c.c.

Оставьте воду в контакте с красителем на две недели, ежедневно энергично встряхивая содержимое бутыли в течение нескольких минут. Отфильтруйте.

2. Насыщенный спиртовой раствор.

Отвесьте

Methylene-blue1.5 grammes

Поместите в закупоренную бутыль емкостью 150 мл и добавьте

Alcohol, 90 per cent100.0 c.c.

Оставьте спирт в контакте с красителем на два часа, энергично встряхивая каждые несколько минут. Отфильтруйте.

3. Карболовый метиленовый синий (Кюне).

Отвесьте

Methylene-blue1.5 grammes
Carbolic acid5.0 grammes

и растворите в

Distilled water100.0 c.c.

и добавьте

Absolute alcohol10.0 c.c.

Отфильтруйте.

4. Щелочной метиленовый синий (Леффлер).

Отмерьте и смешайте

Methylene-blue, saturated alcoholic solution30.0 c.c.
Caustic potash, 0.1 per cent. aqueous solution100.0 c.c.

Отфильтруйте.

Генцианвиолет. —

5. Насыщенный водный раствор.

Отвесьте

Gentian violet2.25 grammes

и действуйте так же, как при приготовлении соответствующего раствора метиленового синего.

6. Насыщенный спиртовой раствор.

Отвесьте

Gentian violet5.0 grammes

и действуйте так же, как при приготовлении соответствующего раствора метиленового синего.

7. Карболовый генцианвиолет (Николле).

Отмерьте и смешайте

Gentian violet, saturated alcoholic solution10.0 c.c.
Carbolic acid, 1 per cent. aqueous solution100.0 c.c.

Отфильтруйте.

8. Раствор на анилиновой воде (Кох-Эрлих).

Отмерьте

Distilled water100 c.c.

Добавляйте анилиновое масло по каплям (хорошо встряхивая после добавления каждой капли), пока раствор не станет непрозрачным.

Фильтруйте до прозрачности.

и добавьте

Absolute alcohol10 c.c.
Saturated alcoholic solution gentian violet11 c.c.

Отфильтруйте.

Примечание. — Этот раствор не хранится дольше 14 дней.

Тиониновый синий (или фиолетовый Лаута). —

9. Карболовый тиониновый синий (Николле).

Отвесьте

Thionine blue1.0 gramme
Carbolic acid2.5 grammes

и растворите в

Distilled water100.0 c.c.

Отфильтруйте.

Перед использованием разбавьте равным количеством дистиллированной воды и снова отфильтруйте.

Фуксин (основной). —

10. Насыщенный водный раствор.

Отвесьте

Basic fuchsin1.5 grammes

и действуйте так же, как при приготовлении соответствующего раствора метиленового синего (см. выше).

11. Насыщенный спиртовой раствор.

Отвесьте

Basic fuchsin3.5 grammes

и действуйте так же, как при приготовлении соответствующего раствора метиленового синего.

12. Карболовый фуксин (Циль).

Отвесьте

Basic fuchsin1.0 gramme
Carbolic acid5.0 grammes

растворите в

Distilled water100.0 c.c.

и добавьте

Absolute alcohol10.0 c.c.

Отфильтруйте.

КОНТРАСТНЫЕ КРАСИТЕЛИ.

Эозин. — Существует несколько коммерческих разновидностей эозина, которые с бактериологической точки зрения обладают очень разной ценностью. Грюблер перечисляет четыре разновидности, из которых только две полезны для бактериологической работы:

Eosin, aqueous yellowish.

Eosin, aqueous bluish.

13. Eosin Aqueous Solution (Yellowish or Bluish Shade), 1 per cent.

Отвесьте

Eosin, aqueous1.0 gramme

растворите в

Distilled water100.0 c.c.

и добавьте

Absolute alcohol5.0 c.c.

Отфильтруйте.

14. Спиртовой раствор эозина, 0,5 процента.

Отвесьте

Eosin, alcoholic0.5 gramme

и растворите в

Alcohol (70 per cent.)100.0 c.c.

Отфильтруйте.

Сафранин. —

15. Водный раствор.

Отвесьте.

Safranine0.5 gramme

и растворите в

Distilled water100.0 c.c.

Отфильтруйте.

Нейтральный красный. —

16. Водный раствор.

Отвесьте

Neutral red1.0 gramme

и растворите в

Distilled water100.0 c.c.

Отфильтруйте.

Везувин (или коричневый Бисмарк). —

17. Насыщенный водный раствор.

Отвесьте

Vesuvin0.5 gramme

и растворите в

Distilled water100.0 c.c.

Отфильтруйте.

КРАСИТЕЛИ ДЛЯ ТКАНЕЙ.

Анилиновый генцианвиолет (для окраски фибрина по Вейгерту). —

Отвесьте

Gentian violet1.0 gramme

и растворите в

Absolute alcohol15.0 c.c.
Distilled water80.0 c.c.

затем добавьте

Aniline oil3.0 c.c.

Хорошо встряхните и отфильтруйте перед использованием.

Гематоксилин (Эрлих). —

1. Отвесьте

Hæmatoxylin2.0 grammes

и растворите в

Absolute alcohol100.0 c.c.

2. Отвесьте

Ammonium alum2.0 grammes

и растворите в

Distilled water100.0 c.c.

3. Смешайте 1 и 2, дайте смеси постоять сорок восемь часов, затем отфильтруйте.

4. Добавьте

Glycerine85.0 c.c.
Acetic acid, glacial10.0 c.c.

5. Дайте красителю постоять один месяц на свету; затем снова отфильтруйте перед использованием.

Гематин (Майер). —

А. Отвесьте

Hæmatin1.0 gramme

и растворите в

Alcohol 90 per cent. (warmed to 37°C.)50 c.c.

Б. Отвесьте

Potash alum50 grammes

и растворите в

Distilled water100 c.c.

Приготовьте эти два раствора в отдельных колбах. Возьмите чистую колбу емкостью 250 мл и вставьте в ее горлышко большую воронку. Медленно и одновременно влейте растворы А и Б в воронку для тщательного смешивания. Храните для будущего использования.

Примечание. — Если требуется кислый гематин, введите ледяную уксусную кислоту (3 мл) в колбу для смешивания перед добавлением растворов А и Б.

Квасцовый кармин (Майер). —

Отвесьте

Alum2.5 grammes
Carmine1.0 gramme

и поместите в стеклянный стакан.

Отмерьте в мерном цилиндре

Distilled water100.0 c.c.

Поместите стакан на песчаную баню, добавляйте воду небольшими порциями и кипятите смесь в течение двадцати минут. Измерьте объем раствора и доведите его до 100 мл добавлением дистиллированной воды. Отфильтруйте.

Литиевый кармин (Орт). —

Отвесьте

Carmine2.5 grammes

и растворите в

Lithium carbonate, cold saturated solution100.0 c.c.

Отфильтруйте.

Пикрокармин. —

Отвесьте

Picrocarmine2.0 grammes

и растворите в

Distilled water100.0 c.c.

КРАСИТЕЛИ ДЛЯ КРОВИ

При смешивании водных растворов медицинского метиленового синего и водорастворимых эозинов образуется осадок, который растворим только в спирте, и растворы этого осадка придают хроматину своеобразный красновато-пурпурный цвет. Это соединение было впервые использовано Романовским для демонстрации малярийных паразитов, но в настоящее время для окрашивания мазков крови в целом, а также бактерий и простейших, применяются различные модификации. Лучшими модификациями оригинального метода Романовского являются методы Дженнера и Лейшмана — метод Дженнера наиболее подходит для гистологического изучения крови, а метод Лейшмана — для демонстрации простейших.

Краситель Дженнера. —

А. Отвесьте:

Eosin aqueous yellow6.0 grammes

Растворите в

Distilled water (non-alkaline)250 c.c.

Это даст густой раствор.

Б. Отвесьте:

Methylene blue (medicinally pure) Hoechst5.0 grammes

Растворите в

Distilled water (non-alkaline)250 c.c.

1. Добавляйте Б к А очень медленно, постоянно помешивая. Образуется вязкий осадок, который часто теряет свою вязкость при нагревании. (Это объясняет необходимость медленного смешивания).

2. Медленно выпаривайте в фарфоровой чашке, периодически помешивая, на водяной бане при 55° C. Когда начнет образовываться паста, периодически соскребайте и разбивайте ее. (Ни в коем случае нельзя допускать плавления пасты.)

3. Разотрите полученную массу в аморфный порошок.

4. Отвесьте:

Amorphous powder0.5 grammes

Растворите в

Methylic alcohol (Merck's puriss, for analysis)100 c.c.

Дайте время для полного растворения. (Достаточно около трех дней.)

Метод. —

1. Приготовьте мазок, высушите, но не фиксируйте.

2. Залейте нефиксированный мазок красителем, дайте ему подействовать в течение 3 минут (метиловый спирт в красителе фиксирует мазок).

3. Слейте краситель и промойте в дистиллированной воде, пока мазок не приобретет розовый цвет.

4. Высушите и смонтируйте.

Краситель Лейшмана. —

А. Отвесьте:

Methylene blue (medicinal)1 gramme

Растворите в

Sodium carbonate, 0.5 per cent. aqueous solution100 c.c.

Выдерживайте при 65° C в течение 12 часов в горячем термостате или на водяной бане; затем оставьте в темном месте при комнатной температуре (20° C) на десять дней.

Б. Отвесьте:

Eosin, extra B. A.0.1 gramme

Растворите в

Distilled water100 c.c.

1. Смешайте два раствора А и Б в равных объемах и дайте смеси постоять 12 часов, периодически помешивая.

2. Отфильтруйте и соберите осадок на фильтровальной бумаге.

3. Тщательно промойте осадок дистиллированной водой и высушите.

4. Отвесьте 0,15 грамма высушенного осадка; разотрите в ступке с 5 мл метилового спирта (Merck's puriss, для анализа).

Дайте нерастворенному порошку осесть, затем слейте надосадочную жидкость в чистый мерный цилиндр емкостью 100 мл.

5. Добавьте еще 5 мл спирта к осадку в ступке и повторите процесс, и так далее, пока весь осадок не растворится.

6. Теперь доведите объем жидкости в мерном цилиндре до 100 мл добавлением метилового спирта.

Метод. —

1. Приготовьте мазок, высушите, но не фиксируйте.

2. Залейте нефиксированный мазок красителем, дайте ему подействовать 30 секунд.

3. Добавьте к красителю на мазке двойной объем дистиллированной воды и перемешайте стеклянной палочкой или платиновой петлей.

4. Дайте этому разбавленному красителю подействовать пять минут.

5. Смойте дистиллированной водой.

6. Оставьте немного воды на мазке на тридцать секунд для усиления цветовых контрастов.

7. Высушите и смонтируйте.

МЕТОДЫ ДЕМОНСТРАЦИИ СТРУКТУРЫ БАКТЕРИЙ И Т. Д.

Для демонстрации капсул.

1. МакКонки. —

Краситель. —

Отвесьте

Dahlia0.5 gramme
Methyl green (00 crystals)1.5 grammes

разотрите в ступке с

Distilled water100.0 c.c.

Добавьте

Fuchsin, saturated alcoholic solution10.0 c.c.

и доведите до 200 мл добавлением

Distilled water90.0 c.c.

Отфильтруйте.

Дайте красителю постоять две недели перед использованием; храните в темном месте или в бутыли из янтарного стекла. Из-за нестабильного характера метилового зеленого этот краситель портится примерно через шесть месяцев.

Метод. —

1. Приготовьте и зафиксируйте мазок обычным способом.

2. Залейте покровное стекло красителем и дайте ему подействовать от пяти до десяти минут.

3. Очень тщательно промойте водой; при необходимости направьте на мазок сильную струю воды из промывалки.

4. Высушите и смонтируйте.

2. Метод Мьюира. —

1. Приготовьте, высушите и зафиксируйте мазок обычным способом.

2. Залейте мазок карболовым фуксином, нагрейте до появления пара. Дайте красителю подействовать в течение тридцати секунд.

3. Быстро промойте метилированным спиртом.

4. Тщательно промойте водой.

5. Подвергните мазок воздействию следующего протравителя в течение пяти секунд:

Corrosive sublimate, saturated aqueous solution2 c.c.
Tannic acid, 20 per cent. aqueous solution2 c.c.
Potash alum saturated aqueous solution5 c.c.

6. Тщательно промойте водой.

7. Обработайте метилированным спиртом в течение примерно шестидесяти секунд. (Препарат должен стать бледно-красным.)

8. Тщательно промойте водой.

9. Дополнительно окрасьте метиленовым синим, водным раствором в течение тридцати секунд.

10. Промойте водой.

11. Обезводьте в спирте.

12. Осветлите в ксилоле и смонтируйте в ксилоловом бальзаме.

3. Метод Уэлча. —

1. Приготовьте и зафиксируйте мазок обычным способом.

2. Залейте предметное стекло 2-процентным раствором уксусной кислоты; оставьте кислоту в контакте с мазком на две минуты. Это разбухает и фиксирует капсулу и позволяет ей окраситься.

3. Сдуйте уксусную кислоту с помощью пипетки.

4. Погрузите в анилиновый генцианвиолет на пять-тридцать секунд.

5. Промойте водой.

6. Высушите и смонтируйте.

4. Метод Рибберта. —

Краситель. —

Отмерьте и смешайте:

Acetic acid, glacial12.5 c.c.
Alcohol, absolute50.0 c.c.
Distilled water100.0 c.c.

Нагрейте до 36° C (например, в «горячем» термостате) и насытьте далией. Отфильтруйте.

Метод. —

1. Приготовьте и зафиксируйте мазки обычным способом.

2. Покройте мазок красителем и дайте ему подействовать всего одну или две секунды.

3. Тщательно промойте водой.

4. Высушите и смонтируйте.

Для демонстрации жгутиков.

1. Модифицированный метод Питфилда по Мьюиру. — Это лучший метод, дающий наиболее надежные результаты, поскольку не только процент успешных препаратов выше, чем при любом другом, но и бациллы и жгутики сохраняют свои относительные пропорции.

(а) Протравитель. —

Tannic acid, 10 per cent. aqueous solution10 c.c.
Corrosive sublimate, saturated aqueous solution5 c.c.
Alum, saturated aqueous solution5 c.c.
Carbolic fuchsin (Ziehl)5 c.c.

Тщательно смешайте.

Образуется осадок, которому нужно дать отстояться несколько часов.

Слейте прозрачную жидкость в пробирки и тщательно центрифугируйте.

Этот раствор лучше всего использовать через четыре-пять дней после приготовления; он хранится около пары недель, но перед каждым использованием его необходимо повторно центрифугировать.

(б) Краситель. —

Alum, saturated aqueous solution25 c.c.
Gentian violet, saturated alcoholic solution5 c.c.

Отфильтруйте.

Этот краситель должен быть свежеприготовленным.

Метод. — Используемые культуры должны быть мазками агаровых культур, двенадцати-восемнадцатичасовыми, если инкубировались при 37° C, и двадцатичетырех-тридцатичасовыми, если инкубировались при 22° C.

1. Возьмите очень небольшое количество культуры с помощью платиновой лопаточки.

2. Эмульгируйте ее в нескольких кубических сантиметрах дистиллированной воды на часовом стекле, осторожно перемещая лопаточку туда-сюда в воде. Не растирайте культуру о стенку часового стекла. Некоторые работники предпочитают использовать водопроводную воду, другие применяют нормальный физиологический раствор, но дистиллированная вода дает лучшую эмульсию.

3. Распределите тонкую пленку эмульсии на предварительно прокаленном покровном стекле, не применяя силы, а скорее «направляя» каплю по покровному стеклу платиновой петлей.

4. Дайте пленке высохнуть на воздухе, должным образом защитив ее от падающей пыли.

5. Зафиксируйте, трижды проведя через пламя горелки Бунзена, удерживая покровное стекло за один угол между пальцами.

6. Налейте на пленку столько протравителя, сколько может удержать покровное стекло. Возьмите покровное стекло пинцетом и держите его высоко над пламенем, пока не пойдет пар. Оставьте дымящийся протравитель в контакте с пленкой на две минуты.

7. Хорошо промойте водой и тщательно высушите.

8. Налейте на пленку столько красителя, сколько может удержать покровное стекло. Пропарьте над пламенем, как и раньше, в течение двух минут.

9. Хорошо промойте водой.

10. Высушите и смонтируйте.

2. Оригинальный метод «Питфилда». —

(а) Протравитель. —

Tannic acid1 gramme
Water10 c.c.

(б) Краситель. —

Saturated aqueous solution of alum10 c.c.
Saturated alcoholic solution of gentian violet1 c.c.
Distilled water5 c.c.

Перед использованием смешайте равные части а и б.

1. Приготовьте и зафиксируйте пленку способом, описанным выше.

2. Прокипятите смесь и погрузите в нее покровное стекло, пока она еще горячая, на одну минуту.

3. Промойте водой.

4. Исследуйте в воде; если результат удовлетворительный, высушите и смонтируйте в канадском бальзаме.

3. Метод МакКрори. —

Протравитель-краситель. —

Отмерьте и смешайте.

Night blue, saturated alcoholic solution10 c.c.
Potash alum, saturated aqueous solution10 c.c.
Tannin, 10 per cent. aqueous solution10 c.c.

Примечание. — Добавление галловой кислоты, 0,1-0,2 грамма, может улучшить раствор, но не является обязательным.

Метод. —

1. Приготовьте и зафиксируйте пленки, как указано выше.

2. Налейте немного протравителя-красителя на пленку и осторожно нагрейте высоко над пламенем в течение двух минут (или поместите в «горячий» термостат на такой же период).

3. Тщательно промойте водой.

4. Высушите и смонтируйте.

4. Метод Леффлера. —

(а) Протравитель. —

Tannic acid, 20 per cent. aqueous solution10 c.c.
Ferrous sulphate, saturated aqueous solution5 c.c.
Hæmatoxylin solution3 c.c.
Carbolic acid, 1 per cent. aqueous solution4 c.c.

Этот раствор должен быть свежеприготовленным.

Раствор гематоксилина готовится путем кипячения 1 грамма кампешевого дерева

с 8 мл дистиллированной воды, фильтрования и восполнения потери от испарения.

Альтернативный протравитель (протравитель Бунге). —

Tannic acid, 20 per cent. aqueous solution10 c.c.
Ferrous sulphate, saturated aqueous solution5 c.c.
Fuchsin, saturated alcoholic solution1 c.c.

(б) Краситель. —

Отвесьте

Methylene-blue}
Or methylene-violet} 4 grammes
Or fuchsin}

и растворите в

Aniline water, freshly saturated and filtered100 c.c.

Метод. —

1. Приготовьте и зафиксируйте пленки, как указано выше.

2. Налейте протравитель на пленку и осторожно нагрейте над пламенем до появления пара; поддерживайте протравитель в состоянии легкого парения в течение одной минуты.

3. Хорошо промойте дистиллированной водой, пока не перестанет вымываться цвет; при необходимости осторожно промойте абсолютным спиртом.

4. Отфильтруйте несколько капель красителя на пленку, нагрейте, как и раньше, и дайте дымящемуся красителю подействовать в течение одной минуты.

5. Хорошо промойте дистиллированной водой.

6. Высушите и смонтируйте.

Примечание. — Жгутики некоторых организмов можно лучше продемонстрировать с помощью щелочного или кислого красителя — этот момент определяется для каждого случая. Вообще говоря, те бациллы, которые вызывают кислую реакцию в питательной среде, требуют щелочи; те, которые образуют щелочь при культивировании, требуют кислоты. Поэтому, в зависимости от требований, Леффлер рекомендует добавление 1 мл 1-процентного водного раствора гидрата натрия или равного количества точно такого же раствора серной кислоты.

5. Метод Ван Эрменгема. — Этот метод, будучи лишь осаждением соли серебра на микроорганизмы, а не истинным окрашиванием, создает ложное впечатление об относительных пропорциях бактерий и жгутиков.

(а) Фиксирующая жидкость. —

Osmic acid, 2 per cent. aqueous solution10 c.c.
Tannic acid, 20 per cent. aqueous solution20 c.c.
Acetic acid, glacial1 c.c.

Фиксирующую жидкость следует приготовить за несколько дней до использования и отфильтровать по мере необходимости. По цвету она должна быть отчетливо фиолетовой.

(б) Сенсибилизирующий раствор. —

Нитрат серебра, 0,5-процентный водный раствор.

Этот раствор необходимо хранить в бутыли из темно-синего стекла или в темном шкафу.

Отфильтруйте непосредственно перед использованием.

(в) Восстанавливающий раствор. —

Отвесьте

Gallic acid5 grammes
Tannic acid3 grammes
Potassium acetate, fused10 grammes

и растворите в

Distilled water350 c.c.

Отфильтруйте.

Этот раствор сохраняет активность в течение нескольких дней, но для каждого препарата необходимо использовать свежий раствор.

Метод. —

1. Приготовьте эмульсию, сделайте и зафиксируйте пленки, как указано выше в предыдущем методе, шаги 1-4.

2. Налейте на пленку столько фиксирующего раствора, сколько может удержать покровное стекло, осторожно нагрейте над пламенем до появления пара и дайте дымящейся фиксирующей жидкости подействовать в течение пяти минут.

3. Хорошо промойте водой.

4. Промойте абсолютным спиртом.

5. Промойте дистиллированной водой.

6. Налейте немного сенсибилизирующего раствора на пленку и дайте ему подействовать от тридцати секунд до одной минуты; удалите излишки жидкости фильтровальной бумагой.

7. Не промывая, перенесите пленку на часовое стекло, содержащее восстанавливающий раствор, и оставьте ее там на время от тридцати секунд до одной минуты; удалите излишки жидкости фильтровальной бумагой.

8. Не промывая, снова обработайте пленку сенсибилизирующим раствором, на этот раз до тех пор, пока пленка не начнет чернеть.

9. Промойте дистиллированной водой.

10. Высушите и смонтируйте.

Для окрашивания ядер дрожжевых клеток.

1. Приготовьте и зафиксируйте пленку обычным способом.

2. Выдержите в 3-процентном водном растворе железоаммонийных квасцов в течение двух часов.

3. Тщательно промойте водой.

4. Окрасьте раствором гематоксилина (см. стр. 95) в течение тридцати минут.

5. Промойте водой.

6. Дифференцируйте в растворе железоаммонийных квасцов в течение 1,5-2 минут, исследуя влажный препарат под микроскопом во время процесса.

Для окрашивания спор.

1. Однократное окрашивание. —

1. Приготовьте мазок на покровном стекле обычным способом.

2. При фиксации проведите мазок на покровном стекле пятнадцать или тридцать раз через пламя вместо трех. Это разрушает сопротивляемость оболочки споры и позволяет красителю проникнуть внутрь.

3. Окрасьте обычным способом метиленовым синим или фуксином.

4. Промойте водой.

5. Высушите и смонтируйте.

2. Двойное окрашивание. —

1. Приготовьте и зафиксируйте пленку обычным способом — то есть проведите три раза через пламя для фиксации.

2. Покройте пленку горячим карболовым фуксином и подержите пинцетом над небольшим пламенем, пока жидкость не начнет дымиться. Положите покровное стекло и дайте ему остыть. Повторяйте процесс, когда краситель перестанет дымиться, и продолжайте повторять до тех пор, пока краситель не будет находиться в контакте с пленкой в течение двадцати минут. (Это окрашивает как споры, так и бактерии.)

3. Промойте водой.

4. Обесцветьте в спирте (2 части) и 1-процентном растворе уксусной кислоты (1 часть). (Это удаляет краситель со всего, кроме спор.)

5. Промойте водой.

6. Смонтируйте покровное стекло в воде и исследуйте микроскопически с объективом 1/6 дюйма. (Споры должны быть красными, а остальная часть пленки — бесцветной или очень светло-розовой.) Если результат удовлетворительный, переходите к разделу 7; если неудовлетворительный, повторите шаги 2-5.

7. Дополнительно окрасьте слабым метиленовым синим. (Теперь споры красные, бациллы синие.)

8. Промойте водой.

9. Высушите и смонтируйте.

Споры разных бацилл сильно различаются по своей устойчивости к обесцвечивающим реагентам; даже споры одного и того же вида организмов варьируются в зависимости от их возраста. Молодые споры обесцвечиваются легче, чем более зрелые.

Серная кислота, 1-процентный водный раствор, и соляная кислота, 0,5-процентный спиртовой (90-процентный) раствор, являются полезными обесцвечивающими реагентами.

3. Метод Мёллера.

1. Приготовьте и зафиксируйте мазки обычным способом.

2. Поместите в абсолютный спирт на две минуты, затем в хлороформ на две минуты; промойте водой. Это растворяет жир или кристаллы, которые в противном случае могли бы удерживать «споровый» краситель.

3. Immerse in chromic acid, 5 per cent. aqueous solution,
for one minute; wash in water.

4. Налейте на мазок карболовый фуксин Циля, подогрейте, как в предыдущих методах, и оставьте действовать на десять минут.

5. Промойте водой.

6. Decolourise in sulphuric acid, 5 per cent. aqueous
solution, for five seconds.

7. Промойте водой.

8. Проведите докрашивание карболовым метиленовым синим Кюне в течение одной или двух минут.

9. Промойте водой.

10. Высушите и заключите в среду.

(Споры красные, бациллы синие.)

4. Метод Эбботта.

1. Приготовьте и зафиксируйте мазки обычным способом.

2. Налейте на мазок щелочной метиленовый синий Леффлера; осторожно подогрейте над пламенем до появления пара и дайте горячему пару воздействовать в течение одной-пяти минут.

3. Тщательно промойте водой.

4. Decolourise in nitric acid, 2 per cent. alcoholic
(alcohol 80 per cent.) solution.

5. Тщательно промойте водой.

6. Counterstain in eosin, 1 per cent. aqueous solution.

7. Промойте.

8. Высушите и заключите в среду.

(Споры синие, бациллы красные.)

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ.

Метод Грама. — Этот метод основан на том факте, что протоплазма некоторых бактерий при последовательном воздействии анилинового генцианвиолета и раствора Люголя вступает в химическую реакцию, приводящую к образованию нового сине-черного пигмента, который лишь очень слабо растворим в абсолютном спирте. Такие организмы называют «окрашивающимися по Граму» или «грамположительными».

1. Приготовьте мазок на покровном стекле и зафиксируйте обычным способом.

2. Окрашивайте анилиновым генцианвиолетом от трех до пяти минут. Отфильтруйте на покровное стекло столько анилиновой воды, сколько оно может удержать; затем добавьте минимальное количество спиртового раствора генцианвиолета, достаточное для насыщения анилиновой воды и образования «бронзовой пленки» на ее поверхности — если добавить слишком много спиртового генцианвиолета, присутствующий спирт растворит эту пленку.

Для приготовления анилиновой воды налейте 4 или 5 куб. см анилинового масла в бутыль с притертой пробкой и добавьте 100 куб. см дистиллированной воды. Энергично встряхните и отфильтруйте непосредственно перед использованием. Избыток масла оседает на дно бутыли и может быть использован повторно.

3. Промойте водой.

4. Обрабатывайте раствором Люголя, пока мазок не станет черным или темно-коричневым.

Для этого обработайте раствором йода в течение нескольких секунд, промойте водой и осмотрите мазок над листом белой фильтровальной бумаги. Отметьте цвет. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока мазок не перестанет темнеть при свежем нанесении раствора йода.

Раствор Люголя готовят путем растворения

Iodine1 gramme
Iodide of potassium3 grammes
In distilled water300 c.c.

5. Промойте водой.

6. Промывайте спиртом до тех пор, пока краситель не перестанет вымываться, а спирт не будет стекать чистым и бесцветным.

В качестве обесцвечивающего агента вместо абсолютного спирта можно использовать следующую смесь

Acetone10 c.c.
Absolute alcohol100 c.c.

7. Промойте водой.

8. Проведите очень легкое докрашивание водным раствором нейтрального красного. Можно использовать и другие красители для докрашивания, такие как разбавленный эозин, разбавленный фуксин или везувин.

Примечание. — Этот этап можно пропустить при работе с мазками, приготовленными из чистых культур.

9. Промойте водой.

10. Высушите и заключите в среду.

Метод Грама-Клаудиуса. —

1. Приготовьте мазок на покровном стекле и зафиксируйте обычным способом.

2. Stain in methyl violet, 1 per cent. aqueous solution for three to
five minutes.

3. Обработайте двумя порциями насыщенного водного раствора пикриновой кислоты.

4. Промойте водой и высушите.

5. Обесцветьте маслом гвоздики.

6. Смойте масло гвоздики ксилолом.

7. Заключите в ксилоловый бальзам.

Метод Грама-Вейгерта. —

1-5. Действуйте так же, как для соответствующих этапов метода Грама (см.).

6. Высушите на воздухе.

7. Wash in aniline oil, 1 part, xylol, 2 parts, until no more colour is
discharged.

8. Промойте в ксилоле.

9. Заключите в ксилоловый бальзам.

Модифицированный метод Грама-Вейгерта. — (Для обнаружения трихофитии в волосах.)

1. Выдержите волосы в эфире в течение десяти минут для удаления жира.

2. Окрашивайте тридцать минут в дегтеподобном растворе анилинового генцианвиолета (приготовленном путем добавления 15 капель спиртового раствора генцианвиолета к 3 каплям анилиновой воды).

3. Высушите волосы между листами промокательной бумаги.

4. Обработайте совершенно свежим раствором йода.

5. Снова высушите между листами промокательной бумаги.

6. Обработайте анилиновым маслом для удаления избытка красителя. (При необходимости добавьте каплю или две азотной кислоты к маслу.)

7. Снова обработайте анилиновым маслом.

8. Обработайте смесью анилинового масла и ксилола в равных частях.

9. Просветлите ксилолом.

10. Заключите в ксилоловый бальзам.

Для получения наилучшей дифференцировки препарат следует неоднократно исследовать под микроскопом (с объективом 1/6 дюйма) между этапами 5 и 9, так как фактическое время зависит от конкретных образцов.

Метод Циля-Нильсена. — (Для обнаружения туберкулезных и других кислотоустойчивых бацилл.)

1. Нанесите тонкий ровный мазок образца на покровное стекло с помощью платиновой петли. (В случае мокроты, если образец очень жидкий, дайте мазку высохнуть, затем нанесите второй и даже третий слой поверх первого.)

2. Зафиксируйте, трижды проведя через пламя.

3. Окрашивайте в горячем карболовом фуксине (как при окрашивании на споры) в течение пяти-десяти минут. (Это окрашивает все на мазке.) Избегайте перегрева.

4. Обесцветьте, погрузив в 25-процентный раствор серной кислоты. (Это удаляет краситель со всего, кроме кислотоустойчивых бацилл; например, бацилл туберкулеза, проказы и смегмы, при этом мазок становится желтым.)

5. Промойте водой. (Мазок приобретает бледно-красный цвет).

6. Промывайте спиртом до тех пор, пока краситель не перестанет вымываться. (Это часто, но не всегда, удаляет краситель из кислотоустойчивых бацилл, отличных от туберкулезных; например, бациллы смегмы.)

7. Промойте водой.

8. Проведите докрашивание слабым раствором метиленового синего. (Окрашивает некислотоустойчивые бациллы, лейкоциты, эпителиальные клетки и т. д.)

9. Промойте водой, высушите и заключите в среду.

Метод Паппенгейма. —

Этот метод предназначен для дифференциации B. tuberculosis и других кислотоустойчивых микроорганизмов.

1. Приготовьте и зафиксируйте мазок обычным способом.

2. Окрашивайте карболовым фуксином без нагревания в течение трех минут.

3. Не промывая предварительно водой, обработайте мазок тремя или четырьмя последовательными порциями раствора кораллина (розоловой кислоты).

Corallin1 gramme
Methylene-blue (saturated alcoholic solution)100 c.c.
Glycerine20 c.c.

4. Промойте водой.

5. Высушите и заключите в среду.

Метод Нейссера — модифицированный. — (Для обнаружения дифтероидных бацилл.)

Краситель I. —

Отмерьте и смешайте

Methylene-blue, saturated alcoholic solution4.0 c.c.
Acetic acid, 5 per cent. aqueous solution96.0 c.c.

Отфильтруйте.

Краситель II. —

Отвесьте

Neutral red2.5 grammes

и растворите в

Distilled water1000 c.c.

Отфильтруйте.

Метод. —

1. Приготовьте и зафиксируйте мазки обычным способом.

2. Налейте краситель I на мазок и оставьте действовать на две минуты.

3. Тщательно промойте водой.

4. Обработайте раствором Люголя в течение десяти секунд.

5. Тщательно промойте водой.

6. Налейте краситель II на мазок и оставьте действовать на тридцать секунд.

7. Тщательно промойте водой.

8. Высушите и заключите в среду.

Примечание. — Культура, из которой приготовлены мазки, должна быть выращена на сыворотке крови, инкубированной при 37°C в течение девяти-восемнадцати часов.

Бациллы окрашиваются в светло-красный цвет нейтральным красным, что хорошо контрастирует с двумя или тремя черными пятнами, расположенными на полюсах и иногда одним в центре, представляющими собой протоплазматические агрегаты (? метахроматические гранулы), окрашенные кислым метиленовым синим.

Метод Уила и Чоуна (Оксфорд). — (Для обнаружения актиномицетов.)

1. Окрашивайте кратковременно гематоксилином Эрлиха (пока ядра не станут бледно-голубыми после промывки водопроводной водой).

2. Промойте водопроводной водой.

3. Окрашивайте в горячем карболовом фуксине (как для туберкулезных бацилл) в течение пяти-десяти минут.

4. Промойте водопроводной водой.

5. Обесцветьте спиртовым раствором пикриновой кислоты Спенглера. Его готовят путем смешивания:

Alcohol, absolute20 c.c.
Picric acid, saturated aqueous solution10 c.c.
Distilled water10 c.c.

В процессе выполнения этапов 1-5 препарат необходимо неоднократно исследовать под микроскопом с объективом 1/6 дюйма.

При правильной дифференцировке «клубки» выглядят ярко-красными на зеленоватом фоне.

6. Обезводьте в спирте.

7. Просветлите в ксилоле.

8. Заключите в ксилоловый бальзам.

Этот метод одинаково хорошо подходит как для мазков, так и для срезов.

VII. МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ В ТКАНЯХ.

Для бактериологических целей срезы тканей наиболее удобно готовить либо методом замораживания, либо парафиновым методом.

Последний определенно предпочтительнее, но поскольку обнаружение бактерий, если они присутствуют, важнее, чем сохранение элементов ткани в неизменном виде, «замороженные» срезы часто бывают полезны.

Какой бы метод ни был выбран, необходимо брать небольшие кусочки ткани для изготовления срезов — по возможности кубики размером 2-5 мм, но в любом случае не толще половины сантиметра. Посмертный материал следует получать как можно скорее после смерти животного.

Ткань подготавливают к резке путем —

(а) Фиксации; то есть путем умерщвления клеточных элементов таким образом, чтобы они сохранили свою характерную форму и вид.

Фиксирующие жидкости, используемые в общей практике: абсолютный спирт; насыщенный водный раствор сулемы; сулема, раствор Ланга (см. стр. 82); 4-процентный водный раствор формальдегида. (Из них сулемовый раствор Ланга является, безусловно, лучшим универсальным «фиксатором».)

(б) Уплотнения; то есть придания ткани достаточной консистенции, чтобы можно было нарезать из нее тонкие пластинки или «срезы». Это достигается последовательным проведением ткани через спирты постепенно возрастающей концентрации: 30-процентный спирт, 50-процентный спирт, 75-процентный спирт, 90-процентный спирт, абсолютный спирт.

В обоих этих процессах всегда следует использовать большой избыток жидкости.

МЕТОД ЗАМОРАЖИВАНИЯ.

1. Фиксация. Поместите кусочки ткани в стеклянную бутыль с широким горлышком и залейте абсолютным спиртом. Оставьте ткани в нем на двадцать четыре часа.

2. Уплотнение. Слейте спирт (уже не абсолютный, так как он вобрал воду из тканей) из бутыли и замените его свежим абсолютным спиртом. Оставьте ткани в нем на двадцать четыре часа.

Fig. 71.—Washing tissues.

Примечание. — Если ткани не нужны для резки немедленно, их можно хранить в 75-процентном спирте.

3. Удалите спирт из тканей путем вымачивания в воде в течение одного-двух часов. Снимите пробку с бутыли; установите стеклянную воронку в открытое горлышко и поместите под струю проточной воды. Вода, конечно, переливается через край, но ткани остаются в бутыли (Рис. 71).

4. Пропитайте ткани муцилагом в течение двенадцати-двадцати четырех часов, в зависимости от размера. Перенесите кусочки ткани в бутыль, содержащую стерилизованную смесь камеди.

Формула. —

Gum arabic5 grammes
Saccharose1 gramme
Boric acid1 gramme
Water100 c.c.

5. Поместите ткань на столик замораживающего микротома (лучшей формой является, пожалуй, микротом Кэткарта), накройте и окружите свежей смесью камеди; заморозьте эфиром или, что предпочтительнее, углекислым газом, и сделайте срезы.

6. Снимите срезы с ножа в стеклянную чашку с теплой водой и оставьте их там примерно на час, чтобы растворить камедь.

(Если они не нужны сразу, храните в 90-процентном спирте.)

7. Перенесите в стеклянную капсулу с выбранным красителем с помощью расправителя срезов.

8. Перенесите срезы по очереди в капсулу с абсолютным спиртом (для обезвоживания) и в капсулу с ксилолом или маслом гвоздики (для просветления).

9. Заключите в ксилоловый бальзам.

Альтернативный быстрый метод. —

1. Нарежьте очень маленькие блоки ткани.

2. Зафиксируйте в 10-процентном водном растворе формалина (фиксирующая жидкость № 7, стр. 82) в течение 24 часов.

3. Перенесите блок на столик замораживающего микротома и заморозьте парами углекислого газа.

4. Снимите срезы с ножа в стеклянную чашку с теплой водой.

5. Окрасьте срезы в стеклянных капсулах с выбранными красителями.

6. Поместите окрашенный срез в чашку с чистой водой и введите предметное стекло косо под срез; с помощью препаровальной иглы натяните срез на стекло и удерживайте его там; осторожно выньте стекло из воды, следя за тем, чтобы любые складки на срезе расправились до того, как стекло будет окончательно извлечено из воды.

7. Слейте как можно больше воды со среза. Капните абсолютный спирт на срез из капельницы, чтобы обезводить его.

8. Сложите кусок промокательной бумаги вдвое и осторожно прижмите его к срезу, чтобы высушить.

9. Капните ксилол для просветления среза.

10. Нанесите большую каплю ксилолового бальзама на срез и осторожно опустите покровное стекло на бальзам.

ПАРАФИНОВЫЙ МЕТОД.

1. Фиксация. Поместите кусочки ткани, лежащие на вате, в стеклянную бутыль с широким горлышком. Налейте достаточное количество сулемовой фиксирующей жидкости; оставьте ткань в ней на двенадцать-двадцать четыре часа в зависимости от размера.

2. Слейте фиксирующую жидкость и тщательно промойте в проточной воде в течение двадцати минут-получаса, чтобы удалить избыток сулемы.

Fig. 72.—L-shaped brass moulds.

Fig. 73.—Paraffin kettle.

3. Уплотнение. Помещайте ткани по очереди в каждую из следующих концентраций спирта на двенадцать-двадцать четыре часа: 50-процентный, 75-процентный, 90-процентный, абсолютный.

4. Обезвоживание осуществляется путем переноса тканей в свежий абсолютный спирт.

5. Просветление. Наполните бутыль с широким горлышком хлороформом наполовину. На поверхность хлороформа налейте слой абсолютного спирта глубиной около пяти-десяти миллиметров. Поместите кусочки ткани в слой спирта, и когда они пройдут сквозь этот слой, перенесите их в чистый хлороформ на шесть-двадцать четыре часа в зависимости от размера кусочков. При «просветлении» ткань становится более или менее прозрачной.

6. Пропитывание. Поместите просветленные ткани в свежий хлороформ с несколькими кусочками парафина и поставьте в теплое место, например, на верхнюю часть теплого инкубатора. Тепло постепенно расплавляет парафин, и ткани должны оставаться в смеси около двадцати четырех часов.

7. Перенесите ткани в сосуд с чистым расплавленным парафином. Поместите этот сосуд в парафиновую водяную баню, отрегулированную на 2° C выше температуры плавления используемого парафина, и оставьте ткани пропитываться в течение четырех-шести часов для обеспечения полной пропитки. Используемый парафин должен иметь температуру плавления не выше 58° C. Для всех обычных целей вполне достаточно 54° C.

8. Залейте в свежий парафин в металлической (или бумажной) форме.

(а) Расположите пару L-образных металлических деталей на стеклянной пластине, чтобы сформировать прямоугольный желоб (Рис. 72).

(б) Налейте свежий расплавленный парафин в форму из специального сосуда (Рис. 73).

(в) Извлеките кусочек ткани из парафиновой бани и расположите его в форме.

(г) Слегка подуйте на поверхность парафина в форме, и как только образуется пленка твердого парафина, осторожно поднимите стеклянную пластину, на которой установлена форма, и опустите пластину вместе с формой в таз с холодной водой.

(д) Когда блок остынет, отломите металлические L-образные детали; обрежьте излишки парафина вокруг ткани ножом, стараясь сохранить прямоугольную форму, и храните блок в коробочке для таблеток.

Когда необходимо залить несколько кусочков ткани одновременно, чрезвычайно полезными окажутся формы из прочной меди размером 10 см, 5 см и 2,5 см соответственно и глубиной 0,75 см (Рис. 74). Установленные на стеклянные пластины, они заменяют пару L-образных деталей в вышеописанном процессе. Когда парафин окончательно застынет, винт «а» следует ослабить, чтобы позволить двум половинам фланца «b» слегка разойтись — это облегчает извлечение парафинового блока.

Fig. 74.—Paraffin mould.

8. Приклейте блок к держателю «парафинового» микротома (Minot, Jung или Cambridge Rocker) с помощью небольшого количества расплавленного парафина. Большая надежность достигается, если парафин вокруг основания блока расплавить с помощью горячего металлического или стеклянного стержня.

9. Нарежьте срезы — тонкие и, по возможности, в виде лент.

Монтаж парафиновых срезов. —

1. Поместите большую каплю 30-процентного спирта в центр предметного стекла (или покровного стекла) и с помощью расправителя срезов перенесите срез на поверхность капли.

2. Удерживая стекло пальцами одной руки, осторожно подогрейте его над пламенем горелки Бунзена, время от времени касаясь нижней поверхности стекла тыльной стороной другой руки. Как только стекло станет отчетливо теплым на ощупь, парафиновый срез расправится, и все морщины исчезнут.

(Стекло со срезом, плавающим на нем, можно поместить на верхнюю часть парафиновой бани на две-три минуты вместо подогрева над пламенем, как описано здесь.)

3. Осторожно наклоните стекло и промокните излишки спирта промокательной бумагой, оставив срез прикрепленным к центру стекла.

4. Поместите стекло в проволочную стойку (Рис. 75), срезом вниз, в «горячий» инкубатор на двенадцать-двадцать четыре часа. По истечении этого времени срез прочно прилипает к стеклу и на последующих этапах обрабатывается как «фиксированный» мазок на покровном стекле.

Примечание. — Если приходится работать с большими толстыми срезами, или если время имеет значение, или если в процессе окрашивания используются кислоты, часто целесообразно добавить следы альбумина Майера в спирт перед расправлением среза. Если используется это вещество, пребывания в «горячем» инкубаторе в течение двадцати минут-получаса будет вполне достаточно для обеспечения прочного прилипания среза к стеклу. Альбуминовая жидкость готовится следующим образом:

Fig. 75.—Section rack.

Альбумин Майера. —

Отвесьте

Salicylate of soda1 gramme

и растворите в

Glycerine50 c.c.

Добавьте

White of egg50 c.c.

Тщательно перемешайте с помощью венчика для яиц.

Отфильтруйте в чистую бутыль.

В качестве альтернативного метода нанесите тонкий слой раствора Шаллибаума на стекло с помощью кисточки из верблюжьей шерсти; осторожно положите срез на эту пленку и слегка нагрейте для фиксации среза.

Раствор Шаллибаума:

Clove oil30 c.c.
Collodion10 c.c.

Храните в бутыли из темно-синего стекла в прохладном месте.

Окрашивание парафиновых срезов. —

1. Подогрейте парафиновый срез над пламенем Бунзена, чтобы размягчить (но не расплавить) парафин, затем растворите воск ксилолом, налитым из капельницы.

2. Удалите ксилол, промыв срез спиртом.

3. Если ткань была изначально «зафиксирована» в растворе сулемы, срез теперь необходимо обработать раствором Люголя в течение двух минут, а затем погрузить в 90-процентный спирт для удаления всех следов желтого окрашивания.

4. Промойте водой.

5. Окрашивайте интенсивно, если используете один краситель, так как последующие процессы обесцвечивают.

6. Промойте водой, при необходимости обесцветьте.

7. Промойте несколькими порциями абсолютного спирта для обезвоживания среза.

8. Просветлите в ксилоле. (Масло гвоздики обычно не используется, так как оно обесцвечивает срез.)

9. Заключите в ксилоловый бальзам.

СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ СРЕЗОВ.

Двойное окрашивание кармином и по Граму-Вейгерту. —

1. Подготовьте срез к окрашиванию, как описано выше, пункты 1-3.

2. Окрашивайте литиевым кармином (Орта) или пикрокармином в течение десяти-тридцати минут в фарфоровой ванночке для окрашивания (Рис. 76).

3. Промывайте в растворе пикриновой кислоты до желтого цвета. На этом этапе ядра клеток красные, протоплазма желтая, а бактерии бесцветные.

Раствор пикриновой кислоты готовят путем смешивания

Picric acid, saturated aqueous solution40 c.c.
Hydrochloric acid1 c.c.
Alcohol (90 per cent.)160 c.c.

4. Промойте водой.

5. Промойте спиртом.

6. Окрашивайте анилиновым генцианвиолетом.

7. Промывайте в растворе йода до темно-коричневого или черного цвета.

8. Промойте водой.

9. Окуните в абсолютный спирт на секунду.

10. Обесцветьте анилиновым маслом до тех пор, пока краситель не перестанет вымываться.

Fig. 76.—Staining pot.

11. Wash with aniline oil, 2 parts, xylol, 1 part.

12. Просветлите ксилолом.

13. Заключите в ксилоловый бальзам.

Альтернативный метод Грама-Вейгерта для срезов. —

1. Зафиксируйте парафиновый срез на стекле и подготовьте к окрашиванию обычным способом.

2. Окрашивайте квасцовым кармином около пятнадцати минут.

3. Тщательно промойте водой.

4. Отфильтруйте раствор анилинового генцианвиолета на срез на стекле и оставьте окрашиваться около двадцати пяти минут.

5. Тщательно промойте водой.

6. Обрабатывайте раствором Люголя, пока срез не перестанет темнеть.

7. Тщательно промойте водой.

8. Обрабатывайте смесью равных частей анилинового масла и ксилола, пока краситель не перестанет вымываться.

9. Тщательно промойте ксилолом.

10. Обесцветьте и быстро обезводьте абсолютным спиртом, пока не останется лишь очень слабый голубоватый оттенок.

11. Просветлите ксилолом.

12. Заключите в ксилоловый бальзам.

(Тогда фибрин и гиалиновая ткань окрашиваются в темно-синий цвет, в то время как бактерии, которые «окрашиваются по Граму», выглядят темно-сине-фиолетовыми.)

Метод Унна-Паппенгейма. —

Краситель. —

Отвесьте и смешайте

Methylene green0.15 gramme
Pyronin0.25 gramme

и растворите в

Carbolic acid 0.5 per cent. aqueous solution 78 c.c.

Отмерьте

Alcohol2.5 c.c.}
Glycerine20.0 c.c.} and add to the stain.

Метод. —

1. Поместите ткань в вышеуказанный краситель на десять минут.

2. Дифференцируйте и обезводьте абсолютным спиртом.

3. Просветлите в ксилоле.

4. Заключите в ксилоловый бальзам.

Для обнаружения капсул. —

1. Метод Макконки. — Окрашивайте точно так же, как для мазков на покровных стеклах (см. стр. 100).

2. Метод Фридлендера. —

Краситель. —

Gentian violet, saturated alcoholic solution50 c.c.
Acetic acid, glacial10 c.c.
Distilled water100 c.c.

Метод. —

1. Подготовьте срезы к окрашиванию, secundum artem.

2. Окрашивайте срезы в тепле (например, в горячем инкубаторе) в течение двадцати четырех часов.

3. Промойте водой.

4. Decolourise lightly with acetic acid, 1 per cent.

5. Быстро обезводьте абсолютным спиртом.

6. Просветлите ксилолом.

7. Заключите в ксилоловый бальзам.

Для обнаружения кислотоустойчивых бацилл. —

1. Подготовьте срезы к окрашиванию обычным способом.

2. Окрашивайте раствором гематина в течение десяти-двадцати секунд для получения чистого ядерного окрашивания; затем промойте водой.

3. Окрашивайте карболовым фуксином в течение двадцати-тридцати минут при 47°C; затем промойте водой.

4. Treat with aniline hydrochlorate, 2 per cent. aqueous solution, for
two to five seconds.

5. Обесцветьте в 75-процентном спирте, пока срез не станет свободным от красителя — пятнадцать-тридцать минут.

6. Обезводьте абсолютным спиртом.

7. Просветлите очень быстро ксилолом.

8. Заключите в ксилоловый бальзам.

Для обнаружения спирохет в тканях.

Пиридиновый метод (Левадити). —

1. Нарежьте кусочки ткани толщиной 1 мм.

2. Зафиксируйте в 10-процентном растворе формалина в течение двадцати четырех часов.

3. Промойте водой в течение одного часа.

4. Поместите в 96-процентный спирт на двадцать четыре часа.

5. Отмерьте в бутыль из темно-зеленого или янтарного стекла 100 куб. см 1-процентного раствора нитрата серебра и 10 граммов чистого пиридина. Перенесите кусочки ткани в этот раствор. Закройте пробкой и выдержите при комнатной температуре три часа, затем в термостате при 50° C в течение четырех-шести часов.

6. Быстро промойте в 10-процентном растворе пиридина.

7. Восстановите серебро, перенеся кусочки ткани в следующий раствор на сорок восемь часов.

Pyrogallic acid4 grammes
Acetone10 c.c.
Pyridin puriss15 grammes
Distilled water100 c.c.

8. Хорошо промойте водой.

Проведите через спирты возрастающей концентрации до абсолютного, выдерживая в каждой концентрации по двадцать четыре часа.

9. Просветлите, залейте, сделайте очень тонкие срезы, смонтируйте, удалите парафин, снова просветлите и заключите в ксилоловый бальзам.

Спирохеты, если они присутствуют, черные и выделяются на бледно-желтом фоне.

Слабый карболовый фуксин, нейтральный красный или толуидиновый синий также могут быть использованы для окрашивания фона при желании, после удаления парафина на этапе 9.

Для обнаружения простейших в срезах (Лейшман). —

Необходимые реактивы:

Leishman's Polychrome stain.
Acetic acid 1 in 1500 aqueous solution.
Caustic soda 1 in 7000 aqueous solution.
Distilled water.

1. Смонтируйте срез, удалите парафин и перенесите в дистиллированную воду как обычно (см. стр. 121).

2. Слейте излишки воды.

3. Покройте срез разбавленным красителем Лейшмана (1 часть красителя, 2 части дистиллированной воды) и оставьте действовать на пять-десять минут (пока ткань не станет темно-синей).

4. Обесцветьте раствором уксусной кислоты, пока только ядра не станут синими (исследуйте срез во влажном состоянии, с объективом малого увеличения).

5. Если эозиновый цвет слишком выражен, обработайте раствором каустической соды до получения желаемого оттенка (как видно при объективе 1/6 дюйма).

6. Промойте дистиллированной водой.

7. Быстро обезводьте спиртом.

8. Просветлите ксилолом.

9. Заключите в ксилоловый бальзам.

VIII. КЛАССИФИКАЦИЯ ГРИБОВ.

Для практических целей грибы можно разделить на:

1. Hymenomycetes (including the mushrooms, etc.).

2. Hyphomycetes (moulds).

3. Blastomycetes (yeasts and torulæ).

4. Schizomycetes (bacteria).

Примечание. — Ранее миксомицеты включались в состав грибов; сейчас они признаны принадлежащими к царству животных и называются «мицетозоа».

МОРФОЛОГИЯ HYPHOMYCETES (ГИФОМИЦЕТОВ).

В начале своих занятий внимание студента направляется на различные непатогенные плесени и дрожжи не только для того, чтобы он приобрел необходимую технику при работе с культурами безвредных организмов, но и потому, что именно эти виды являются одними из самых распространенных среди тех, что могут случайно загрязнить его будущие препараты.

Гифомицеты состоят из мицелия коротких членистых палочек или «гиф», отходящих от оси или зародышевой трубки, которая развивается из споры. Гифы бывают —

(а) Питающие или погруженные.

(б) Репродуктивные или воздушные.

Протоплазма этих клеток содержит гранулы, пигмент, масляные капли, а иногда кристаллы оксалата кальция.

Размножение. — Апикальное спорообразование — бесполое; зооспоры — половое.

Mucorinae (Мукоровые). — Mucor (Рис. 77). — Обратите внимание на ветвящиеся нити — «мицелий» (а), «гифы» (б).

Обратите внимание на бесполое размножение.

1. Нить растет вверх. На ее вершине образуется перегородка, затем появляется шаровидное вздутие — «спорангий» (d). Он обладает четкой оболочкой.

2. Из перегородки вырастает булавовидная масса протоплазмы — «колумелла» (c).

Fig. 77.—Mucor mucedo.

Fig. 78.—Aspergillus

3. Остальная часть содержащейся протоплазмы распадается на «зооспоры» (e).

Наконец, оболочка разрывается, и споры выходят наружу.

Perisporaceae (Периспоровые). — Aspergillus (Рис. 78). — Обратите внимание на ветвящиеся нити — «мицелий» (а).

Fig. 79.—Penicillium.

Обратите внимание на бесполое размножение.

1. Нить (б) растет вверх, ее окончание становится булавовидным; на булавовидном конце появляются колбовидные клетки — «стеригмы» (c).

2. На свободном конце каждой стеригмы образуется овальное тело — спора или «конидия» (d), которая при созревании отбрасывается со стеригмы. На каждой стеригме могут располагаться две или более конидии.

Penicillium (Пеницилл) (Рис. 79). — Обратите внимание на ветвящиеся нити — «мицелий» (а) (часто содержащий глобулы).

Обратите внимание на бесполое размножение.

1. Нить растет вверх — «конидиеносец» (б) — и ее вершина делится на несколько ветвей — «базидии» (c).

2. На вершине каждой базидии появляется колбовидная клетка, «стеригма» (d).

3. На вершине каждой стеригмы появляется ряд овальных клеток — «споры» или «конидии» (e). Они при созревании отбрасываются со стеригм.

Fig. 80.—Oïdium.

Ascomycetae (Аскомицеты). — Oidium (Оидиум) (Рис. 80). — (Это семейство, возможно, так же близко к бластомицетам, как и к гифомицетам.)

Обратите внимание на ветвящиеся нити — «псевдомицелий» (а). Кое-где нити на концах распадаются на овальные или палочковидные сегменты, «оидии», и ведут себя как споры.

Обратите внимание на бесполое размножение. Из псевдомицелия возникают настоящие гифы (б), каждая из которых, в свою очередь, заканчивается цепочкой спор (c).

МОРФОЛОГИЯ BLASTOMYCETES (БЛАСТОМИЦЕТОВ).

Бластомицеты состоят из сферических или овальных клеток (диаметром от 8 до 9,5 мкм), которые при быстром размножении почкованием могут образовывать ложный мицелий. Тонкая клеточная стенка окружает зернистую протоплазму, в которой можно заметить вакуоли и иногда ядро. Последнее лучше всего видно при окрашивании гематоксилином (см. стр. 105).

В процессе роста и размножения бластомицеты расщепляют растворы, содержащие сахар, на спирт и CO2.

Saccharomyces (Сахаромицеты) (Рис. 81). — Обратите внимание на круглые или овальные клетки зернистой протоплазмы (а), содержащие твердые частицы и вакуоли (c) и окруженные четкой оболочкой.

Размножение. — Почкование; аскоспоры — бесполое.

Обратите внимание на бесполое размножение.

1. «Геммация» — то есть почкование дочерних клеток (б) из различных частей постепенно увеличивающейся материнской клетки. Они в конечном итоге отбрасываются и, в свою очередь, становятся материнскими клетками и образуют новые группы почек.

Fig. 81.—Saccharomyces with ascospores.

Fig. 82.—Torula.

2. Спорообразование — «аскоспоры» (e). Они образуются при определенных температурах и в строго определенные периоды; например, Saccharomyces cerevisiae, тридцать часов при 25°–37°C или десять дней при 12°C.

Torulae (Торулы) (Рис. 82). — Торулы, хотя и напоминают дрожжи почти во всех других отношениях, никогда не образуют эндоспор. Обратите внимание на удлиненные, колбасовидные клетки (а), более крупные овальные клетки (б) и шаровидные клетки (c), причем первые две часто переплетаются и растут в виде пленки.

Обратите внимание на отсутствие образования аскоспор.

IX. SCHIZOMYCETES (ШИЗОМИЦЕТЫ).

Классификация и морфология. — Бактерии часто классифицируются в общих чертах в соответствии с их жизненными функциями на —

Saprogenic, or putrefactive bacteria;

Zymogenic, or fermentative bacteria;

Pathogenic, or disease-producing bacteria;

или в соответствии с их потребностями в питании на —

Prototrophic, requiring no organic food (e. g., nitrifying bacteria);

Metatrophic, requiring organic food (e. g., saprophytes and facultative parasites);

Paratrophic, requiring living food (obligate parasites);

или в соответствии с продуктами их метаболизма на —

Chromogenic, or pigment-producing bacteria;

Photogenic, or light-producing bacteria;

Aerogenic, or gas-producing bacteria;

и так далее.

Такие широкие группировки, однако, имеют мало практической ценности при систематическом изучении грибов-делящихся.

С другой стороны, никакой действительно научной классификации шизомицетов до сих пор не составлено, и различные морфологические проявления представителей этого семейства до сих пор используются в качестве основы для классификации, как показано ниже —

1. Кокки. (Рис. 83). — Округлые или овальные клетки, подразделяемые в зависимости от расположения особей после деления на —

Диплококки и стрептококки, где деление происходит только в одной плоскости, а особи остаются прикрепленными (а) парами или (б) цепочками.

Тетрады, Merismopedia или Pediococci, где деление происходит попеременно в двух плоскостях под прямым углом друг к другу, а особи остаются прикрепленными в виде плоских табличек по четыре или их кратных количеств.

Fig. 83.—Types of bacteria—cocci: 1, Diagram of sphere
indicating planes of fission; 2, diplococci; 3, streptococci; 4,
tetrads; 5, sarcinæ; 6, staphylococci.

Сарцины, где деление происходит последовательно в трех плоскостях, а особи остаются прикрепленными в виде кубических пакетов по восемь и их кратных количеств.

Fig. 84.—Types of bacteria—bacilli, etc.: 1, Bacilli;
2, diplobacilli; 3 streptobacilli; 4, spirilla; 5, vibrios; 6,
spirochætæ.

Микрококки или стафилококки, где деление происходит в трех плоскостях, но без определенной последовательности; следовательно, особи остаются прикрепленными парами, короткими цепочками, пластинками по четыре, кубическими пакетами по восемь и неправильными массами, содержащими многочисленные кокки.

2. Бациллы (Рис. 84, 1-3). — Палочковидные клетки. Бациллу, однако, какой бы короткой она ни была, обычно можно отличить от кокка тем, что две ее стороны параллельны. Некоторые бациллы после деления сохраняют характерное расположение, и их можно называть диплобациллами или стрептобациллами.

Leptothrix — это термин, который в прошлом свободно использовался для обозначения длинной нити, но теперь ограничен такими формами, которые принадлежат к Leptothriciae (см. ниже).

3. Spirilla (Fig. 84, 4 to 6).—Curved and twisted filaments.
Classified, according to shape, into—

Spirillum.

Vibrio (comma).

Spirochæta.

Многие спирохеты, по-видимому, принадлежат к царству животных и группируются под названием простейших; другие организмы, которым было дано это название, несомненно, являются бактериями.

Встречаются также более высокоорганизованные формы бактерий, обладающие следующими характеристиками: это прикрепленные, неветвящиеся нитевидные формы, демонстрирующие—

(а) дифференцировку между основанием и вершиной;

(б) рост, по-видимому, апикальный;

(в) выраженный плеоморфизм;

(г) «псевдоветвление» вследствие прилегания клеток друг к другу; и классифицируемые на—

1. Beggiotoa. } Free swimming forms, which

2. Thiothrix. } contain sulphur granules.

3. Crenothrix. }

4. Cladothrix. } These forms do not contain

5. Leptothrix. } sulphur granules.

6. Streptothrix. A group which exhibits true but

not dichotomous branching, and contains some pathogenic

species.

Морфология одной и той же бактерии может значительно варьировать в зависимости от условий.

Например, при одних условиях исследования чистой культуры бациллы могут показать, что преобладающей формой является короткая овальная палочка, тогда как другая культура той же бациллы, но выращенная в иных условиях, может состоять почти целиком из длинных нитей или тяжей. Это морфологическое варьирование известно как «плеоморфизм».

Некоторые факторы, влияющие на плеоморфизм:

1. Состав, реакция и т. д. питательной среды, в которой растет микроорганизм.

2. Атмосфера, в которой он культивируется.

3. Температура, при которой проводится инкубация.

4. Воздействие света или защита от него.

Различные аспекты анатомии, морфологии и физиологии бактерий, на которых делается акцент на следующих страницах, следует изучать как можно более тщательно на препаратах микроорганизмов, упомянутых в связи с каждым из них.

АНАТОМИЯ.

1. Капсула (рис. 85, b). — Желатинозная оболочка (вероятно, близкая по составу к муцину), окружающая каждый отдельный организм и препятствующая непосредственному контакту между двумя особями. У некоторых видов капсула (например, B. pneumoniae) выражена хорошо, но ее не всегда удается обнаружить. В случаях очень выраженной желатинизации клеточной стенки отдельные клетки склеиваются в единую массу, к которой применяется термин «зооглея» (например, Streptococcus mesenteroides). У некоторых видов в капсуле откладывается красящее вещество или оксид железа.

2. Клеточная стенка (рис. 85, c). — Защитная дифференцировка наружного слоя клеточной протоплазмы; ее трудно обнаружить, но обработка йодом или солевым раствором иногда вызывает сжатие клеточного содержимого — «плазмолиз» — и тем самым делает клеточную стенку заметной (например, B. megatherium), как показано на рисунке 85. Окрашенные бациллы при исследовании с помощью поляризационного микроскопа часто показывают двоякопреломляющую клеточную стенку (например, B. tuberculosis и B. anthracis).

У некоторых высших бактерий клеточная стенка демонстрирует эту дифференцировку в значительной степени и образует твердую оболочку, внутри которой клеточная протоплазма свободно перемещается; а в процессе размножения клеточная протоплазма может выдавливаться наружу, оставляя пустую трубку неизменной по форме.

Fig. 85.—Dragrammatic sketch of composite bacterium to
illustrate details of anatomical structure.

Fig. 86.—Plasmolysis.

3. Содержимое клетки. — Протоплазма (микопротеин) содержит высокий процент азота, но, как говорят, отличается от белка тем, что не осаждается C2H6O. Обычно она выглядит гомогенной — иногда зернистой — и может содержать капли масла или вакуоли с клеточным соком (рис. 85, d), хроматиновые гранулы и даже гранулы серы. Вакуоли с клеточным соком следует отличать от спор, с одной стороны, и от вакуолизированного вида, обусловленного плазмолизом, с другой.

Содержимое клетки иногда может дифференцироваться на пристеночный слой и центральное тельце (например, Beggiatoa) при окрашивании гематоксилином.

4. Ядро. — Существование этой структуры не было окончательно доказано, но у некоторых бактерий вблизи центра бактериальной клетки наблюдались частицы хроматина, а на полюсах — более плотные массы протоплазмы, которые проявляют более выраженное сродство к анилиновым красителям, чем остальная часть клеточной протоплазмы. Последние называются полярными гранулами или Polkoerner (рис. 85, e). Иногда эти скопления протоплазмы изменяют цвет поглощаемого ими красителя. Тогда они известны как метахроматические тельца или Ernstschen Koerner (например, B. diphtheriae).

5. Жгутики (органы движения, рис. 85, a). — Это желатинозные выросты клеточной протоплазмы (или, что более вероятно, капсулы), расположенные либо на одном полюсе, либо на обоих полюсах, либо рассеянные по всей периферии. Жгутики не являются псевдоподиями. Обладание жгутиками одно время предлагалось в качестве основы для системы классификации, когда различали следующие типы жгутикования (рис. 87):

Fig. 87.—Types of ciliation.

1. Полярное: (а) монотрихиальное (один жгутик, расположенный на одном полюсе; например, B. pyocyaneus).

(б) Амфитрихиальное (по одному жгутику на каждом полюсе; например, Spirillum volutans).

(в) Лофотрихиальное (пучок жгутиков, расположенный на каждом полюсе; например, B. cyanogenus).

2. Диффузное: перитрихиальное (жгутики рассеяны по всей периферии; например, B. typhosus).

ФИЗИОЛОГИЯ.

Размножение. — Активная стадия. — Вегетативная, т. е. путем деления клеток, или «бинарного деления».

1. Клетка удлиняется, и протоплазма скапливается на противоположных полюсах.

2. Происходит круговое перетягивание организма посередине между этими скоплениями, и внутри клетки образуется перегородка под прямым углом к ее длине.

3. Деление углубляется, перегородка разделяется на две пластинки, и в конечном итоге образуются две клетки.

Fig. 88.—Fission o£ cocci.

Fig. 89.—Fission of bacteria.

4. Дочерние клетки могут оставаться соединенными желатинозной оболочкой в течение некоторого времени. В конце концов они разделяются и сами подвергаются делению.

Культуры на искусственных средах после роста в одной и той же среде в течение некоторого времени — т. е. когда питательные вещества истощены — показывают «инволюционные формы» (рис. 90), хорошо представленные в культурах B. pestis на агаре двухдневной давности, B. diphtheriae на картофеле четырех-шестидневной давности.

Fig. 90.—Involution forms.

Они делятся на два класса, а именно:

(а) Инволюционные формы, характеризующиеся изменениями формы (рис. 90). (Не обязательно мертвые.)

(б) Инволюционные формы, характеризующиеся потерей способности к окрашиванию. (Всегда мертвые.)

Стадия покоя. — Спорообразование. — Условия, влияющие на спорообразование: в старой культуре могут остаться только споры. Раньше предполагалось, что споры образуются всегда, чтобы вид не вымер, когда

(а) запас питательных веществ истощен.

(б) Среда стала токсичной из-за накопления продуктов метаболизма.

(в) Окружающая среда стала неблагоприятной; например, изменение температуры.

Это не совсем верно; например, температура, при которой споры образуются лучше всего, постоянна для каждой бактерии, но варьирует у разных видов; опять же, аэробам для спорообразования требуется кислород, но анаэробы не образуют спор в его присутствии.

(А) Артрогенные: отмечены только у микрококков. Один полный элемент, образующийся в результате обычного деления, дифференцируется для этой цели, увеличивается и развивает плотную клеточную стенку. Одна или несколько клеток в ряду могут претерпевать это изменение.

Этот процесс, вероятно, не является настоящим спорообразованием, а лишь относительным повышением устойчивости. Эти так называемые артроспоры никогда не наблюдались в состоянии «прорастания», и их устойчивость не очень выражена, так как они не способны инициировать новые культуры после воздействия температуры 80° C в течение десяти минут.

(Б) Эндогенные: клеточная протоплазма дифференцируется и конденсируется в сферическую или овальную массу (очень редко цилиндрическую). После дальнейшего сжатия наружные слои массы становятся еще более дифференцированными и образуют отчетливую оболочку споры, и сама спора теперь обладает высокой преломляющей способностью. Было высказано предположение, и, по-видимому, на веских основаниях, что оболочка споры состоит из двух слоев: экзоспориума и эндоспориума. Каждая клетка образует только одну спору, обычно посередине, иногда на одном конце (однако зафиксированы некоторые исключения; например, B. inflatus). Форма материнской клетки может оставаться неизменной, как у бациллы сибирской язвы, или изменяться, как у бациллы столбняка, и эти моменты служат основой для классификации спорообразующих бацилл следующим образом:

(А) Тело материнской бациллы не изменено по форме (рис. 91, a).

(Б) Клетка материнской бациллы изменена по форме.

1. Clostridium (рис. 91, b): палочка, вздутая в центре и суженная на полюсах; веретенообразная; например, B. butyricus.

2. Клиновидная (рис. 91, c): палочки, слегка вздутые на одном полюсе и более или менее заостренные на другом; клинообразные.

Fig. 91—Types of spore-bearing bacilli.

3. Булавовидная (рис. 91, d): палочки, вздутые на одном полюсе и цилиндрические (неизмененные) на другом; по форме напоминают замочную скважину; например, B. chauvei.

4. Головчатая (рис. 91, e): палочки со сферическим расширением на одном полюсе; по форме напоминают барабанную палочку; например, B. tetani.

Эндоспоры остаются внутри материнской клетки в течение некоторого времени (в одном случае утверждается, что прорастание споры происходит внутри материнской клетки — «эндопрорастание»), но в конечном итоге высвобождаются в результате набухания и растворения клеточной оболочки материнской бациллы в окружающей жидкости или разрыва этой оболочки. Затем они демонстрируют следующие характеристики:

1. Хорошо сформированные, плотные клеточные оболочки, что делает их чрезвычайно трудными для окрашивания, но после окрашивания их так же трудно обесцветить.

2. Высокая преломляющая способность, которая отличает их от вакуолей.

3. Более высокая устойчивость, чем у материнского организма, к таким летальным агентам, как тепло, высушивание, голодание, время и т. д., причем эта устойчивость обусловлена

(а) низким содержанием воды в плазме споры.

(b) Low heat-conducting power} of the spore membrane.
(c) Low permeability}

Эта устойчивость несколько варьирует в зависимости от конкретного вида — например, некоторые споры могут выдерживать кипячение в течение нескольких минут, — но практически все они погибают, если кипячение продолжается десять минут.

Прорастание. — При переносе на подходящие среды и помещении в благоприятные условия споры прорастают, обычно в течение двадцати четырех — тридцати шести часов, и последовательно претерпевают следующие изменения, за которыми можно наблюдать в культурах «висячая капля» на термостолике:

1. Медленно набухают и увеличиваются в размерах за счет поглощения воды.

2. Теряют свою преломляющую способность.

3. На этой стадии можно наблюдать один из трех процессов (но конкретный процесс всегда постоянен для одного и того же вида):

(а) спора прорастает в новую бациллу, не сбрасывая оболочку споры (которая в этом случае становится клеточной оболочкой); например, B. leptosporus.

(б) она теряет оболочку споры путем растворения; например, B. anthracis.

(в) она теряет оболочку споры путем разрыва.

В этом процессе разрыв может быть полярным (только на одном полюсе, например, B. butyricus), биполярным (например, B. sessile) или экваториальным (например, B. subtilis).

В тех случаях, когда оболочка споры сбрасывается, клеточная оболочка новой бациллы может быть сформирована из—

(а) внутреннего слоя оболочки споры, который претерпел предварительное расщепление на пристеночный и висцеральный слои; например, B. butyricus.

(б) наружных слоев клеточной протоплазмы, которые дифференцируются для этой цели; например, B. megatherium.

Новая бацилла теперь увеличивается в размерах, удлиняется и переходит к вегетативному росту — т. е. подвергается делению, — бациллы, образующиеся в результате этого, в свою очередь, могут давать начало спорам.

Fig. 92. Simple.

Fig. 93. Solution.

Fig. 94. Polar.

Fig. 95. Bipolar.

Fig. 96. Equatorial.

Питательные вещества. — 1. Органические питательные вещества. —

(а) Чистые паразиты (например, B. leprae) не живут вне живого организма.

(б) Как сапрофитные, так и факультативно-паразитические бактерии требуют неконцентрированной пищи.

(в) Факультативным паразитам нужны высокоорганизованные питательные вещества; например, белки или другие источники азота и углерода, а также соли.

(г) Сапрофитные бактерии культивируются легче; например,

1. Некоторые бактерии растут почти в чистой дистиллированной воде.

2. Некоторые бактерии растут в чистых растворах углеводов.

3. Вода абсолютно необходима для роста бактерий.

Для роста бактерий необходима пища с определенной реакцией. Как правило, рост наиболее активен в средах, которые реагируют слабокисло по фенолфталеину — то есть нейтрально или слабощелочно по лакмусу. Рост плесени, с другой стороны, наиболее энергичен в средах, которые сильнокисло по фенолфталеину.

Окружающая среда. — Влияние физических агентов на жизнь и рост бактерий выражено сильно.

1. Атмосфера. — Присутствие кислорода необходимо для роста некоторых бактерий, и смерть наступает, когда его подача прекращается. Такие организмы называются облигатными аэробами.

Некоторые бактерии, по-видимому, одинаково хорошо процветают как при наличии, так и при отсутствии кислорода. Они называются факультативными анаэробами.

Третий класс будет жить и размножаться только тогда, когда доступ свободного кислорода полностью исключен. Они называются облигатными анаэробами.

2. Температура. — Практически никакой рост бактерий не происходит ниже 5°C и очень мало выше 40°C. 30°C–37°C — наиболее благоприятная температура для подавляющего большинства микроорганизмов.

Максимальная и минимальная температуры, при которых происходит рост, а также оптимум, довольно постоянны для каждой бактерии.

Бактерии были классифицированы в соответствии с их оптимальной температурой на—

Min.Opt.Max.
1. Psychrophilic bacteria (chiefly water organisms)0° C.15° C.30°C.
2. Mesophilic bacteria (includes pathogenic bacteria)15° C.37° C.45°C.
3. Thermophilic bacteria45° C.55° C.70°C.

Термическая точка гибели организма является еще одной биологической константой; это температура, которая вызывает гибель вегетативных форм при воздействии в течение десяти минут (см. стр. 298–301).

3. Свет. — Многие организмы безразличны к присутствию света. С другой стороны, свет часто препятствует росту и в большей или меньшей степени изменяет биохимические характеристики организмов — например, хромогенность или способность к разжижению. Патогенные бактерии претерпевают прогрессирующую потерю вирулентности при культивировании в присутствии света.

4. Движения. — Движения, если они незначительны и имеют просто текучий характер, по-видимому, не оказывают вредного влияния на рост бактерий; но сильное воздействие, такое как встряхивание, абсолютно убивает их.

Состояние полного покоя, по-видимому, наиболее благоприятно для роста бактерий.

Продукты метаболизма бактерий. — Пигментообразование. — Многие микроорганизмы производят один или несколько ярких пигментов — желтый, оранжевый, красный, фиолетовый, флуоресцентный и т. д. — в процессе своей жизни и роста. Красящее вещество обычно существует как межклеточное экскреторное вещество. Иногда, однако, оно, по-видимому, откладывается непосредственно внутри тел бактерий. Поэтому хромогенные бактерии классифицируются в соответствии с конечным пунктом назначения красящего вещества, которое они вырабатывают, на—

Хромопаровые бактерии: у которых пигмент диффундирует наружу в окружающую среду.

Хромофорные бактерии: у которых пигмент откладывается в клеточной протоплазме организма.

Парахромофорные бактерии: у которых пигмент откладывается в клеточной стенке организма.

Разные виды хромогенных бактерий различаются по своим требованиям к окружающей среде для выработки характерных пигментов; например, некоторым нужен кислород, свет или высокая температура; другие, напротив, предпочитают обратные условия.

Светоизлучение. — Некоторые бактерии, обычно те, которые изначально происходят из воды, пресной или соленой, проявляют выраженную фосфоресценцию при культивировании в подходящих условиях. Они классифицируются как «фотогенные».

Ферментообразование. — Многие бактерии производят растворимые ферменты в процессе своего роста, о чем свидетельствует разжижение желатина, свертывание молока и т. д. Эти ферменты могут принадлежать к любому из следующих хорошо известных классов: протеолитические, диастатические, инвертазы, сычужные.

Токсинообразование. — Большое количество, особенно патогенных бактерий, вырабатывает или секретирует ядовитые вещества, о которых мало что известно, хотя многие из них, по-видимому, действуют как ферменты.

Эти токсины обычно делятся на—

Экзотоксины (или растворимые токсины): те, которые диффундируют в окружающую среду и удерживаются ею в растворе.

Эндотоксины (или неразделимые токсины): те, которые настолько тесно связаны с клеточной протоплазмой бактерий, их вырабатывающих, что до настоящего времени не было найдено способа их отделения или экстракции.

Конечные продукты метаболизма. — К этой рубрике относятся—

Органические кислоты (например, молочная, масляная и т. д.).

Щелочи (например, аммиак).

Ароматические соединения (например, индол, фенол).

Восстанавливающие вещества (например, те, которые восстанавливают нитраты до нитритов).

Газы (например, сероводород, углекислый газ и т. д.).

И хотя обсуждение их образования и т. д. выходит за рамки лабораторного руководства, методы, используемые для их обнаружения и разделения, входят в обычную рутинную работу и поэтому будут описаны (см. стр. 276 и далее).

X. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

Для того чтобы жизнь и рост бактерий можно было точно наблюдать в лаборатории, необходимо—

1. Изолировать отдельных представителей различных разновидностей микроорганизмов.

2. Культивировать организмы, таким образом изолированные, отдельно от других ассоциированных или контаминирующих бактерий — т. е. в чистой культуре.

Для успешного достижения этих целей необходимо обеспечить питание в форме, соответствующей потребностям конкретной бактерии или бактерий, находящихся под наблюдением, и в общем можно сказать, что питательные материалы должны максимально приближаться по составу и характеру к естественной пище организма.

Общие требования бактерий к пище уже были указаны (стр. 142), и время от времени разрабатывались многие комбинации белков и углеводов в этом направлении. Они, вместе с различными растительными тканями, физиологическими или патологическими секретами жидкостей и т. д., коллективно называются питательными средами или культуральными средами.

Большее количество этих сред является преимущественно жидкими, но из-за быстроты, с которой бактериальный рост распространяется в жидкости, невозможно изучить в ней характеристики отдельных организмов. Многие такие среды поэтому впоследствии делают твердыми путем добавления веществ, таких как желатин или агар, в различных пропорциях, причем пропорции такого добавленного материала обычно упоминаются при упоминании сред; например, 10-процентный желатин, 2-процентный агар. Желатин используется для отверждения тех сред, которые предполагается использовать при культивировании бактерий при комнатной температуре или в «холодном» инкубаторе. В обычно используемых процентах желатиновые среды становятся жидкими при 25°C; более высокие проценты остаются твердыми при несколько более высоких температурах, но трудность фильтрации крепких растворов желатина препятствует их широкому использованию.

Среды, с другой стороны, которые были отверждены путем добавления агара, становятся жидкими только при воздействии 90° C в течение примерно десяти минут и снова затвердевают, когда температура падает до 40° C.

Когда возникает необходимость сделать эти среды жидкими, применяется нагревание, после прекращения которого они снова принимают свое твердое состояние. Такие среды следует называть разжижаемыми средами; по сути, однако, их обычно группируют вместе с твердыми средами.

Примечание. — Здесь следует указать, что обозначение 10-процентный желатин или 2-процентный агар относится только к количеству этих веществ, фактически добавленных в процессе производства, а не к проценту желатина или агара, в зависимости от случая, присутствующему в готовой среде; объяснение заключается в том, что используемые коммерческие продукты содержат большую долю нерастворимого материала, который отделяется путем фильтрации во время приготовления разжижаемых сред.

Другие среды, опять же — например, картофель, коагулированная сыворотка крови и т. д. — не могут быть снова разжижены физическими средствами, и их называют твердыми средами.

На следующих страницах подробно описан метод приготовления различных питательных сред, находящихся в обычном употреблении (см. также главу XI), те, которые требуются лишь изредка для более узкоспециализированной работы, сгруппированы в главе XII. Необходимо заранее оговорить, что следует соблюдать исключительную чистоту в отношении всей аппаратуры, сосудов, воронок и т. д., используемых при приготовлении сред; хотя на предварительных этапах приготовления большинства сред абсолютная стерильность используемой аппаратуры не является обязательной.

МЯСНОЙ ЭКСТРАКТ.

Водный раствор экстрактивных веществ и т. д. постного мяса (обычно говядины) составляет основу нескольких питательных сред. Этот раствор называется «мясным экстрактом», и эмпирически было определено, что его приготовление должно осуществляться путем экстракции полукилограмма влажного мяса одним литром воды. Для многих целей, однако, удобнее иметь более концентрированный экстракт; поэтому один килограмм мяса следует экстрагировать одним литром воды, чтобы получить мясной экстракт «двойной крепости».

Одно время было принято, и до сих пор в некоторых лабораториях принято использовать либо «говяжью голяшку», либо «говяжий стейк» — оба содержат мышечный сахар, который часто необходимо удалять перед завершением приготовления питательной среды. Сердечная мышца (бычье сердце или овечье сердце) предпочтительнее, и с точки зрения экономии, легкости и чистоты манипуляций, а также экстрактивной ценности, импортируемые замороженные бычьи сердца обеспечивают лучший экстракт.

Мясной экстракт (Fleischwasser) готовится следующим образом:

1. Отмерьте 1000 куб. см дистиллированной воды в большую колбу (или стеклянный стакан, или эмалированный железный котел) и добавьте 1000 граммов (примерно 2,5 фунта) свежего постного мяса — например, бычьего сердца — мелко измельченного в мясорубке.

2. Аккуратно нагрейте смесь на водяной бане, следя за тем, чтобы температура содержимого колбы не превышала 40° C в течение первых двадцати минут. (Это растворяет растворимые белки, экстрактивные вещества, соли и т. д.)

3. Теперь поднимите температуру смеси до точки кипения и поддерживайте ее при этой температуре в течение десяти минут. (Это осаждает некоторые альбумины, гемоглобин и т. д. из раствора.)

4. Процедите смесь через стерильную марлю или перфорированную фарфоровую воронку, затем отфильтруйте жидкость через шведскую фильтровальную бумагу в стерильную «нормальную» литровую колбу, и когда она остынет, доведите объем до 1000 куб. см добавлением дистиллированной воды — чтобы восполнить потерю от испарения.

5. Если он не нужен сразу, стерилизуйте мясной экстракт в большом количестве в паровом стерилизаторе в течение двадцати минут в течение трех последовательных дней.

Телятина, баранина или куриное мясо иногда заменяют говядину; или мясной экстракт может быть приготовлен из внутренних органов животных, таких как мозг, селезенка, печень или почки.

Примечание. — В качестве альтернативного метода 5 куб. см мясного сока Брэнда или 3 грамма говяжьего сока Уайета, или 10 граммов мясного экстракта Либиха (Lemco) можно растворить в 1000 куб. см дистиллированной воды, нагреть и отфильтровать, как указано выше, чтобы получить обычный мясной экстракт или экстракт одинарной крепости.

Среды, приготовленные из таких мясных экстрактов, однако, крайне неудовлетворительны при использовании для культивирования более высокопаразитических бактерий; хотя при работе в тропических и субтропических регионах их использование практически обязательно.

Реакция мясного экстракта. — Мясной экстракт, приготовленный таким образом, имеет кислую реакцию из-за присутствия кислых фосфатов калия и натрия, слабых кислот гликолевого ряда и органических соединений, в которых преобладает кислотный характер. Из-за природы веществ, из которых он получает свою реакцию, общая кислотность мясного экстракта может быть точно оценена только тогда, когда раствор находится при температуре кипения.

Более того, было замечено, что длительное кипячение (такое, которое требуется при приготовлении питательных сред) вызывает в нем гидролитические изменения, которые повышают его кислотность, и мясной экстракт становится стабильным в этом отношении только после того, как его выдерживали при температуре кипения в течение сорока пяти минут.

Хотя мясной экстракт всегда реагирует кисло по фенолфталеину, он иногда реагирует нейтрально или даже щелочно по лакмусу; и опять же, мясной экстракт, который был сделан точно нейтральным по лакмусу, все еще реагирует кисло по фенолфталеину. Это своеобразное поведение зависит от двух факторов:

1. Лакмус нечувствителен ко многим слабым органическим кислотам, присутствие которых легко определяется фенолфталеином.

2. Двузамещенный фосфат натрия, который образуется в процессе нейтрализации, представляет собой соль, которая реагирует щелочно по лакмусу, но нейтрально по фенолфталеину. Поэтому, чтобы получить точную оценку реакции любого данного образца мясного экстракта, необходимо, чтобы—

1. Мясной экстракт был предварительно подвергнут воздействию температуры 100° C в течение сорока пяти минут.

2. Оценка проводилась при температуре кипения.

3. Фенолфталеин использовался в качестве индикатора.

Оценка проводится с помощью титрования против стандартных растворов каустической соды следующим образом:

Метод оценки реакции. —

Apparatus Required:Solutions Required:
1. 25 c.c. burette graduated in tenths of a centimetre.1. 10N NaOH, accurately standardised.
2. 1 c.c. pipette graduated in hundredths, and provided with rubber tube, pinch-cock, and delivery nozzle.2. n/1 NaOH, accurately standardised
3. 25 c.c. measure (cylinder or pipette, calibrated for 98°C.—not 15°C).3. n/10 NaOH, accurately standardised
4. Several 60 c.c. conical beakers or Erlenmeyer flasks.4. 0.5 per cent. solution of phenolphthalein in 50 percent. alcohol.

5. White porcelain evaporating basin, filled with boiling water and arranged over a gas flame as a water-bath.
6. Bohemian glass flask, fitted as a wash-bottle, and filled with distilled water, which is kept boiling on a tripod stand.

Метод. — Расположите аппаратуру, как показано на рисунке 97.

(А) 1. Заполните бюретку n/10 NaOH.

2. Заполните пипетку n/1 NaOH.

Fig. 97.—Arrangement of apparatus for titrating media.

3. Отмерьте 25 куб. см мясного экстракта (предварительно нагретого в паровой бане при 100° C в течение сорока пяти минут) в один из стаканов с помощью мерного сосуда; ополосните мерный сосуд очень небольшим количеством кипящей дистиллированной воды из промывалки, а затем добавьте эту промывную воду к мясному экстракту, уже находящемуся в стакане.

4. Влейте около 0,5 куб. см раствора фенолфталеина, погрузите стакан в водяную баню и доведите до кипения.

5. В среду в стакане осторожно вливайте n/10 NaOH из бюретки до тех пор, пока не будет достигнута конечная точка, на что указывает появление розоватого оттенка, показанного на рисунке 98 (b). Отметьте количество децинормального раствора соды, использованного в процессе.

Примечание. — Непосредственно перед достижением конечной точки в жидкости можно заметить очень легкую опалесценцию, обусловленную осаждением двузамещенных фосфатов. После достижения истинной конечной точки дальнейшее добавление около 0,5 куб. см децинормального раствора соды даст глубокий пурпурный цвет (рис. 98, c), который является так называемой «конечной точкой» Американского комитета бактериологов.

Fig. 98.—a, Sample of filtered meat extract or
nutrient gelatine to which phenolphthalein has been added. The medium is
acid, as evidenced by the unaltered colour of the sample. b, The same
neutralised by the addition of n/10 NaOH. The production of this faint
rose-pink colour indicates that the "end-point," or neutral point to
phenolphthalein, has been reached. If such a sample is cooled down to
say 30° or 20° C., the colour will be found to become more distinct and
decidedly deeper and brighter, resembling that shown in c. c, Also
if, after the end-point is reached, a further 0.5 c.c. or 1.0 c.c. n/10
NaOH be added to the sample, the marked alkalinity is evidenced by the
deep colour here shown.

(Б) Выполните «контрольное» титрование (иногда могут потребоваться два контроля) следующим образом:

1. Отмерьте 25 куб. см мясного экстракта в один из стаканов, промойте мерный сосуд кипящей водой и добавьте фенолфталеин, как при первой оценке.

2. Влейте n/1 NaOH из пипетки, чуть меньше эквивалента количества децинормального раствора соды, необходимого для нейтрализации 25 куб. см среды. (Например, если при первой оценке для нейтрализации 25 куб. см среды по фенолфталеину потребовалось 5 куб. см n/10 NaOH, добавьте только 0,48 куб. см n/1 NaOH.) Погрузите стакан в водяную баню.

3. Завершите титрование с помощью n/10 NaOH.

4. Отметьте количество раствора n/10 NaOH, необходимое для завершения титрования, и добавьте его к эквиваленту раствора n/1 NaOH, ранее влитого. Примите общую сумму за правильную оценку.

Метод выражения реакции. —

Реакция или титр мясного экстракта, среды или любого раствора, оцененного вышеуказанным образом, наиболее удобно выражается путем указания количества кубических сантиметров нормальной щелочи (или нормальной кислоты), которое потребовалось бы для того, чтобы сделать один литр раствора точно нейтральным по фенолфталеину.

Fig. 99.—Stock bottle for dekanormal soda solution.

Знак + (плюс) ставится перед этим числом, если исходный раствор реагирует кисло, и знак - (минус), если он реагирует щелочно.

Например, «мясной экстракт + 10» указывает на образец мясного экстракта, который реагирует кисло по фенолфталеину и потребовал бы добавления 10 куб. см нормального NaOH на литр для его нейтрализации.

Примечание. — Такой раствор, вероятно, реагировал бы щелочно по лакмусу.

И наоборот, если в результате наших экспериментов по титрованию мы обнаружим, что 25 куб. см мясного экстракта требуют добавления 5 куб. см n/10 NaOH для нейтрализации, то 1000 куб. см мясного экстракта потребуют добавления 200 куб. см n/10 NaOH = 20 куб. см n/1 NaOH.

И эта последняя цифра, 20, перед которой стоит знак + (т. е. +20), чтобы обозначить, что он кислый, указывает на реакцию мясного экстракта.

Примечание. — Стандартные растворы соды должны быть приготовлены путем точных измерительных операций, контролируемых титрованием, из исходного раствора 10N NaOH, который должен быть очень тщательно стандартизирован. Если делается большой запас или потребление невелико, этот исходный раствор должен храниться в аспираторной бутыли, к которой воздух может получить доступ только после того, как он был высушен и освобожден от CO2. Это можно сделать, сначала пропустив его через H2SO4 и натронную известь, или только через натронную известь, с помощью такого устройства, как показано на рисунке 99, который также показывает устройство с постоянной бюреткой для подачи небольших измеренных количеств деканнормального раствора соды.

СТАНДАРТИЗАЦИЯ СРЕД.

Различия в реакции среды, в которой он растет, вызовут не только различия в скорости роста любой данной бактерии, но и хорошо выраженные различия в ее культуральных и морфологических характеристиках; и почти каждый организм, как будет обнаружено, предпочитает определенную «оптимальную реакцию» — точку, которую следует тщательно определить для каждого. Для большинства бактерий, однако, «оптимум» обычно довольно близко приближается к +10; и поскольку эксперимент показал, что эта реакция является наиболее полезной для рутинной лабораторной работы, она является той, которая может быть принята в качестве стандарта для всех питательных сред, полученных из мясного экстракта.

Вкратце, метод стандартизации литра сред до +10 состоит в вычитании 10 из начального титра массы среды; остаток указывает количество кубических сантиметров нормального раствора соды, которое необходимо добавить к среде на литр, чтобы сделать реакцию +10.

Standardising Nutrient Bouillon.—For example, 1000 c.c. bouillon are
prepared; at the first titration it is found

1. 25 куб. см требуют добавления 5,50 куб. см n/10 NaOH для нейтрализации.

Два контроля дают следующие результаты:

2. 25 куб. см требуют добавления 5,70 куб. см n/10 NaOH для нейтрализации.

3. 25 куб. см требуют добавления 5,60 куб. см n/10 NaOH для нейтрализации.

Усредняя эти два контроля, 25 куб. см требуют добавления 5,65 куб. см n/10 NaOH для нейтрализации, и поэтому 1000 куб. см требуют добавления 226 куб. см n/10 NaOH, или 22,60 куб. см n/1 NaOH, или 2,26 куб. см n/10 NaOH.

Начальный титр бульона = +22,6, и как таковой требует добавления (22,6 куб. см - 10 куб. см) = 12,6 куб. см n/1 NaOH на литр, чтобы оставить его конечную реакцию +10.

Но три титрования, каждое по 25 куб. см среды, уменьшили исходный объем бульона до (1000 - 75 куб. см) = 925 куб. см. Количество n/1 NaOH, необходимое для того, чтобы сделать реакцию этого количества среды +10, можно вывести следующим образом:

1000 c.c.:925 c.c.::12.6 c.c.:x.

Тогда x = 11,65 куб. см n/1 NaOH.

Всякий раз, когда это возможно, однако, требуемая реакция достигается добавлением деканнормального раствора соды из-за незначительного увеличения, которое он вызывает в объеме, и последующего незначительного нарушения процентного состава среды. С помощью пипетки, градуированной до 0,01 куб. см, можно подавать очень малые количества; но если рассчитанное количество доходит до тысячных долей кубического сантиметра, они заменяются соответствующими количествами нормальной или даже децинормальной соды.

В приведенном выше примере необходимо добавить 11,65 куб. см нормального NaOH или его эквивалент, 1,165 куб. см деканнормального NaOH. Поскольку первое количество слишком велико, а второе неудобно мало для точного измерения, общее количество соды получают путем замены 1,16 куб. см деканнормального раствора соды и либо 0,05 куб. см нормального раствора соды, либо 0,5 куб. см децинормального раствора соды.

Стандартизация питательного агара и желатина. — Метод стандартизации агара и желатина точно такой же, как описанный для бульона.

ФИЛЬТРАЦИЯ СРЕД.

Жидкие среды обычно фильтруют через плотную шведскую фильтровальную бумагу (иногда через фарфоровую фильтровальную свечу), и для ускорения скорости фильтрации фильтровальную бумагу следует складывать в форме, известной как «физиологический фильтр», а не в обычной «квадрантной» форме, так как таким образом для фильтрации доступна большая поверхность и меньшая площадь находится в контакте со стеклянной воронкой, поддерживающей ее.

Чтобы сложить фильтр, действуйте следующим образом:

1. Возьмите круглый кусок фильтровальной бумаги и сложите его точно по центру, чтобы образовался полукруг (рис. 100, a).

2. Сложите полукруг точно пополам, чтобы образовался квадрант; сделайте сгиб 2 отчетливым, проведя по нему ногтем большого пальца, затем снова разверните фильтр в полукруг.

3. Сложите каждый конец полукруга к центру и таким образом сформируйте другой квадрант; разгладьте два новых сгиба 3 и 3a, образовавшихся таким образом, и снова разверните в полукруг.

4. Полукруг теперь выглядит как на рисунке 100, a, темные линии указывают на уже сформированные сгибы.

5. Сложите точку 1 к точке 3, а 1a к 3a, чтобы сформировать сгибы 4 и 4a, указанные на диаграмме светлыми линиями. Сложите точку 1 к 3a, а 1a к 3, чтобы сформировать сгибы 5 и 5a.

Fig. 100.—Filter folding: a, Filter folded in half,
showing creases; b, appearance of filter on completion of folding;
c, filter opened out ready for use.

6. До сих пор все сгибы были сделаны на одной стороне бумаги. Теперь разделите каждый из восьми секторов сгибом через его центр на противоположной стороне бумаги, обозначенным слабыми пунктирными линиями на диаграмме. Постепенно складывайте фильтр по мере того, как делается каждый сгиб, и по завершении фильтр принимает форму клина, как на рисунке 100, b.

При развертывании фильтр принимает форму, представленную на рисунке 100, c.

Сложенный фильтр затем помещается внутрь стеклянной воронки, поддерживаемой на штативе, и смачивается горячей дистиллированной водой перед началом фильтрации среды.

Разжижаемые твердые среды фильтруются через специально изготовленную фильтровальную бумагу — «papier Chardin» — которая продается в коробках по двадцать пять готовых сложенных фильтров.

Fig. 101.—Hot-water filter funnel and ring burner.

Желатин, если он правильно приготовлен, фильтруется через эту бумагу так же быстро, как бульон через шведскую фильтровальную бумагу, и не требует использования воронки с горячей водой.

Агар, аналогично, если он правильно приготовлен, фильтруется легко, хотя и не с такой высокой скоростью, как желатин. Если он плохо «осветлен яйцом», а также в зимние месяцы, необходимо окружить стеклянную воронку, в которой проводится фильтрация агара, рубашкой с горячей водой. Это делается путем помещения стеклянной воронки внутрь медной воронки с двойными стенками — пространство между стенками заполняется водой при температуре около 90° C — и поддержки последней на кольцевой газовой горелке, закрепленной на штативе (рис. 101). Газ зажигается, и водяная рубашка поддерживается при высокой температуре до завершения фильтрации. Если паровой стерилизатор лаборатории достаточно велик, иногда удобнее поместить колбу и фильтровальную воронку внутрь, закрыть стерилизатор и позволить фильтрации происходить в атмосфере живого пара, чем использовать газовую горелку и воронку с горячей водой.

ХРАНЕНИЕ СРЕД В БОЛЬШОМ КОЛИЧЕСТВЕ.

После фильтрации разлейте среду в стерильные литровые колбы с ватными пробками и стерилизуйте в паровом стерилизаторе в течение двадцати минут в течение трех последовательных дней. После третьей стерилизации, и когда колбы и содержимое остынут, обрежьте верхнюю часть ватной пробки вровень с горлышком колбы; протолкните пробку на небольшое расстояние вниз в горлышко колбы и залейте расплавленным парафиновым воском до уровня горлышка. Когда воск застынет, колбы хранят в прохладном темном шкафу для будущего использования.

Fig. 102.—Rubber cap closing store bottle. a, before,
and b, after sterilizing.

Этот способ не является абсолютно удовлетворительным, хотя и применяется довольно часто в отдельных случаях; предпочтительнее разливать среду в бутыли из бесцветного стекла с длинным горлышком (емкостью в одну кварту, вмещающие почти 1000 куб. см, подобные тем, в которых продается пастеризованное молоко) и закрывать горлышко специальным резиновым колпачком. Этот колпачок изготовлен из мягкой резины; его нижняя часть, куполообразная с тонкими стенками, надевается на горлышко бутыли (рис. 102, a). Верхняя часть — сплошная, но с острым аккуратным разрезом (сделанным ножом для операций на катаракте или тенотомическим ножом), проходящим полностью через ее ось от центра диска до вершины купола. Во время стерилизации воздух в горлышке бутыли, расширяясь от нагревания, выходит через клапанное отверстие в сплошной части пробки. При извлечении бутыли из паровой камеры жидкость при охлаждении сжимается, и давление наружного воздуха вдавливает сплошную часть резины внутрь горлышка бутыли, плотно прижимая края разреза друг к другу (рис. 102, b). Бутыль, герметизированная таким образом, сохраняет содержимое стерильным в течение неопределенного периода времени без потерь от испарения.

РАЗЛИВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД В ПРОБИРКИ.

После окончательной фильтрации питательную среду обычно «разливают в пробирки» — то есть заполняют ею стерильные пробирки в определенных отмеренных количествах, как правило, по 10 куб. см. Этот процесс иногда осуществляется с помощью большой делительной воронки, снабженной «трехходовым» краном, который сообщается с небольшой градуированной трубкой (емкостью 20 куб. см, градуированной в кубических сантиметрах), прикрепленной сбоку. Форма этого аппарата, известного как воронка Трескова, делает его особенно подверженным повреждениям. Поэтому лучше использовать менее дорогостоящий аппарат, который будет служить той же цели не менее эффективно (рис. 103).

Трехходовой запорный кран Гейсслера имеет трубку с одной стороны крана, скошенную на конце, и трубку с противоположной стороны, обрезанную на расстоянии 3 см от крана. Короткая трубка соединяется с помощью перфорированной резиновой пробки с отрезком толстостенной стеклянной трубки длиной 10 см (диаметром 1,5 см). Третий канал трехходового крана соединяется с помощью резиновой трубки с носиком обычной делительной воронки. Наконец, приемный цилиндр над трехходовым краном градуируется в кубических сантиметрах до 20 путем вливания в него отмеренных количеств воды и нанесения отметок различных уровней снаружи алмазным стеклорезом.

Жидкие среды, содержащие углеводы, разливают в бродильные пробирки (см. рис. 21) или в обычные пробирки для сред, внутри которых уже находятся меньшие перевернутые пробирки (рис. 104) для сбора продуктов жизнедеятельности газообразующих бактерий. При первом заполнении маленькие пробирки плавают на поверхности среды; после первой стерилизации почти весь воздух замещается средой, а после окончательной стерилизации газовые пробирки оказываются погруженными и полностью заполненными средой.

Fig. 103.—Separatory funnel and three-way tap arranged
for tubing media.

Fig. 104.—Gas tube (Durham).

Хранение сред в пробирках. — Среды после разливания в пробирки лучше всего хранить в вертикальном положении в продолговатых ящиках с внутренними размерами 37 см в длину, 12 см в ширину и 10 см в глубину. Каждый ящик (рис. 105) имеет подвижную перегородку, образованную вертикальной гранью утяжеленного треугольного деревянного бруска, свободно скользящего по дну (рис. 105, A), или плоским куском дерева, скользящим в металлическом пазу на дне ящика, который можно зафиксировать в любом месте, затянув винт латунного направляющего стержня, проходящего сквозь перегородку (рис. 105, B). Передняя часть ящика снабжена ручкой и целлулоидной этикеткой для названия содержащейся среды. Эти ящики расставляют на полках в темном шкафу — или, что предпочтительнее, в железном сейфе, — который должен быть максимально герметичным, а на его дверцах должна быть надпись «Хранилище сред».

Fig. 105.—Medium box, showing alternative partitions A
and B.

СНОСКИ:

[3] Этот резиновый колпачок был изготовлен для меня компанией Holborn Surgical Instrument Co., Thavies Inn, Лондон, W. C.

XI. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

ОБЫЧНЫЕ ИЛИ ОСНОВНЫЕ СРЕДЫ.

Питательный бульон. —

1. Measure out double strength meat extract, 500 c.c., into a litre
flask and add 300 c.c. distilled water.

2. Отвесьте 10 граммов пептона Витте (= 1%) и 5 граммов соли (= 0,5%) и разотрите в однородную пасту с 200 куб. см дистиллированной воды, предварительно нагретой до 60° C. (Следите за тем, чтобы не осталось нерастворенных комочков пептона.)

3. Добавьте пептонную эмульсию к мясному экстракту в колбе и нагревайте в паровом стерилизаторе в течение сорока пяти минут (чтобы полностью растворить пептон и сделать кислотность мясного экстракта стабильной).

4. Оцените реакцию среды; проконтролируйте результат; доведите реакцию готовой среды до +10 (см. стр. 155).

5. Нагревайте в течение получаса в паровом стерилизаторе при 100° C (для завершения осаждения фосфатов и т. д.).

6. Профильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу в стерильную колбу.

7. Разлейте в стерильные пробирки (по 10 куб. см в каждую пробирку).

8. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе в течение двадцати минут в течение трех дней подряд — то есть методом дробной стерилизации (см. стр. 35).

Примечание. — В качестве альтернативного метода, когда нет ни свежего, ни замороженного мяса, питательный бульон можно приготовить из коммерческого мясного экстракта следующим образом:

Бульон «Лемко». —

1. Отмерьте 250 куб. см дистиллированной воды в литровую колбу.

2. Отвесьте 10 граммов мясного экстракта «Лемко» Либиха на кусок чистой фильтровальной бумаги и добавьте к воде в колбе. Хорошо встряхните колбу, чтобы получить однородную эмульсию мясного экстракта.

3. Отвесьте пептон Витте (10 граммов) и соль (5 граммов). Разотрите в однородную пасту со 100 куб. см дистиллированной воды, предварительно нагретой до 60° C.

4. Добавьте пептонно-солевую эмульсию к эмульсии мясного экстракта в колбе и добавьте 650 куб. см дистиллированной воды. Нагревайте в паровом стерилизаторе в течение сорока пяти минут.

5. Стандартизируйте среду и завершите приготовление так же, как для питательного бульона.

Питательный желатин. —

1. Взвесьте 2-литровую колбу на технических весах (рис. 106) и запишите вес или тщательно уравновесьте ее.

Fig. 106.—Trip balance.

Чрезвычайно полезным противовесом является небольшой цилиндр из листовой латуни высотой около 38 мм и диаметром 38 мм с воронкообразной верхней частью и боковой трубкой, через которую можно высыпать содержимое — мелкую дробь (рис. 107).

Fig. 107.—Counterpoise; weight when empty, 35 grammes;
when full of dust shot, 200 grammes.

2. Measure out double strength meat extract, 500 c.c., into the "tared"
flask.

3. Отвесьте и смешайте 10 граммов пептона, 5 граммов соли и сделайте густую пасту со 150 куб. см дистиллированной воды; затем добавьте эмульсию к мясному экстракту в колбе; также добавьте 100 граммов листового желатина, нарезанного на мелкие кусочки; поместите колбу на водяную баню и доведите до кипения.

Fig. 108.—Arrangement of steam can and water-bath for
the preparation of media.

4. Установите 5-литровую жестяную банку (с медным дном, подобную тем, что используются при получении дистиллированной воды) рядом с водяной баней, наполните банку кипящей водой и поместите под нее зажженную горелку Бунзена. Присоедините длинную предохранительную трубку к горлышку банки, а также отводную трубку, изогнутую под прямым углом дважды; отрегулируйте трубку так, чтобы она достигала дна внутри колбы, содержащей желатин и т. д. (рис. 108).

5. Поддерживайте воду в паровой банке в состоянии энергичного кипения, чтобы пар при 100° C барботировал через массу среды в течение десяти минут, к концу этого времени достигается полное растворение желатина. Некоторое количество пара сконденсируется в виде воды в колбе со средой во время этого процесса — отсюда необходимость использования мясного экстракта двойной концентрации, — но если водяная баня будет кипеть, эта конденсация не превысит 100 куб. см.

6. Взвесьте колбу с содержимым; тогда (1115 [4] граммов + вес колбы) минус (вес колбы с содержимым) равно весу воды, необходимой для доведения объема до 1 литра. Добавление необходимого количества воды осуществляется следующим образом:

На одну чашку технических весов поместите противовес тарированной колбы (или эквивалентные ему гири) вместе с гирями, составляющими рассчитанный вес среды. На противоположную чашку поместите колбу с массой среды. Теперь добавляйте кипящую дистиллированную воду из промывалки, пока чашки не придут в точное равновесие.

7. Оттитруйте и оцените реакцию массы среды; проконтролируйте результат. Рассчитайте количество раствора соды, необходимое для доведения реакции массы среды до +10 (то есть рассчитайте для 1000 куб. см за вычетом количества, использованного для титрования).

8. Добавьте необходимое количество раствора соды и нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут для осаждения фосфатов и т. д.

9. Дайте массе среды остыть до 60° C. Хорошо взбейте белки двух яиц, добавьте к содержимому колбы и снова поместите в паровой стерилизатор при 100° C примерно на полчаса (пока яичный альбумин не свернется и не образует крупные плотные массы, плавающие на поверхности и внутри прозрачного желатина).

10. Профильтруйте через бумагу Шардена в стерильную колбу.

11. Разлейте в пробирки по 10 куб. см.

12. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд — то есть методом дробной стерилизации.

Питательный агар-агар. —

1. Взвесьте 2-литровую колбу и запишите вес — или точно уравновесьте ее.

2. Measure out double strength meat extract, 500 c.c., into the "tared"
flask.

3. Отвесьте и смешайте 10 граммов пептона, 5 граммов соли и 20 граммов порошкообразного агара, сделайте густую пасту со 150 куб. см дистиллированной воды и добавьте к мясному экстракту в колбе; поместите колбу на водяную баню.

4. Установите паровую баню и водяную баню, как уже было указано (для приготовления желатина) и показано на рисунке.

5. Пропускайте живой пар (при 100° C) через массу среды в течение двадцати пяти минут, к концу этого времени достигается полное растворение агара.

6. Теперь взвесьте колбу с содержимым; тогда (1035 [5] граммов + вес колбы) минус (вес колбы с содержимым) равно весу воды, необходимой для доведения объема среды до 1 литра. Добавьте необходимое количество (см. приготовление желатина, стр. 166, шаг 6).

7. Оттитруйте и оцените реакцию массы среды; проконтролируйте результат. Рассчитайте количество раствора соды, необходимое для доведения реакции массы среды до +10 (то есть рассчитайте для 1000 куб. см за вычетом количества, использованного для титрования).

8. Добавьте необходимое количество раствора соды и снова поместите в паровой стерилизатор на двадцать минут (для завершения осаждения фосфатов и т. д.).

9. Дайте массе среды остыть до 60° C. Хорошо взбейте белки двух яиц, добавьте к содержимому колбы и снова поместите в паровой стерилизатор при 100° C примерно на один час (пока яичный альбумин не свернется и не образует крупные плотные массы, плавающие на поверхности и внутри прозрачного агара).

10. Профильтруйте через бумагу Шардена, при необходимости используя воронку с горячей водой (рис. 101), в стерильную колбу.

11. Разлейте в пробирки по 10 или 15 куб. см.

12. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд — то есть методом дробной стерилизации.

Кровяная сыворотка (свернутая). —

1. Стерилизуйте цилиндрический стеклянный сосуд (рис. 109) и его крышку сухим жаром или путем промывания сначала эфиром, затем спиртом, и высушивания.

2. Соберите кровь на бойне от быка или овцы в стерильный цилиндр.

3. Дайте сосуду постоять пятнадцать минут, чтобы кровь свернулась. (Это необходимо сделать до ухода с бойни, иначе сыворотка окрасится гемоглобином.)

4. Отделите сгусток от стенок сосуда с помощью стерильной стеклянной палочки (выход сыворотки значительно меньше, если этого не сделать) и поместите цилиндр в ледник на двадцать четыре часа.

5. Удалите сыворотку стерильными пипетками или слейте ее через сифон и разлейте в стерильные пробирки (по 5 куб. см в каждую) или колбы.

6. Нагревайте пробирки с сывороткой до 56° C на водяной бане в течение получаса в течение двух дней подряд.

7. На третий день нагревайте пробирки в наклонном положении в аппарате для свертывания сыворотки до температуры около 72° C. (При этой температуре образуется сгусток, который довольно прозрачен; выше 72° C образуется плотный мутный сгусток.)

Fig. 109.—Blood-serum jar with wicker basket for
transport.

Аппарат для свертывания сыворотки (рис. 110) в своей простейшей форме представляет собой прямоугольный медный ящик с двойными стенками, закрытый неплотной стеклянной крышкой и обшитый войлоком или асбестом — пространство между стенками заполнено водой. Аппарат опирается на регулируемые ножки, чтобы сыворотку можно было затвердеть под любым желаемым углом, и нагревается снизу горелкой Бунзена, управляемой терморегулятором. Более сложные формы по форме напоминают сушильный шкаф (рис. 26) и снабжены регулируемыми полками, так что можно получить любой желаемый наклон поверхности сыворотки.

8. Поместите пробирки в термостат при 37° C на сорок восемь часов, чтобы исключить те, которые были загрязнены. Храните остальные в прохладном месте для будущего использования.

Альтернативный метод.

Шаги 1-5, как указано выше.

6. Стерилизуйте сыворотку дробным методом — то есть путем воздействия на водяной бане при температуре 56° C в течение получаса в течение шести дней подряд; храните в жидком состоянии.

7. Сверните в аппарате для свертывания сыворотки при необходимости.

Fig. 110.—Serum inspissator.

Сывороточная вода. —

Она составляет основу многих полезных сред и готовится следующим образом:

1. Соберите кровь на бойне (см. стр. 168) и, когда она плотно свернется, соберите всю выделившуюся сыворотку и измерьте в градуированном цилиндре.

2. На каждые 100 куб. см сыворотки добавьте 300 куб. см дистиллированной воды и смешайте в колбе.

3. Нагревайте смесь в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут. (Это разрушает любой диастатический фермент, присутствующий в сыворотке, и частично стерилизует жидкость.)

4. Профильтруйте, если смесь мутная.

5. Если она не нужна сразу, завершите стерилизацию сывороточной воды двумя последующими пропариваниями при 100° C в течение двадцати минут с интервалом в двадцать четыре часа.

Цитратный кровяной агар. Больница Гая. —

1. Умертвите небольшого кролика парами хлороформа и прикрепите его к доске (как для вскрытия); тщательно смочите шерсть 2-процентным раствором лизола.

2. Стерилизуйте несколько пар пинцетов, ножниц и т. д. путем кипячения.

3. Откиньте кожу с грудной клетки стерильными инструментами.

4. Вскройте грудную полость с помощью нового набора стерильных инструментов.

5. Вскройте перикард другим набором стерильных инструментов.

6. Прижгите поверхность левого желудочка раскаленным железом.

7. Возьмите стерильную капиллярную пипетку (рис. 13, c); отломите запаянный конец парой стерильных пинцетов.

8. Зафиксируйте сердце пинцетом и проткните кончиком пипетки стенку желудочка через прижженную область, примените всасывание к закрытому ватой концу пипетки и наполните ее кровью.

9. Перенесите все количество крови, собранной из сердца кролика, в небольшую колбу Эрленмейера, содержащую несколько стерильных стеклянных бусин и 5 куб. см концентрированного раствора цитрата натрия. (См. стр. 378.)

10. Тщательно перемешайте и отставьте на пару часов.

11. Расплавьте несколько пробирок с питательным агаром (см. стр. 167) и охладите до 42° C.

12. С помощью стерильной градуированной пипетки на 10 куб. см перенесите 1 куб. см цитратной крови из колбы Эрленмейера в каждую пробирку с разжиженным агаром. Вращайте пробирку между ладонями, чтобы равномерно распределить цитратную кровь по всему агару.

13. Поместите пробирки в наклонное положение и дайте среде застыть.

14. Поместите пробирки с кровяным агаром на сорок восемь часов в термостат при 37° C и по истечении этого времени удалите все загрязненные пробирки.

15. Храните оставшиеся стерильными пробирки для будущего использования.

Молоко. —

1. Налейте 1 литр свежего коровьего или козьего молока в большую делительную воронку и нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение одного часа.

2. Извлеките из стерилизатора и оцените реакцию молока (нормальное коровье молоко в среднем имеет +17). Если кислотность выше +20 или ниже +10, отбракуйте этот образец молока и используйте другую партию молока из другого источника.

Отбраковывайте молоко, в которое были добавлены антисептики в качестве консервантов.

3. Дайте молоку остыть, после чего жир или сливки поднимутся на поверхность и образуют толстый слой.

4. Слейте обезжиренное молоко, находящееся под слоем жира, в стерильные пробирки (по 10 куб. см в каждую).

5. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение пяти дней подряд.

6. Инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов и удалите все загрязненные пробирки. Храните остальные для будущего использования.

Лакмусовое молоко. —

1. Подготовьте молоко, как описано выше, разделы 1–3.

2. Слейте обезжиренное молоко, находящееся под слоем жира, в колбу.

3. Добавьте стерильный раствор лакмуса в количестве, достаточном для окрашивания молока в глубокий лавандовый цвет.

4. Разлейте в пробирки, стерилизуйте и т. д., как для молока.

Нутрозо-агар (Эйр). —

(Это модификация хорошо известной среды Дригальского-Конради, первоначально предложенной для выделения B. typhosus).

1. Соберите 250 куб. см совершенно свежей бычьей сыворотки (см. Кровяная сыворотка, стр. 168, шаги 1–5) и добавьте к ней 450 куб. см стерильной дистиллированной воды.

2. Weigh out agar powder, 20 grammes, and emulsify it with 250 c.c. of
the cold serum water.

3. Отвесьте

Witté's peptone10 grammes
Sodium chloride5 grammes
Nutrose10 grammes

и растворите в 200 куб. см сывороточной воды, нагретой до 80° C.

4. Смешайте агаровую эмульсию и пептонно-нутрозный раствор в «тарированной» колбе емкостью 2 литра и добавьте еще 100 куб. см сывороточной воды.

5. Завершите растворение различных ингредиентов путем барботирования живого пара через колбу, как при приготовлении питательного агара.

6. Добавьте еще 250 куб. см сывороточной воды.

7. Взвесьте колбу с содержимым: тогда (1045 граммов + вес колбы) минус (вес колбы с текущим содержимым) = вес жидкости, необходимой для доведения объема среды до 1 литра. Добавьте необходимое количество стерильной дистиллированной воды.

8. Оттитруйте и оцените реакцию массы среды. Затем стандартизируйте до реакции +2,5.

9. Осветлите яйцом и профильтруйте, как для питательного агара. (При осветлении после добавления яичного белка смесь должна находиться в паровом стерилизаторе полные два часа.)

10. После завершения фильтрации измерьте фильтрат и на каждые 150 куб. см среды добавьте:

Litmus solution (Kahlbaum)20 c.c.
Krystal violet aqueous solution (1:1000) (B. Hoechst)1.5 c.c.
Lactose1.5 grammes

11. Разлейте в пробирки по 15 куб. см.

12. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд — то есть методом дробной стерилизации в течение трех дней.

Яичная среда (Дорсет). —

1. Приготовьте 1000 куб. см 0,85-процентного раствора хлорида натрия в прочной 2-литровой колбе.

2. Стерилизуйте в автоклаве при 120° C в течение двадцати минут. Охладите до 20° C.

3. Возьмите 12 свежих яиц; промойте скорлупу сначала водой, затем неразбавленным формалином: дайте скорлупе высохнуть.

4. Разбейте яйца в стерильный градуированный цилиндр и измерьте общий объем смешанных белков и желтков. Добавьте одну часть стерильного физиологического раствора к трем частям смешанных яиц.

5. Перенесите эту смесь в большую бутыль с широким горлышком и пробкой, предварительно стерилизованную. Добавьте стерильные стеклянные бусины и тщательно встряхивайте в механическом шейкере около тридцати минут или взбейте венчиком для яиц.

6. Профильтруйте через грубую кисею в стерильную колбу.

Примечание. — Несколько капель спиртового раствора основного фуксина (достаточно, чтобы придать определенный розовый цвет) или несколько капель водостойких китайских чернил, добавленных в среду на этом этапе, облегчают последующий «вылов» колоний.

7. Разлейте в пробирки по 10 куб. см.

8. Затвердите в наклонном положении в аппарате для свертывания сыворотки при 75° C в течение одного часа.

9. Поместите пробирки на сорок восемь часов в термостат при 37° C и удалите все загрязненные пробирки.

Чтобы предотвратить высыхание, в каждую пробирку между шагами 8 и 9 можно добавить 0,5 куб. см глицеринового бульона (см. стр. 209).

10. Закройте те пробирки со средами, которые остались стерильными, резиновыми колпачками и храните для будущего использования.

Картофель. —

1. Выберите довольно крупные картофелины, хорошо их вымойте и очистите кожуру жесткой щеткой для ногтей.

2. Очистите от кожуры и удалите глазки.

3. Вырежьте цилиндры из самого длинного диаметра каждой картофелины с помощью выемки для яблок или большого пробкового сверла (то есть диаметром около 1,4 см).

Реакция свежего картофеля сильно кислая по отношению к фенолфталеину. Поэтому, если требуется, чтобы картофель имел реакцию, близкую к +10, как для культивирования некоторых вибрионов, цилиндры следует вымочить в 1-процентном растворе карбоната натрия в течение тридцати минут.

4. Разрежьте каждый цилиндр по диагонали от конца до конца, образуя две клиновидные части.

5. Поместите небольшой кусочек стерильной ваты, смоченной стерильной водой, на дно стерильной пробирки; вставьте картофельный клин в пробирку так, чтобы его основание опиралось на вату. Теперь закройте пробирку ватной пробкой (рис. 111).

6. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение пяти дней подряд.

Fig. 111.—Potato tube.

Примечание. — Пробковое сверло, предназначенное для нарезки картофельных цилиндров, должно быть посеребрено как внутри, так и снаружи, а нож, используемый для деления цилиндров, должен быть серебряным или посеребренным. При соблюдении этих мер предосторожности картофельные клинья сохранят свой белый цвет и не будут иметь обесцвечивания, которое так часто наблюдается при использовании стальных инструментов.

Пивное сусло. — Сусло в основном используется в качестве среды для культивирования дрожжей, плесневых грибов и т. д., как в жидкой форме, так и в твердой, полученной путем добавления желатина или агара. Сусло готовится следующим образом:

1. Отвесьте 250 граммов дробленого солода и поместите в 2-литровую колбу.

2. Добавьте 1000 куб. см дистиллированной воды, нагретой до 70° C, и закройте колбу резиновой пробкой.

3. Поместите колбу на водяную баню, отрегулированную на 60° C, и дайте мацерации продолжаться в течение одного часа.

4. Процедите через кисею в чистую колбу и нагревайте в паровом стерилизаторе в течение тридцати минут.

5. Профильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу.

6. Разлейте в пробирки по 10 куб. см или храните в колбах.

7. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Естественная реакция сусла не должна нарушаться.

Примечание. — Иногда удобнее получать «неохмеленное» [6] пивное сусло непосредственно с пивоварни. В этом случае его разбавляют равным количеством дистиллированной воды, пропаривают в течение часа, фильтруют, разливают в стерильные колбы или пробирки и стерилизуют методом дробной стерилизации.

Сусло-желатин. —

1. Measure out wort (prepared as above), 900 c.c., into a sterile flask.

2. Weigh out gelatine, 100 grammes (= 10 per cent.), and add it to the
wort in the flask.

3. Пропускайте живой пар через смесь в течение десяти минут, чтобы растворить желатин.

4. Охладите до 60° C; осветлите яйцом, как для питательного желатина (см. стр. 164).

5. Профильтруйте через бумагу Шардена.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для питательного желатина.

Сусло-агар. —

1. Measure out wort (as above), 700 c.c., into a sterile flask.

2. Отвесьте 20 граммов порошкообразного агара; разотрите в однородную пасту с 200 куб. см холодного сусла и добавьте к суслу в колбе.

3. Пропускайте живой пар через смесь в течение двадцати минут, чтобы растворить агар.

4. Охладите до 60° C; осветлите яйцом, как для питательного агара (см. стр. 167).

5. Профильтруйте через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для питательного агара.

Пептонная вода (Данхэм). —

1. Отвесьте 10 граммов пептона Витте и 5 граммов соли и эмульгируйте примерно с 250 куб. см дистиллированной воды, предварительно нагретой до 60° C.

2. Вылейте эмульсию в литровую колбу и доведите объем до 1000 куб. см добавлением дистиллированной воды.

3. Нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут.

4. Профильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу.

5. Разлейте в пробирки по 10 куб. см в каждую.

6. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

«Сахарные» или «углеводные» среды. —

Ранее способность бактерий вызывать гидролитические изменения в углеводных веществах наблюдалась только в связи с несколькими хорошо изученными сахарами, но в последние годы было показано, что при использовании лакмуса в качестве индикатора эти так называемые «реакции брожения» облегчают дифференциацию близкородственных видов, и список веществ, используемых в этой связи, был значительно расширен. Среды, приготовленные с ними, теперь больше не считаются специальными, а включены в «основные среды» лаборатории. Основными из этих веществ являются следующие, расположенные в соответствии с их химическим строением:

MonosaccharidesDextrose (glucose), lævulose, galactose, mannose, arabinose, xylose.
DisaccharidesMaltose, lactose, saccharose.
TrisaccharidesRaffinose (mellitose).
PolysaccharidesDextrin, inulin, starch, glycogen, amidon.
GlucosidesAmygdalin, coniferin, salicin, helicin, phlorrhizin.

Polyatomic alcoholsTrihydric, Glycerin.
Tetrahydric, Erythrite.
Pentahydric, Adonite.
Hexahydric, Dulcite, (dulcitol or melampirite), isodulcite (rhamnose), mannite (mannitol), sorbite (sorbitol), inosite.

Эти вещества следует приобретать у Kahlbaum (Берлин); в чистом виде и, по возможности, в виде крупных кристаллов, а метод приготовления среды, содержащей любое из них, можно проиллюстрировать на примере раствора декстрозы.

Раствор декстрозы. —

1. Отвесьте

Peptone20 grammes
Glucose10 grammes

и разотрите вместе в ступке; затем эмульгируйте в 100 куб. см дистиллированной воды, нагретой до 60° C.

2. Поместите в колбу и добавьте

Distilled water850 c.c.

3. Пропарьте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут, чтобы растворить пептон и глюкозу.

4. Добавьте

Kubel-Tiemann litmus solution (Kahlbaum)50 c.c.

(Перечисленные выше вещества реагируют кисло по отношению к фенолфталеину, но по-разному по отношению к нейтральному раствору лакмуса. К тем, которые реагируют кисло, очень осторожно добавляйте раствор n/1 гидрата натрия к среде в общем объеме, пока не вернется нейтральный оттенок).

5. Разлейте в пробирки, в которые предварительно были помещены перевернутые газовые пробирки Дарема.

6. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Примечание. — Ни в коем случае нельзя стерилизовать эти среды в автоклаве, так как температуры выше 100° C сами по себе вызывают гидролитические изменения в рассматриваемых веществах. Не менее важно не превышать двадцати минут при стерилизации, так как пренебрежение этой мерой предосторожности может обесцветить лакмус или привести к появлению желтоватых оттенков, когда пробирки впоследствии будут инокулированы кислотообразующими бактериями.

Нейтральный раствор лакмуса.

Наиболее удовлетворительным является раствор Кубеля-Тиманна, приготовленный Kahlbaum. Однако его можно приготовить в лаборатории следующим образом:

1. Отвесьте

Commercial litmus50 grammes,

и поместите в бутыль с хорошо притертой пробкой емкостью 500 куб. см; отмерьте и добавьте 300 куб. см 95-процентного спирта.

2. Хорошо встряхивайте не реже одного раза в день в течение семи дней — спирт приобретает зеленый цвет.

3. Слейте зеленый спирт, налейте в бутыль еще 300 куб. см 95-процентного спирта и повторите встряхивание.

4. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока при добавлении свежего спирта жидкость не будет окрашиваться лишь в фиолетовый цвет.

5. Слейте спирт, оставив лакмус как можно более сухим. Подсоедините бутыль к воздушному насосу и выпарьте последние следы спирта.

6. Перенесите сухой лакмус в литровую колбу, отмерьте 600 куб. см дистиллированной воды и оставьте в контакте на 24 часа при частом встряхивании.

7. Профильтруйте раствор в чистую колбу и добавьте одну или две капли чистой концентрированной серной кислоты, пока раствор лакмуса не станет отчетливо винно-красного цвета.

8. Добавьте избыток чистой твердой бариты и дайте постоять, пока реакция снова не станет щелочной.

9. Профильтруйте.

10. Пропускайте CO2 через раствор, пока реакция не станет определенно кислой.

11. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд. Это стерилизует раствор, а также удаляет углекислый газ, оставляя раствор нейтральным.

Среды для анаэробных культур. В дополнение к вышеуказанным средам, все из которых могут быть и используются при культивировании анаэробных бактерий, для этой цели обычно используются некоторые специальные среды, содержащие легко окисляющиеся вещества. Основными из них являются следующие:

Бульон с желчными солями (МакКонки). —

1. Отвесьте 20 граммов пептона Витте (= 2%) и эмульгируйте с 200 куб. см дистиллированной воды, предварительно нагретой до 60° C.

2. Отвесьте 5 граммов таурохолата натрия (коммерческого) (= 0,5%) и 5 граммов глюкозы (= 0,5%) и растворите в пептонной эмульсии.

3. Перенесите пептонную эмульсию в колбу с 800 куб. см дистиллированной воды и нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут.

4. Профильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу в стерильную колбу.

5. Добавьте стерильный раствор лакмуса в количестве, достаточном для окрашивания среды в глубокий пурпурный цвет, обычно требуется 13%.

6. Разлейте по 10 куб. см в пробирки, содержащие маленькие газовые пробирки (см. рис. 104, стр. 161). Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Глюкозо-формиатный бульон (Китасато). —

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page
163, sections 1 to 6).

2. Отвесьте 20 граммов глюкозы (= 2%) и 4 грамма формиата натрия (= 0,4%) и растворите в жидкости.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для бульона.

Глюкозо-формиатный желатин (Китасато). —

1. Приготовьте питательный желатин (см. стр. 164, разделы 1–7) и отмерьте 1000 куб. см.

2. Отвесьте 20 граммов глюкозы (= 2%) и 4 грамма формиата натрия (= 0,4%) и растворите в горячем желатине.

3. Профильтруйте через бумагу Шардена.

4. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для питательного желатина.

Глюкозо-формиатный агар (Китасато). —

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167, разделы 1–8). Отмерьте 1000 куб. см.

2. Weigh out glucose, 20 grammes (= 2 per cent.), sodium
formate, 4 grammes (= 0.4 per cent.), and dissolve in the
agar.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для питательного агара.

Сульфиндиготатный бульон (Вейль). —

1. Отмерьте 1000 куб. см питательного бульона (см. стр. 163, разделы 1–6).

2. Отвесьте 20 граммов глюкозы (= 2%) и 1 грамм сульфиндиготата натрия (= 0,1%) и растворите в жидкости.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для бульона.

Сульфиндиготатный желатин (Вейль). —

1. Приготовьте питательный желатин (см. стр. 164, разделы 1–7). Отмерьте 1000 куб. см.

2. Отвесьте 20 граммов глюкозы (= 2%) и 1 грамм сульфиндиготата натрия (= 0,1%) и растворите в горячем желатине.

3. Профильтруйте через бумагу Шардена.

4. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для питательного желатина.

Сульфиндиготатный агар. —

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167, разделы 1–8). Отмерьте 1000 куб. см.

2. Отвесьте 20 граммов глюкозы (= 2%) и 1 грамм сульфиндиготата натрия (= 0,1%) и растворите в горячем агаре.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте, как для питательного агара.

Примечание. — Сульфиндиготатные среды имеют синий цвет, который во время роста анаэробных бактерий окисляется и обесцвечивается до светло-желтого.

СНОСКИ:

[4] Эта цифра получена путем сложения: 1 литр воды, 1000 граммов; 10-процентный желатин, 100 граммов; 1-процентный пептон, 10 граммов; 0,5-процентная соль, 5 граммов; итого 1115 граммов. Модификации вышеуказанного процесса в отношении количеств и процентов потребуют соответствующих изменений цифр. Средний вес измеренного литра 10-процентного питательного желатина, приготовленного таким образом после фильтрации, составляет 1080 граммов.

[5] Эта цифра получена путем сложения: 1 литр воды (мясной экстракт), 1000 граммов; 2-процентный агар, 20 граммов; 1-процентный пептон, 10 граммов; 0,5-процентная соль, 5 граммов — итого 1035 граммов. Модификации процесса в отношении количеств или процентов потребуют соответствующих изменений в рассчитанной цифре среды. Средний вес измеренного литра 2-процентного агара, приготовленного таким образом после фильтрации, составляет 1010,5 граммов.

[6] «Охмеленное» сусло оказывает токсическое действие на многие бактерии, включая молочнокислые бактерии.

XII. СПЕЦИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ.

В этой главе собраны среды, которые были разработаны различными исследователями для специальных целей, сгруппированные под заголовками, указывающими на их основное назначение. Во многих случаях приводится имя автора среды, но без ссылки на его оригинальные инструкции, поскольку они во многих случаях неадекватны требованиям отдельного исследователя, который, вероятно, не смог бы воспроизвести среду в форме, дающей результаты, приписываемые ей автором. Поэтому были внесены такие модификации, которые способствуют единообразию между различными партиями сред.

Было включено значительное количество цветных сред, предназначенных главным образом для работы с кишечными бактериями; но, за исключением того факта, что модификация автором среды Дригальского-Конради была включена в число рутинных сред лаборатории, никаких комментариев относительно их относительной ценности не приводилось, поскольку только путем наблюдения и практики можно приобрести навыки, необходимые для использования их полной ценности.

Инструкции по стерилизации редко даются в полном объеме; необходимо выполнять рутинный метод воздействия в паровом стерилизаторе при 100° C (без давления) в течение двадцати минут в течение трех дней подряд для всех жидких сред и тридцати минут в течение трех дней подряд для всех разжижаемых или твердых сред; и только когда необходимо отступить от этих общих правил, приводятся дополнительные детали.

Среды для изучения химического состава бактерий.

Аспарагиновая среда (Ушинского). —

1. Отвесить и смешать

Asparagin3.4 grammes
Ammonium lactate10.0 grammes
Sodium chloride5.0 grammes
Magnesium sulphate0.2 gramme
Calcium chloride0.1 gramme
Acid potassium phosphate (KH2PO4)1.0 gramme

2. Растворить смесь в 1000 см³ дистиллированной воды.

3. Add glycerine, 40 c.c.

4. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Аспарагиновая среда (Френкеля и Фогеса). —

1. Отвесить и смешать

Asparagin4 grammes
Sodium phosphate, (Na2HPO4) 12OH2 grammes
Ammonium lactate6 grammes
Sodium chloride5 grammes

и растворить в

Distilled water1000 c.c.

2. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Примечание. — Любую из вышеуказанных аспарагиновых сред после добавления 10% желатина или 1,5% агара можно с успехом использовать в твердом состоянии.

Безбелковый бульон (Ушинского). —

1. Отвесить и смешать

Calcium chloride0.1 gramme
Magnesium sulphate0.2 gramme
Acid potassium phosphate (KH2PO4)2.0 grammes
Potassium aspartate3.0 grammes
Sodium chloride5.0 grammes
Ammonium lactate6.0 grammes

2. Растворить смесь в 1000 см³ дистиллированной воды.

3. Добавить 30 см³ глицерина.

4. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Среды для изучения биохимических реакций.

Среды, свободные от инозита — Бульон (Дарема). —

1. Prepare meat extract, 1000 c.c. (vide page 148), from bullock's
heart which has been "hung" for a couple of days.

2. Prepare nutrient bouillon (+10), 1000 c.c. (vide, page 161), from
the meat extract, and store in 1-litre flask.

3. Инокулировать бульон чистой культурой B. lactis aerogenes и инкубировать при 37° C в течение сорока восьми часов.

4. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут для уничтожения бацилл и некоторых продуктов их жизнедеятельности.

5. Определить реакцию среды и при необходимости довести ее до +10.

6. Инокулировать бульон чистой культурой B. coli communis и инкубировать при 37° C в течение сорока восьми часов.

7. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут.

Теперь наполнить бульоном две бродильные пробирки, подкрасить раствором лакмуса и стерилизовать; инокулировать культурой B. lactis aerogenes. Если кислота или газ не образуются, значит, бульон не содержит сахара; если же присутствуют кислота или газ, снова довести реакцию бульона в колбе до +10, повторно инокулировать одной из вышеупомянутых бактерий и инкубировать; затем снова провести проверку. Повторять это до тех пор, пока в среде не перестанут появляться кислота или газ при культивировании любой из указанных выше бацилл.

8. После последнего нагревания поставить колбу в прохладное место и дать росту осесть. Профильтровать надосадочную жидкость через шведскую фильтровальную бумагу. Если фильтрат мутный, профильтровать через фарфоровую фильтровальную свечу.

9. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как бульон.

Бульон, приготовленный описанным выше способом, будет абсолютно свободен от сахара; на его основе можно приготовить питательный безсахарный желатин или агар, растворив в нем требуемый процент желатина или агара соответственно и доведя среду до готовности согласно указаниям на страницах 166 и 167. Наиболее важное применение безсахарного бульона — использование его для приготовления сахарных бульонов (глюкозного, мальтозного, лактозного или сахарозного) с точным процентным содержанием компонентов.

Сахарный (декстрозный) бульон. —

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 163, sections 1
to 6) or sugar-free bouillon (vide supra).

2. Weigh out glucose (anhydrous), 20 grammes (= 2 per cent.), and
dissolve in the fluid.

3. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как бульон.

Обычная коммерческая глюкоза подходит для этой цели так же хорошо, но не рекомендуется, поскольку в процессе стерилизации она вызывает постепенное потемнение среды.

Примечание. — В некоторых случаях вместо глюкозы берется соответствующий процент лактозы, мальтозы или сахарозы.

Сахарный желатин. —

1. Приготовить питательный желатин (см. стр. 164, разделы 1–7). Отмерить 1000 см³.

2. Weigh out glucose, 20 grammes (= 2 per cent.), and dissolve in the
hot gelatine.

3. Профильтровать через бумагу Шардена.

4. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный желатин.

Сахарный агар. —

1. Приготовить питательный агар (см. стр. 167, разделы 1–8). Отмерить 1000 см³.

2. Weigh out glucose, 20 grammes (= 2 per cent.), and dissolve in the
clear agar.

3. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный агар.

Примечание. — Другие «сахарные» среды готовятся путем замены глюкозы соответствующим процентом лактозы, мальтозы (или любого другого вещества, упомянутого в разделе «Сахарные среды» на стр. 177).

Железистый бульон. —

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 141, sections 1
to 6).

2. Weigh out ferric tartrate, 1 gramme (= 0.1 per cent.), and dissolve
it in the bouillon.

3. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как бульон.

Примечание. — Вместо тартрата можно использовать лактат железа.

Свинцовый бульон. —

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 163, sections 1
to 6).

2. Weigh out lead acetate, 1 gramme (= 0.1 per cent.), and dissolve it
in the bouillon.

3. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как бульон.

Нитратный бульон. —

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 163, sections 1
to 6).

2. Weigh out potassium nitrate, 5 grammes (= 0.5 per cent.), and
dissolve it in the bouillon.

3. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как бульон.

Примечание. — Вместо нитрата калия можно использовать нитрат натрия или аммония, либо соль можно добавлять в пропорции от 0,1 до 1% для удовлетворения особых требований.

Железо-пептонный раствор (Пейкса). —

1. Weigh out peptone, 30 grammes, and emulsify it with 200 c.c. tap
water, previously heated to about 60°C.

2. Смыть эмульсию в литровую колбу 800 см³ водопроводной воды.

3. Weigh out salt, 5 grammes, and sodium phosphate, 3 grammes, and
dissolve in the mixture in the flask.

4. Нагревать смесь в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут для полного растворения пептона и профильтровать в чистую колбу.

5. Разлить по пробиркам порциями по 10 см³.

6. Добавить в каждую пробирку 0,1 см³ 2% нейтрального раствора тартрата железа. (Образуется желтовато-белый осадок.)

7. Стерилизовать так же, как питательный бульон.

Свинцово-пептонный раствор. —

Готовить так же, как железо-пептонный раствор, но в шаге 6 заменить на 0,1 см³ 1% нейтрального водного раствора ацетата свинца.

Нитратно-пептонный раствор (Пейкса). —

1. Отвесить 10 г пептона Витте и эмульгировать его в 200 см³ дистиллированной воды, свободной от аммиака и предварительно нагретой до 60° C.

2. Смыть эмульсию в колбу и довести объем до 1000 см³ дистиллированной водой, свободной от аммиака.

3. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут.

4. Weigh out sodium nitrate, 1 gramme, and dissolve in the contents of
the flask.

5. Профильтровать через шведскую фильтровальную бумагу.

6. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Лакмусовый бульон. —

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 163, sections 1
to 6).

2. Добавить достаточное количество стерильного раствора лакмуса, чтобы окрасить среду в темно-лавандовый цвет. (Среды с реакцией +10 обычно имеют очень слабощелочную или иногда нейтральную реакцию по лакмусу.)

3. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как бульон.

Пептонный раствор с розоловой кислотой. —

1. Отвесить 0,5 г розоловой кислоты (кораллина) и растворить ее в 100 см³ 80% спирта. Хранить как основной раствор.

2. Measure out peptone water (Dunham), 100 c.c., and rosolic acid
solution, 2 c.c., and mix.

3. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут.

4. Профильтровать через шведскую фильтровальную бумагу.

5. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Среда Капальди-Проскауэра № I. —

1. Отвесить и смешать

Sodium chloride2.0 grammes
Magnesium sulphate0.1 gramme
Calcium chloride0.2 gramme
Monopotassium phosphate2.0 grammes

2. Растворить в 1000 см³ воды в 2-литровой колбе

3. Отвесить и смешать

Asparagin2 grammes
Mannite2 grammes

и добавить к содержимому колбы.

4. Отмерить 25 см³ раствора и оттитровать его децинормальным раствором едкого натра, используя лакмус в качестве индикатора. Проверить результат и рассчитать количество едкого натра, необходимое для нейтрализации остальной части раствора по лакмусу. Добавить это количество едкого натра.

5. Профильтровать.

6. Добавить 47,5 см³ раствора лакмуса (= 5%).

7. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Среда Капальди-Проскауэра № II. —

1. Отвесить и смешать

Peptone20 grammes
Mannite1 gramme

2. Растворить в 1000 см³ воды в 2-литровой колбе.

3. Нейтрализовать по лакмусу, как в среде № I (см. выше, шаг 4).

4. Профильтровать.

5. Добавить 47,5 см³ раствора лакмуса (= 5%).

6. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Мочевые среды. Бульон. —

1. Собрать свежевыделенную мочу в стерильную колбу.

2. Поместить колбу в паровой стерилизатор при 100° C на тридцать минут.

3. Профильтровать через два слоя шведской фильтровальной бумаги.

4. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон. (Реакцию не изменять.)

Мочевой желатин. —

1. Собрать свежевыделенную мочу в стерильную колбу.

2. Измерить удельный вес, и если он выше 1010, разбавить стерильной водой до достижения этого показателя.

3. Определить (с контролем) при температуре кипения и отметить реакцию мочи.

4. Weigh out gelatine, 10 per cent., and add to the urine in the flask.

5. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение одного часа для растворения желатина.

6. Определить реакцию и добавить достаточное количество раствора едкого натра, чтобы восстановить реакцию всей массы среды до эквивалента исходной мочи.

7. Охладить до 60° C и осветлить яичным белком, как питательный желатин (см. стр. 166).

8. Профильтровать через бумагу Шардена.

9. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный желатин.

Мочевой желатин (Хеллер). —

1. Собрать свежевыделенную мочу в стерильную колбу.

2. Профильтровать через животный уголь для удаления части красящих веществ.

3. Измерить удельный вес, и если он выше 1010, разбавить стерильной водой до достижения этого показателя.

4. Add Witté's peptone, 1 per cent.; salt, 0.5 per cent.; gelatine, 10
per cent.

5. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение одного часа для растворения желатина и т. д.

6. Добавлять нормальный раствор едкого натра небольшими порциями и время от времени проверять реакцию лакмусовой бумагой, пока жидкость не станет слабощелочной.

7. Охладить до 60° C и осветлить яичным белком, как питательный желатин (см. стр. 166).

8. Профильтровать через бумагу Шардена.

9. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный желатин.

Мочевой агар. —

1. Собрать свежевыделенную мочу в стерильную колбу.

2. Измерить удельный вес, и если он выше 1010, разбавить стерильной водой до достижения этого показателя.

3. Отвесить 1,5% или 2% порошкообразного агара и добавить его к моче.

4. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение девяноста минут для растворения агара.

5. Охладить до 60° C и осветлить яичным белком, как питательный агар (см. стр. 168).

6. Профильтровать через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

7. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный агар.

(Реакцию не изменять.)

Сывороточно-сахарные среды (Хисс). —

В этих средах ферментация углеводных веществ под действием бактерий проявляется коагуляцией сывороточных белков в дополнение к образованию кислой реакции.

Сывороточно-декстрозная вода (Хисс). —

1. Отмерить в литровую колбу

Serum water (See page 170)1000 c.c.

2. Отвесить

Dextrose10 grammes

и растворить в сывороточной воде.

3. Профильтровать через шведскую фильтровальную бумагу.

4. Отмерить и добавить к среде

Litmus solution (Kahlbaum)50 c.c.

5. Разлить по пробиркам порциями по 10 см³ и стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Левулозу, галактозу, мальтозу, лактозу и т. д. можно заменить в аналогичных количествах декстрозой и довести среду до готовности, как указано выше.

Питательная жидкость Омелянского (для целлюлозоразлагающих бактерий). —

1. Отвесить и смешать

Potassium phosphate4.0 grammes
Magnesium sulphate2.0 grammes
Ammonium sulphate4.0 grammes
Sodium chloride0.25 gramme

2. Растворить в 4000 см³ дистиллированной воды.

3. Разлить по колбам порциями по 250 см³.

4. Отвесить и добавить по 5 г осажденного мела в каждую колбу.

5. Стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Среды для изучения хромогенных бактерий.

Молочный рис (Айзенберг). —

1. Measure out nutrient bouillon, 70 c.c., and milk, 210 c.c., and mix
thoroughly.

2. Weigh out rice powder, 100 grammes, and rub it up in a mortar with
the milk and broth mixture.

3. Заполнить пастой стерильные капсулы, распределяя ее так, чтобы образовался слой толщиной около 0,5 см по дну каждой.

4. Нагревать на водяной бане при 100° C до тех пор, пока смесь не затвердеет.

5. Закрыть капсулы крышками. Стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд.

(Таким образом получается твердая среда цвета кофе с молоком.)

Молочный рис (Сойка). —

1. Measure out nutrient bouillon, 50 c.c., and milk, 150 c.c., and mix
thoroughly.

2. Weigh out rice powder, 100 grammes, and rub it up in a mortar with
the milk and broth mixture.

3. Заполнить пастой стерильные капсулы, чтобы образовался слой по дну каждой.

4. Закрыть капсулы крышками.

5. Стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд.

(Таким образом образуется чисто-белая непрозрачная среда.)

Среды для изучения фосфоресцирующих и фотогенных бактерий.

Рыбный бульон. —

1. Weigh out herring, mackerel, or cod, 500 grammes, and place in a
large porcelain beaker (or enamelled iron pot).

2. Отвесить 26,5 г хлорида натрия, 0,75 г хлорида калия, 3,25 г хлорида магния и растворить в 500 см³ дистиллированной воды. Добавить раствор к рыбе в стакане.

3. Поместить стакан на водяную баню и действовать так же, как при приготовлении мясного экстракта, т. е. осторожно нагревать при 40° C в течение двадцати минут, затем быстро довести температуру до точки кипения и поддерживать ее в течение десяти минут.

4. Процедить смесь через муслин в чистую колбу.

5. Отвесить 5 г пептона и эмульгировать примерно с 200 см³ горячей рыбной воды; тщательно перемешать с остатком рыбной воды в колбе.

6. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут для полного растворения пептона.

7. Профильтровать через шведскую фильтровальную бумагу.

8. Когда рыбный бульон остынет, если он будет использоваться как жидкая среда, довести объем до 1000 см³ добавлением дистиллированной воды. Если же он будет использоваться в качестве основы для агаровых или желатиновых сред, хранить его в «двойной концентрации».

9. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

В качестве альтернативного метода вместо 500 г свежей рыбы можно использовать 16 г рыбного корма «Marvis».

Рыбный желатин. —

1. Measure out double strength fish bouillon, 500 c.c., into a "tared"
2-litre flask.

2. Add sheet gelatine, 100 grammes, cut into small pieces.

3. Пропускать живой пар через смесь в течение пятнадцати минут для растворения желатина.

4. Взвесить колбу с содержимым; довести вес до расчетного значения для одного литра среды (1135,5 г) добавлением дистиллированной воды при 100° C (см. стр. 166).

5. Охладить до температуры ниже 60° C и осветлить яичным белком.

6. Профильтровать через бумагу Шардена.

7. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный желатин.

После окончательной стерилизации хорошо встряхнуть для аэрации среды.

Рыбный желатин-агар. —

1. Weigh out powdered agar, 5 grammes, and emulsify it with 200 c.c.
double strength fish bouillon.

2. Смыть эмульсию в тарированную 2-литровую колбу 300 см³ рыбного бульона.

3. Weigh out sheet gelatine, 70 grammes, cut it into small pieces and
add it to the contents of the flask.

4. Пропускать живой пар через смесь для растворения желатина и агара.

5. Взвесить колбу с содержимым. Довести вес до расчетного значения для одного литра среды (1110,5 г) добавлением дистиллированной воды при 100° C (см. стр. 166).

6. Охладить до температуры ниже 60° C и осветлить яичным белком.

7. Профильтровать через бумагу Шардена.

8. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный желатин.

После окончательной стерилизации хорошо встряхнуть для аэрации среды.

Среды для изучения дрожжей и плесневых грибов.

Раствор Пастера. —

(Реакция щелочная).

1. Weigh out and mix the ash from 10 grammes of yeast; ammonium
tartrate, 10 grammes; cane sugar, 100 grammes.

2. Dissolve the mixture in distilled water, 1000 c.c.

3. Разлить по пробиркам или колбам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Дрожжевая вода (Пастер). —

1. Weigh out pressed yeast, 75 grammes; place in a 2-litre flask and add
1000 c.c. distilled water.

2. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут.

3. Профильтровать через бумагу Шардена.

4. Разлить по пробиркам или колбам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Раствор Кона. —

1. Отвесить и смешать

Acid potassium phosphate (KH2PO4)5.0 grammes
Calcium phosphate0.5 gramme
Magnesium sulphate5.0 grammes
Ammonium tartrate10.0 grammes

и растворить в

Distilled water1000 c.c.

2. Разлить по пробиркам или колбам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Раствор Негели. —

1. Отвесить и смешать

Dibasic potassium phosphate (K2HPO4)1.0 gramme
Magnesium sulphate0.2 gramme
Calcium chloride0.1 gramme
Ammonium tartrate10.0 grammes

и растворить в

Distilled water1000 c.c.

2. Разлить по пробиркам или колбам; стерилизовать так же, как питательный бульон.

Гипсовые диски. —

1. Взять большие пробки диаметром 2,5 см и обернуть каждую куском плотной бумаги для записей так, чтобы около сантиметра выступало над верхней поверхностью пробки, и закрепить булавкой (рис. 112).

2. Смешать гипс с дистиллированной водой до состояния густой пасты и заполнить этой пастой каждую пробковую форму.

3. Когда гипс застынет, снять бумагу с пробок и извлечь гипсовые диски.

4. Поместить гипсовые диски на лист асбеста и стерилизовать в сушильном шкафу при 150° C в течение получаса.

Fig. 112.—Cork and paper mould for plaster-of-Paris
disc.

5. Извлечь стерильные диски из шкафа с помощью стерильного пинцета, поместить каждый внутрь стерильной капсулы и смочить небольшим количеством стерильной воды.

6. Стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд.

Гипсовые блоки (Энгель и Хансен). —

Они имеют форму усеченных конусов, для их приготовления требуются небольшие жестяные формы диаметром 5,5 см у основания и 4 см у усеченной вершины. Высота (или глубина) формы составляет от 4,5 до 5 см.

1. Смешать порошкообразный прокаленный гипс с дистиллированной водой до состояния густой пасты.

2. Заполнить пастой формы и дать ей застыть и высохнуть на воздухе.

3. Извлечь блок из формы и перенести его в двойную стеклянную чашку подходящего размера (диаметром 7 см × высотой 7 см).

4. Стерилизовать блок в чашке в течение одного часа в сушильном шкафу при 115° C.

5. Осторожно открыть чашку и добавить стерильную дистиллированную воду, чтобы смочить блок и создать на дне чашки слой глубиной 1 см.

Виноградное сусло. — (Виноградное сусло получают с Сицилии в герметично закрытых банках в высококонцентрированном виде — в виде густого сиропа, но не стерилизованным.)

1. Weigh out "wine must," 200 grammes, place in a 2-litre flask and add
distilled water, 800 c.c.

2. Weigh out ammonium tartrate, 5 grammes, and add to the dilute must.

3. Поместить колбу на водяную баню, нагретую до 60° C, на один час и тщательно перемешать смесь частым встряхиванием.

4. Профильтровать через бумагу Шардена.

5. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Пшеничный бульон (Гасперини). —

1. Отвесить и смешать 150 г пшеничной муки, 0,5 г сульфата магния, 1 г нитрата калия, 15 г глюкозы.

2. Растворить смесь в 1000 см³ воды, нагретой до 100° C.

3. Профильтровать через бумагу Шардена.

4. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Хлебная паста. —

1. Мелко натереть черствый хлеб на терке.

2. Распределить крошки по стерильным колбам Эрленмейера так, чтобы они образовали слой толщиной около одного сантиметра по дну каждой.

3. Добавить столько дистиллированной воды, сколько крошки могут впитать, но не столько, чтобы покрыть хлеб.

4. Закрыть колбы пробками и стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение четырех дней подряд.

Среды для изучения паразитических плесневых грибов.

Французский агар Сабуро. —

1. Weigh out Chassaing's peptone, 10 grammes, and emulsify it with 200
c.c. distilled water previously heated to 60°C.

2. Weigh out powdered agar, 13 grammes, and emulsify with 200 c.c. cold
distilled water.

3. Смешать две эмульсии и смыть в тарированную 2-литровую колбу 600 см³ дистиллированной воды.

4. Пропускать живой пар через смесь в течение двадцати минут для растворения агара.

5. Охладить до 60° C и осветлить яичным белком, как питательный агар (см. стр. 168).

6. Профильтровать через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

7. Weigh out French maltose, 40 grammes, and dissolve in the agar.

8. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный агар.

Английский агар Блэксолла. — Заменить пептон Шассена пептоном Витте и действовать так же, как при приготовлении французского агара.

Французский маннитный агар Сабуро. — (Для культивирования возбудителя фавуса.)

Действовать точно так же, как при приготовлении французского агара (см. выше), заменив мальтозу маннитом (38 г).

Среды для изучения молочных бактерий.

Желатиновый агар. — Эта среда готовится путем добавления к питательному желатину достаточного количества агара для обеспечения твердости среды при инкубации при температурах выше 22° C. Если предполагается использовать температуру инкубации 30° C, необходимо растворить 10% желатина и 0,5% агара в мясном экстракте до добавления пептона и соли; для инкубации при 37° C необходимо использовать 12% желатина и 0,75% агара. Избегайте добавления большего количества агара, чем абсолютно необходимо, иначе действие на среду таких организмов, которые вырабатывают разжижающий фермент, может быть замедлено или полностью отсутствовать.

1. Measure out 400 c.c. double strength meat extract into a "tared"
2-litre flask, and add to it gelatine, 100 grammes.

2. Отвесить 5 г порошкообразного агара, эмульгировать со 100 см³ холодной дистиллированной воды и добавить к содержимому колбы.

3. Растворить агар и желатин, пропуская живой пар через колбу в течение двадцати минут.

4. Отвесить 10 г пептона, 5 г соли, эмульгировать со 100 см³ мясного экстракта двойной концентрации, предварительно нагретого до 60° C, и добавить к содержимому колбы.

5. Поместить обратно в паровой стерилизатор на пятнадцать минут. Затем довести вес до расчетного значения для одного литра (в данном случае 1120 г) добавлением дистиллированной воды при 100° C.

6. Определить реакцию; проверить результат. Затем добавить достаточное количество раствора едкого натра, чтобы довести реакцию до +10.

7. Поместить обратно в паровой стерилизатор при 100° C на двадцать минут.

8. Охладить до 60° C. Осветлить яичным белком, как питательный агар.

9. Профильтровать через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

10. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный агар.

Агаровый желатин (Гуарниари). —

1. Measure out double strength meat extract, 400 c.c., into a "tared"
2-litre flask, and add to it gelatine, 50 grammes.

2. Отвесить 3 г порошкообразного агара; эмульгировать с 50 см³ холодной дистиллированной воды и добавить к содержимому колбы.

3. Растворить агар и желатин, пропуская живой пар через колбу в течение двадцати минут.

4. Отвесить 25 г пептона Витте, 5 г соли, эмульгировать со 100 см³ мясного экстракта двойной концентрации, предварительно нагретого до 60° C, и добавить к содержимому колбы.

5. Поместить обратно в паровой стерилизатор на пятнадцать минут.

6. Взвесить колбу и довести массу среды до расчетного значения для одного литра (1083 г) добавлением дистиллированной воды при 100° C.

7. Тщательно нейтрализовать по лакмусовой бумаге последовательным добавлением небольших количеств нормального раствора соды.

8. Поместить обратно в паровой стерилизатор при 100° C на двадцать минут.

9. Охладить до 60° C. Осветлить яичным белком, как питательный агар.

10. Профильтровать через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

11. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный агар.

Сывороточный желатин. —

1. Свернуть свежее молоко, нагрев его до 60° C и добавив сычужный фермент; отфильтровать сыворотку в стерильную тарированную колбу.

2. Определить и отметить реакцию сыворотки.

3. Weigh out gelatine, 10 per cent., and add it to the whey in the
flask.

4. Пропускать живой пар через смесь в течение пятнадцати минут для растворения желатина; взвесить.

5. Определить реакцию массы среды; затем добавить достаточное количество раствора едкого натра, чтобы восстановить реакцию массы среды (т. е. общий вес минус вес колбы) до эквивалента исходной сыворотки.

6. Охладить до 60° C и осветлить яичным белком, как питательный желатин (см. стр. 166).

7. Профильтровать через бумагу Шардена.

8. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный желатин.

Сывороточный агар. —

1. Свернуть свежее молоко, нагрев его до 60° C и добавив сычужный фермент; отфильтровать сыворотку в стерильную колбу.

2. Отвесить 1,5% или 2% агара и добавить его к сыворотке в колбе.

3. Пропускать живой пар через смесь в течение двадцати минут для растворения агара.

4. Охладить до 60° C; осветлить яичным белком, как питательный агар (см. стр. 168).

5. Профильтровать через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

6. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный агар.

Лакмусовая сыворотка. —

1. Свернуть свежее молоко, нагрев его до 60° C и добавив сычужный фермент.

2. Отфильтровать сыворотку через муслин в стерильную колбу.

3. Нейтрализовать по лакмусу осторожным добавлением 4% раствора лимонной кислоты. (Не нейтрализовать минеральной кислотой.)

4. Нагревать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение одного часа для коагуляции всех белков.

(Если сыворотка мутная после извлечения из стерилизатора, дать ей постоять сорок восемь часов в леднике, а затем слить прозрачную жидкость или профильтровать через фильтровальную свечу Беркефельда.)

5. Профильтровать в стерильную колбу.

6. Подкрасить сыворотку раствором лакмуса до темно-пурпурно-красного цвета.

7. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как молоко.

Лакмусовая сыворотка (Петрушки). —

1. Отмерить в колбу

Fresh milk1000 c.c.

2. Добавить

Hydrochloric acid (or glacial acetic acid)1.5 c.c.

и прокипятить.

3. Отфильтровать свернувшийся казеин.

4. Нейтрализовать по лакмусу добавлением 1 н. раствора едкого натра и прокипятить. Сыворотка снова мутная и кислая.

5. Снова нейтрализовать по лакмусу добавлением 0,1 н. раствора едкого натра.

6. Профильтровать.

7. Подкрасить сыворотку нейтральным раствором лакмуса до темно-пурпурного цвета.

8. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как молоко.

Лакмусовый сывороточный желатин. —

1. Отмерить 1000 см³ молока в тарированную 2-литровую колбу.

2. Добавить 1,5 см³ соляной кислоты (или ледяной уксусной кислоты) и кипятить пять минут.

3. Отфильтровать казеин и сделать сыворотку слабощелочной по лакмусу.

4. Отвесить

Peptone10 grammes

и эмульгировать в нескольких кубических сантиметрах сыворотки, затем вернуть в колбу.

5. Отвесить

Gelatine50 grammes

добавить к сыворотке в колбе и перемешать смесь, пропуская живой пар.

6. Осветлить яичным белком и профильтровать.

7. Довести вес массы среды до расчетного значения для одного литра (1060 г) добавлением дистиллированной воды.

8. Отвесить

Dextrose15 grammes

и растворить в жидком сывороточном желатине.

9. Добавить стерильный раствор лакмуса до требуемого оттенка.

10. Разлить по пробиркам и стерилизовать в течение двадцати минут в паровом стерилизаторе при 100° C в течение пяти дней подряд.

Эта среда остается полужидкой при комнатной температуре и может использоваться для культур в холодном или горячем инкубаторе.

Лакмусовый сывороточный агар готовится аналогично сывороточному желатину, с заменой желатина 15 г агара.

Раствор солодового экстракта (Гершелл). —

1. Отмерить в колбу 1000 см³ дистиллированной воды.

2. Отвесить

Extractum malti (malt extract)25 grammes

и добавить к дистиллированной воде в колбе.

3. Кипятить пять минут, дать постоять и слить прозрачную жидкость с осадка.

4. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Среды для изучения почвенных бактерий, азотфиксаторов.

Агар с почвенными солями (Липман и Браун). — (Для подсчета почвенных организмов.)

1. Отмерить

Agar20 grammes.

Эмульгировать в 200 см³ дистиллированной воды.

2. Смыть агаровую эмульсию в тарированную 2-литровую колбу 400 см³ дистиллированной воды.

3. Отвесить

Peptone0.5 gramme.

Эмульгировать в 50 см³ дистиллированной воды и добавить к содержимому колбы.

4. Пропускать живой пар через смесь в течение двадцати минут для растворения агара.

5. Отвесить и смешать

Dextrose10.0 grammes.
Potassium phosphate0.5 gramme.
Magnesium sulphate0.2 gramme.
Potassium nitrate0.06 gramme.

и добавить к содержимому колбы.

6. Довести вес массы среды до расчетного значения для одного литра (1025 г) добавлением дистиллированной воды при 100° C.

7. Оттитровать массу среды и довести реакцию до +5.

8. Охладить до 60° C. Осветлить яичным белком и профильтровать.

9. Разлить по пробиркам порциями по 10 см³ и стерилизовать так же, как питательный агар.

Раствор Бейеринка I. — (Для культивирования азотфиксирующих организмов.)

1. Отвесить и смешать 1 г гидрофосфата калия, 0,2 г сульфата магния и 0,02 г хлорида натрия.

2. Растворить в 1000 см³ воды в 2-литровой колбе.

3. Добавить 1 см³ однопроцентного водного раствора сульфата железа.

4. Добавить 1 см³ однопроцентного раствора сульфата марганца.

5. Отвесить 20 г декстрозы и добавить к содержимому колбы (для различных организмов можно использовать до 40 г декстрозы).

6. Пропарить в течение двадцати минут, профильтровать.

7. Разлить по пробиркам и стерилизовать так же, как питательный бульон.

Раствор Бейеринка II. — (Для роста Azobacter.)

Действовать так же, как при приготовлении раствора № I, заменив декстрозу маннитом в шаге 5.

Раствор Виноградского (для нитрифицирующих организмов). —

1. Отвесить и смешать.

Potassium phosphate1.0 gramme
Magnesium sulphate0.5 gramme
Calcium chloride0.01 gramme
Sodium chloride2.0 grammes

и растворить в

Distilled water1000 c.c.

2. Разлить по колбам порциями по 20 см³ и добавить в каждую небольшое количество свежепромытого карбоната магния.

3. Стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

4. Add to each flask containing 20 c.c. solution, 2 c.c. of a sterile 2
per cent. solution of ammonium sulphate.

5. Инкубировать при 37° C в течение сорока восьми часов и удалить все загрязненные колбы с культурой. Остальное сохранить для дальнейшего использования.

Раствор Виноградского (для нитритных организмов). —

1. Отвесить и смешать

Ammonium sulphate1 gramme
Potassium sulphate1 gramme

и растворить в

Distilled water1000 c.c.

2. Добавить 5–10 г основного карбоната магния, предварительно стерилизованного кипячением.

3. Разлить по колбам и стерилизовать и т. д., как предыдущий раствор.

Силикатный гель (Виноградский). —

1. Отвесить и смешать

Ammonium sulphate0.40 gramme
Magnesium sulphate0.05 gramme
Calcium chloride0.01 gramme

и растворить в

Distilled water50 c.c.

Этикетка — Раствор A.

2. Отвесить и смешать

Potassium phosphate0.10 gramme
Sodium carbonate0.60 gramme

и растворить в

Distilled water50 c.c.

Этикетка — Раствор B.

3. Отвесить

Silicic acid3.4 grammes

и растворить в

Distilled water100 c.c.

4. Вылить раствор кремниевой кислоты в большую фарфоровую чашку.

5. Смешать равные количества растворов A и B; затем добавлять последовательно небольшими порциями смесь солей к раствору кремниевой кислоты, непрерывно помешивая стеклянной палочкой, пока не образуется гель достаточно твердой консистенции.

6. Распределить слой этого геля по дну каждой из нескольких больших капсул или «чашек».

7. Стерилизовать в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд.

Среды для изучения водных бактерий.

Питательный агар (Гессе и Ниднер). — (Для подсчета водных организмов.)

1. Отвесить: 12,5 г агара и эмульгировать в 250 см³ дистиллированной воды.

2. Смыть агаровую эмульсию в тарированную 2-литровую колбу еще 250 см³ дистиллированной воды.

3. Растворить, пропуская живой пар через смесь.

4. Эмульгируйте 7,5 г Naehrstoff-Heyden (альбумозы) в 200 мл холодной дистиллированной воды и добавьте к расплавленному агару.

5. Доведите массу среды до расчетного значения для одного литра (1020 г) путем добавления дистиллированной воды при температуре 100° C.

6. Осветлите яичным белком и отфильтруйте.

7. Разлейте в пробирки по 10 мл и стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Бульон с желчными солями — двойной концентрации.

1. Weigh out Witté's peptone, 40 grammes, and emulsify with 300 c.c.
distilled water previously warmed to 60° C.

2. Смойте пептонную эмульсию в литровую колбу 600 мл дистиллированной воды.

3. Отвесьте 10 г таурохолата натрия и 10 г глюкозы; растворите в 100 мл дистиллированной воды и добавьте к пептонной эмульсии в колбе.

4. Нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут.

5. Отфильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу в стерильную колбу.

6. Добавьте стерильный нейтральный раствор лакмуса в количестве, достаточном для окрашивания среды в глубокий пурпурный цвет.

7. Разлейте в небольшие колбы Эрленмейера по 25 мл.

8. Стерилизуйте так же, как питательный бульон.

Среды для изучения бактерий растений.

Beetroot.—}
Carrot.—} are prepared tubes and sterilised in a manner precisely
Turnip.—} similar to that described for potato.
Parsnip.—}

Сенной настой.

1. Weigh out dried hay, 10 grammes, chop it up into fine particles and
place in a flask.

2. Добавьте 1000 мл дистиллированной воды, нагретой до 70° C; закройте колбу плотной резиновой пробкой.

3. Мацерируйте на водяной бане при 60° C в течение трех часов.

4. Замените пробку ватной пробкой и нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение одного часа.

5. Отфильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный бульон.

Фасолевый бульон. (Для культивирования бактерий из клубеньков бобовых).

1. Отмерьте 1000 мл дистиллированной воды в 2-литровую колбу.

2. Отвесьте 250 г фасоли и добавьте к воде в колбе.

3. Отвесьте 10 г хлорида натрия и добавьте к содержимому колбы.

4. Добавьте 1 мл 1-процентного раствора бикарбоната натрия.

5. Поместите в паровой стерилизатор при 100° C на тридцать минут.

6. Отфильтруйте.

7. Отвесьте 20 г сахарозы и добавьте к фильтрату.

8. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный бульон.

Фасолевый агар.

1. Отмерьте 400 мл дистиллированной воды в тарированную 2-литровую колбу.

2. Отвесьте 15 г агара, смешайте со 100 мл холодной дистиллированной воды до состояния густой пасты и добавьте в колбу.

3. Растворите агар, пропуская острый пар через смесь, как при приготовлении питательного агара.

4. Отвесьте 250 г фасоли, поместите в колбу со смесью агара.

5. Добавьте 1 мл 1-процентного водного раствора бикарбоната натрия.

6. Отвесьте 10 г хлорида натрия и добавьте к содержимому колбы.

7. Поместите в паровой стерилизатор при 100° C на тридцать минут.

8. Доведите массу среды до 1030 г (значение на литр, полученное экспериментально) путем добавления дистиллированной воды при 100° C.

9. Охладите до 60° C, осветлите яйцом и отфильтруйте.

10. Отвесьте 20 г сахарозы и добавьте к содержимому колбы.

11. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар на древесной золе.

1. Отмерьте 400 мл дистиллированной воды в тарированную 2-литровую колбу.

2. Отвесьте 10 г агара и сделайте густую пасту со 100 мл холодной дистиллированной воды.

3. Добавьте эту агаровую пасту к дистиллированной воде в колбе.

4. Растворите агар, пропуская через него острый пар, как при приготовлении питательного агара.

5. Отвесьте 5 г чистой древесной золы и поместите во вторую колбу, содержащую 200 мл дистиллированной воды с несколькими стерильными стеклянными бусинами: тщательно встряхивайте в механическом шейкере в течение десяти минут.

6. Нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут.

7. После извлечения из стерилизатора тщательно вытрите внешнюю поверхность колбы, поместите ее над пламенем Бунзена и кипятите в течение одной минуты.

8. Отфильтруйте непосредственно в колбу, содержащую расплавленную агаровую смесь.

9. Отвесьте 4 г мальтозы. Добавьте к содержимому колбы.

10. Доведите массу среды до расчетного значения для одного литра (1019 г) путем добавления дистиллированной воды при 100° C.

11. Поместите колбу обратно в паровой стерилизатор на двадцать минут, охладите до 60° C, осветлите яйцом и отфильтруйте.

12. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Среды для изучения специальных бацилл.

B. Acnes.

Агар с олеиновой кислотой (Флеминг).

1. Отмерьте в стерильную толстостенную стеклянную бутыль, в которой уже содержится около 10 стерильных стеклянных бусин

Ascitic fluid250 c.c.

2. Отвесьте

Oleic acid25 grammes

и добавьте к асцитической жидкости в бутыли.

3. Равномерно эмульгируйте путем встряхивания (вручную или в шейкере) в течение десяти минут.

4. Расплавьте и отмерьте в колбу

Nutrient agar750 c.c.

затем охладите до 55° C.

5. Смешайте эмульсию олеиновой кислоты с агаром.

6. Add 10 c.c. sterile neutral red, 1 per cent. aqueous solution.

7. Разлейте в пробирки по 10 мл, наклоните и дайте застыть.

8. Инкубируйте в течение сорока восьми часов при 37° C и отбракуйте все загрязненные пробирки. Храните стерильные пробирки для дальнейшего использования.

Группа кишечно-тифозных бактерий.

Бульон Париетти.

1. Отмерьте 4 мл чистой соляной кислоты и добавьте к ней 100 мл раствора карболовой кислоты (5-процентного). Дайте раствору постоять по крайней мере несколько дней перед использованием.

2. Этот раствор добавляется в количествах 0,1, 0,2 и 0,3 мл (с помощью стерильной градуированной пипетки) в пробирки, каждая из которых содержит 10 мл предварительно стерилизованного питательного бульона (см. стр. 163).

3. Инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов для удаления загрязненных пробирок. Храните остаток для дальнейшего использования.

Карболизованный бульон.

1. Приготовьте питательный бульон (см. стр. 163, разделы с 1 по 6). Отмерьте 1000 мл.

2. Отвесьте 1 г карболовой кислоты (для специальных целей может потребоваться 2,5 или 5 г) и растворите ее в среде.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как бульон.

Карболизованный желатин.

1. Приготовьте питательный желатин (см. стр. 164, разделы с 1 по 7). Отмерьте 1000 мл.

2. Weigh out carbolic acid, 5 grammes (= 0.5 per cent.), and dissolve it
in the gelatine.

3. При необходимости отфильтруйте через бумагу Шардена.

4. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный желатин.

Один или 2,5 г карболовой кислоты (= 0,1% или 0,25%) иногда используются вместо 5 г для удовлетворения особых требований.

Карболизованный агар.

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167, разделы с 1 по 8). Отмерьте 1000 мл.

2. Отвесьте 1 г чистого фенола и растворите в среде.

3. При необходимости отфильтруйте через бумагу Шардена.

4. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Лакмусовый желатин.

1. Приготовьте питательный желатин (см. стр. 164, разделы с 1 по 8).

2. Добавьте стерильный раствор лакмуса в количестве, достаточном для окрашивания среды в глубокий лавандовый цвет.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный желатин.

Лактозо-лакмусовый бульон (Lakmus Molke).

1. Weigh out peptone, 4 grammes, and emulsify it with 200 c.c. meat
extract (vide page 148), previously heated to 60°C.

2. Weigh out salt, 2 grammes, and lactose, 20 grammes, and mix with the
emulsion.

3. Смойте смесь в стерильную литровую колбу 200 мл мясного экстракта и добавьте 600 мл дистиллированной воды.

4. Нагревайте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут, чтобы полностью растворить пептон и т. д.

5. Тщательно нейтрализуйте по лакмусовой бумаге путем последовательного добавления небольших количеств децинормального раствора соды.

6. Поместите обратно в паровой стерилизатор на двадцать минут для осаждения фосфатов и т. д.

7. Отфильтруйте через два слоя шведской фильтровальной бумаги.

8. Добавьте стерильный раствор лакмуса в количестве, достаточном для окрашивания среды в глубокий пурпурный цвет.

9. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как бульон.

Лактозо-лакмусовый желатин (Вюрц).

1. Приготовьте питательный желатин (см. стр. 164, разделы с 1 по 4).

2. Доведите реакцию среды до -5.

3. Поместите обратно в паровой стерилизатор при 100° C на двадцать минут.

4. Осветлите яйцом, как для желатина.

5. Weigh out lactose, 20 grammes (= 2 per cent.), and dissolve it in the
medium.

6. Отфильтруйте через бумагу Шардена.

7. Добавьте достаточное количество стерильного раствора лакмуса, чтобы окрасить среду в бледно-лавандовый цвет.

8. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный желатин.

Лактозо-лакмусовый агар (Вюрц).

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167, разделы с 1 по 4).

2. Доведите реакцию среды до -5.

3. Поместите обратно в паровой стерилизатор при 100° C на двадцать минут.

4. Охладите до 60° C и осветлите яйцом, как для питательного агара.

5. Weigh out lactose, 20 grammes (= 2 per cent.), and dissolve it in the
medium.

6. Отфильтруйте через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

7. Добавьте стерильный раствор лакмуса в количестве, достаточном для окрашивания среды в бледно-лавандовый цвет.

8. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Глицериновый картофельный бульон.

1. Возьмите 1 кг картофеля, тщательно промойте в воде, очистите и мелко натрите на терке для хлеба.

2. Взвесьте картофельную массу, поместите ее в 2-литровую колбу и добавьте дистиллированную воду в пропорции 1 мл на каждый грамм массы картофеля. Оставьте колбу в холодильнике на двенадцать часов.

3. Процедите смесь через марлю и отфильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу в мерный цилиндр. Отметьте количество фильтрата.

4. Поместите фильтрат в колбу, добавьте равное количество дистиллированной воды и нагревайте в паровом стерилизаторе в течение шестидесяти минут.

5. Add glycerine, 4 per cent., mix thoroughly, and again filter.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный бульон.

Картофельный желатин (Эльснер).

1. Возьмите 1 кг картофеля, тщательно промойте в воде, очистите и, наконец, мелко натрите на терке для хлеба.

2. Взвесьте картофельную массу, поместите ее в 2-литровую колбу и добавьте дистиллированную воду в пропорции 1 мл на каждый грамм массы картофеля. Оставьте колбу в холодильнике на двенадцать часов.

3. Процедите смесь через марлю и отфильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу в мерный цилиндр.

4. Добавьте 15-процентный желатин к картофельному отвару и пропустите острый пар через смесь в течение десяти минут.

5. Оцените реакцию; доведите реакцию среды до +25.

6. Охладите среду ниже 60° C; осветлите яйцом, как для питательного желатина (см. стр. 166).

7. Добавьте 1-процентный йодид калия (порошкообразный) в среду.

8. Отфильтруйте через бумагу Шардена.

9. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный желатин.

Эскулиновый агар. (B. coli и родственные организмы дают черные колонии, окруженные черным ореолом).

1. Отмерьте 400 мл дистиллированной воды в тарированную 2-литровую колбу.

2. Отвесьте

Agar15 grammes
Peptone10 grammes
Sodium taurocholate5 grammes

и сделайте густую пасту со 150 мл дистиллированной воды.

3. Добавьте эту пасту к дистиллированной воде в колбе.

4. Растворите ингредиенты, пропуская острый пар через смесь.

5. Отвесьте

Aesculin1.0 gramme
Ferric citrate0.5 gramme

и растворите во второй колбе, содержащей 100 мл дистиллированной воды.

6. Смешайте содержимое двух колб — доведите массу до расчетного значения среды (в данном случае 1031,5 г) путем добавления дистиллированной воды при 100° C.

7. Осветлите яйцом и отфильтруйте.

8. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар с желчными солями (МакКонки).

1. Weigh out powdered agar, 15 grammes (= 1.5. per cent.), and emulsify
with 200 c.c. cold tap water.

2. Weigh out peptone, 20 grammes (= 2 per cent.), and emulsify with 200
c.c. tap water previously warmed to 60°C.

3. Тщательно смешайте пептонную и агаровую эмульсии.

4. Отвесьте 5 г таурохолата натрия (= 0,5%), растворите его в 300 мл водопроводной воды и используйте этот раствор для смывания агарово-пептонной эмульсии в тарированную 2-литровую колбу.

5. Пропускайте острый пар через смесь в течение двадцати минут.

6. Доведите массу среды до расчетного значения для одного литра (1040 г).

7. Охладите до 60° C и осветлите яйцом, как для питательного агара (см. стр. 168).

8. Отфильтруйте через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

9. Weigh out lactose, 10 grammes (= 1 per cent.), and dissolve it in the
agar.

При желании добавьте 5 мл 1-процентного (= 0,5%) водного раствора нейтрального красного.

10. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар с лакмусом и нутрозой (Дригальский-Конради).

Эта среда должна быть приготовлена точно так же, как нутрозный агар, описанный на стр. 172, с заменой сывороточной воды на мясной экстракт и увеличением процентного содержания агара, добавляемого на литр, до 3 процентов.

Фуксиновый агар (Браун).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу:

Nutrient agar1000 c.c.

2. Отвесьте: 10 г лактозы и растворите в жидком агаре.

3. Доведите реакцию до -5 и отфильтруйте.

4. Отмерьте и тщательно смешайте с агаром:

Fuchsin, alcoholic solution5 c.c.

Раствор фуксина готовится путем смешивания:

Fuchsin (basic)3 grammes.
Absolute alcohol60 c.c.

Дайте постоять двадцать четыре часа, затем тщательно центрифугируйте и слейте надосадочную жидкость в бутыль с плотной пробкой.

5. Measure out and add to the nutrient agar, sodium sulphite, 10 per
cent. aqueous solution, freshly prepared 25 c.c.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

7. Храните в темном шкафу.

Фуксин-сульфитный агар (Эндо).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу:

Nutrient agar1000 c.c.

2. Отвесьте

Lactose10 grammes.

и растворите в жидком агаре.

3. Доведите реакцию до +3 и отфильтруйте.

4. Отмерьте и тщательно смешайте с жидким агаром.

Fuchsin, alcoholic solution (vide supra)5 c.c.

5. Отмерьте и добавьте к среде

Sodium sulphite, 10 per cent. aqueous solution25 c.c.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар с бриллиантовым зеленым (Конради).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу

Nutrient agar1000 c.c.

2. Доведите реакцию до +30 путем добавления нормальной фосфорной кислоты; и отфильтруйте.

3. Отмерьте и тщательно смешайте с жидкой средой

Brilliant green (Hoechst) 1 per thousand aqueous solution6.5 c.c.

4. Отмерьте и добавьте к среде

Picric acid (Gruebler), 1 per cent. aqueous solution6.5 c.c.

5. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар с бриллиантовым зеленым и желчными солями (Фокус).

1. Отвесьте 20 г агара и эмульгируйте в 100 мл холодной дистиллированной воды.

2. Смойте эмульсию в тарированную 2-литровую колбу 500 мл дистиллированной воды.

3. Растворите агар, пропуская острый пар через колбу.

4. Охладите, осветлите яйцом и отфильтруйте.

5. Отвесьте

Sodium taurocholate5 grammes
Peptone20 grammes

и добавьте к среде в колбе.

6. Отвесьте

Lactose5 grammes

и добавьте к среде в колбе.

7. Доведите реакцию до +15 и при необходимости отфильтруйте.

8. Отмерьте

Brilliant green, 1 per thousand aqueous solution20 c.c.

и тщательно смешайте с жидким агаром.

9. Отмерьте и добавьте к среде

Picric acid, 1 per cent. aqueous solution20 c.c.

10. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар с китайским зеленым (Вербицкий).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу

Nutrient agar1000 c.c.

2. Точно доведите реакцию до +13 и отфильтруйте.

3. Отмерьте и тщательно смешайте с жидким агаром

China green 0.2 per cent. aqueous solution15 c.c.

4. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Агар с малахитовым зеленым (Леффлер).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу

Nutrient agar1000 c.c.

2. Отвесьте

Dextrose10 grammes.

и растворите в питательном агаре.

3. Доведите реакцию до +3 и отфильтруйте.

4. Отмерьте и тщательно смешайте в жидком агаре

Malachite green, 0.1 per cent. aqueous solution16 c.c.
for "weak" medium.

4a. К отфильтрованному агару добавьте

Malachite green, 2 per cent. aqueous solution25 c.c.
for "strong" medium.

5. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Двусахарный агар (Рассел).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу

Nutrient agar1000 c.c.

2. Добавьте 100 мл раствора лакмуса к жидкому агару.

3. Отвесьте и растворите в жидком агаре.

Lactose10 grammes
Dextrose10 grammes.

4. Сделайте реакцию среды нейтральной по лакмусовой бумаге путем осторожного добавления нормальной едкой щелочи.

5. Разлейте в пробирки по 10 мл и стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

6. Храните для использования в прохладном темном месте.

B. Diphtheriæ.

Глицериновая кровяная сыворотка.

1. Приготовьте кровяную сыворотку, как описано на стр. 168, разделы с 1 по 4.

2. Добавьте 5-процентный чистый глицерин.

3. Завершите приготовление, как описано выше для обычной кровяной сыворотки, разделы с 5 по 7.

Примечание. Для специальных целей используются различные процентные содержания глицерина — от 4% до 8%. Пять процентов — это обычно используемая концентрация.

Кровяная сыворотка (Леффлер).

1. Приготовьте питательный бульон (см. стр. 163), используя мясной экстракт, приготовленный из телятины вместо говядины.

2. Добавьте 1-процентную глюкозу к бульону и дайте ей полностью раствориться.

3. Теперь добавьте 300 мл прозрачной кровяной сыворотки (см. стр. 168, разделы с 1 по 4) на каждые 100 мл этого бульона.

4. Разлейте в стерильные пробирки и завершите приготовление, как для обычной кровяной сыворотки.

Кровяная сыворотка (Лоррен Смит).

1. Соберите кровяную сыворотку (см. стр. 168, разделы с 1 по 4), по возможности свободную от гемоглобина.

2. Отвесьте 0,15% гидрата натрия и растворите его в жидкости (или добавьте 0,375 мл деканармального раствора соды на каждые 100 мл сыворотки).

3. Разлейте в пробирки и затвердите при 100° C в сывороточном инсписсаторе.

4. Инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов для удаления загрязненных пробирок. Храните остаток для дальнейшего использования.

Кровяная сыворотка (Кансилмен и Мэллори).

1. Соберите кровяную сыворотку на бойне, коагулируйте, удалите сыворотку и разлейте в пробирки (см. стр. 168).

Необходимо соблюдать большую осторожность, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха — действительно, если за один раз наполняется лишь несколько пробирок, хороший способ — поставить их вертикально в приемник воздушного насоса и откачать воздух как можно полнее перед переносом в сывороточный инсписсатор.

2. Нагревайте пробирки в наклонном положении в сухожаровом стерилизаторе при 90° C до полного затвердевания, скажем, полчаса.

3. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение 20 минут в течение трех дней подряд.

Полученная среда не прозрачная, а непрозрачная и твердая.

B. Tuberculosis.

Яичная среда (Лубенау).

Эта модификация яичной среды Дорсета (см. стр. 174) предпочтительнее для некоторых для роста туберкулезной палочки человеческого типа. Она заключается в добавлении одной части 6-процентного глицерина в нормальном физиологическом растворе к яичной смеси между этапами 4 и 5.

Глицериновый бульон.

1. Measure out nutrient bouillon, 1000 c.c. (vide page 163, sections 1
to 6).

2. Measure out glycerine, 60 c.c. (= 6 per cent.), and add to the
bouillon.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как бульон.

Глицериновый агар.

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167, разделы с 1 по 8). Отмерьте 1000 мл.

2. Measure out pure glycerine, 60 c.c. (= 6 per cent.), and add to the
agar.

3. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Глицериновая кровяная сыворотка.

1. Приготовьте кровяную сыворотку, как описано на стр. 168, разделы с 1 по 4.

2. Добавьте 5-процентный чистый глицерин.

3. Завершите приготовление, как описано выше для обычной кровяной сыворотки, разделы с 5 по 7.

Примечание. Для специальных целей используются различные процентные содержания глицерина — от 4% до 8%. Пять процентов — это обычно используемая концентрация.

Глицеринизированный картофель.

1. Приготовьте обычные картофельные клинья (см. стр. 174, разделы с 1 по 4).

2. Замочите клинья в 25-процентном растворе глицерина на пятнадцать минут.

3. Увлажните ватные тампоны на дне картофельных пробирок 25-процентным раствором глицерина.

4. Вставьте клин картофеля в каждую пробирку и снова закройте пробирки.

5. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение пяти дней подряд.

Среды из тканей животных (Фругони).

1. Возьмите несколько стерильных пробирок 16 × 3 или 4 см, закрытых ватными пробками, и в каждую вставьте отрезок толстой стеклянной трубки длиной 2 см (диаметром около 1 см); заполните глицериновым (6-процентным) бульоном до верхнего уровня стеклянной трубки. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

2. Убейте небольшого кролика с помощью паров хлороформа.

3. При строгом соблюдении асептики извлеките легкие, печень и другие плотные органы и перенесите их в стерильную двойную стеклянную чашку.

4. С помощью стерильных ножниц и пинцета разделите органы на прямоугольные блоки размером примерно 3 × 1,5 × 1 см.

5. Налейте в чашку достаточное количество стерильного раствора глицерина (6-процентного в нормальном физиологическом растворе), накройте и оставьте на один час.

6. Введите блок ткани в каждую пробирку так, чтобы он опирался на верхний конец стеклянной трубки. (Поверхность ткани теперь будет оставаться влажной за счет капиллярного притяжения и конденсации).

7. Стерилизуйте в автоклаве при 120° C в течение тридцати минут.

8. Закройте пробирки колпачками и храните их в холодильнике для дальнейшего использования.

Ткани, полученные при вскрытии, также могут быть использованы после предварительной стерилизации кипячением или автоклавированием.

Среды для изучения специальных кокков.

Diplococcus GonorrhϾ.

Асцитический бульон (сывороточный бульон).

1. Соберите асцитическую жидкость (плевральную жидкость, жидкость при гидроцеле и т. д.) путем аспирации непосредственно в стерильные колбы при строгом соблюдении асептики.

2. Смешайте сыворотку с двойным объемом стерильного питательного бульона (см. стр. 163).

3. Если считается необходимым (из-за наличия крови, кристаллов и т. д.), отфильтруйте сывороточный бульон через фарфоровую фильтровальную свечу.

4. Разлейте в пробирки и стерилизуйте на водяной бане при 56° C в течение получаса в течение пяти дней подряд.

5. Инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов и удалите загрязненные пробирки. Храните остаток для дальнейшего использования.

Сывороточный агар (Гейман).

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167) по следующей формуле:

Agar2.0 per cent.
Peptone1.5 per cent.
Salt0.5 per cent.
Meat extractquantum sufficit.

2. Доведите реакцию среды до +10.

3. Отфильтруйте; разлейте в пробирки по 6 мл.

4. Стерилизуйте так же, как питательный агар.

5. После третьей стерилизации охладите пробирки до 42° C и добавьте в каждую 3 мл стерильной жидкости гидроцеле, асцитической жидкости или плеврального выпота (предварительно стерилизованных, при необходимости, дробным методом); дайте пробиркам застыть в наклонном положении.

6. После застывания инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов и удалите все загрязненные пробирки. Храните остаток для дальнейшего использования.

Сывороточный агар (Вертхаймер).

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167) по следующей формуле:

Agar2.0 per cent.
Peptone2.0 per cent.
Salt0.5 per cent.
Meat extractquantum sufficit.

2. Доведите реакцию среды до +10.

3. Отфильтруйте; разлейте в пробирки по 5 мл.

4. Стерилизуйте так же, как питательный агар.

5. После последней стерилизации охладите до 42° C, затем добавьте 5 мл стерильной кровяной сыворотки из человеческой плаценты (стерилизованной, при необходимости, дробным методом) в каждую пробирку; наклоните пробирки.

6. После застывания инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов и удалите все загрязненные пробирки. Храните остаток для дальнейшего использования.

Сывороточный агар (Кантаке и Стивенс).

1. Соберите асцитическую, плевральную или гидроцельную жидкость в стерильные колбы и оставьте в холодильнике на двенадцать часов для осаждения.

2. Слейте 1000 мл прозрачной жидкости в мерный цилиндр и перенесите в стерильную литровую колбу.

3. Добавьте 0,5 мл деканармального раствора NaOH на каждые 100 мл сыворотки (т. е. 5,0 мл) и тщательно перемешайте.

4. Нагревайте в паровом стерилизаторе в течение двадцати минут.

5. Отвесьте 15 г агара, эмульгируйте в отдельной емкости с 200 мл щелочной жидкости, предварительно охлажденной примерно до 20° C, а затем добавьте к остатку жидкости в колбе.

6. Пропускайте острый пар через смесь в течение двадцати минут, чтобы растворить агар.

7. Отфильтруйте через бумагу Шардена, используя воронку с горячей водой.

8. Отвесьте 10 г глюкозы (= 1%) и растворите ее в прозрачном агаре.

8a. If desired, add glycerine, 5 per cent., to the clear agar.

9. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Сывороточный агар (Либман).

1. Приготовьте питательный агар (см. стр. 167), используя, однако, 1,5-процентный пептон (то есть 15 г на литр вместо 10 г).

2. Доведите реакцию до 0 (т. е. нейтральную по фенолфталеину).

3. Отфильтруйте и перенесите 1000 мл расплавленной среды в стерильную колбу.

4. Отвесьте 20 г декстрозы и растворите в жидком агаре.

5. Разлейте в пробирки по 6 мл; и стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут в течение трех дней подряд.

6. После третьей стерилизации охладите до 42° C и добавьте в каждую пробирку 3 мл стерильной жидкости гидроцеле, асцитической жидкости или плеврального выпота (предварительно стерилизованных, при необходимости, дробным методом); дайте пробиркам застыть в наклонном положении.

7. После застывания инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов и удалите все загрязненные пробирки. Храните остаток для дальнейшего использования.

Яичный альбумин, сгущенный.

1. Разбейте несколько свежих яиц (куриных, утиных или индюшачьих) и соберите «белки» в мерный цилиндр, стараясь избежать смешивания с желтками.

2. Добавьте 40-процентную дистиллированную воду и тщательно перемешайте смесь с помощью венчика для яиц.

3. Отвесьте 0,15% гидрата натрия и растворите его в жидкости (или добавьте количество деканармального раствора едкой щелочи, рассчитанное на получение необходимого процента щелочи в общем объеме жидкости — т. е. 0,375 мл деканармального раствора NaOH на 100 мл смеси).

3a. При желании теперь можно добавить глюкозу в количестве от 1 до 2 процентов.

4. Процедите смесь через марлю и отфильтруйте через фарфоровую фильтровальную свечу в стерильную колбу для фильтрования.

5. Разлейте в пробирки и затвердите при 100° C в сывороточном инсписсаторе.

6. Инкубируйте при 37° C в течение сорока восьми часов и удалите все загрязненные пробирки; храните остаток для дальнейшего использования.

Яичный альбумин (Тарханов и Колесников).

1. Поместите неповрежденные куриные яйца в деканармальный раствор едкой щелочи на десять дней. (По истечении этого времени белок становится твердым, как желатин).

2. Осторожно удалите скорлупу и нарежьте яйцо тонкими ломтиками.

3. Промывайте в течение двух часов в проточной воде.

4. Поместите ломтики яйца в большой стакан и стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение одного часа.

5. Перенесите каждый ломтик яйца с помощью пары стерилизованных пинцетов в чашку Петри или большую капсулу.

6. Стерилизуйте в паровом стерилизаторе при 100° C в течение двадцати минут в течение трех дней подряд.

Бульон с яичным альбумином (Липшюц).

1. Отвесьте

Egg albumin (extra fine powder, Merck).4 grammes

и поместите в 2-литровую колбу с несколькими стерильными стеклянными бусинами.

2. Отмерьте 200 мл дистиллированной воды в полулитровую колбу и нагрейте до 37° C в инкубаторе.

3. Добавьте воду в колбу, содержащую альбумин и бусины, и растворите путем встряхивания.

4. Add n/10-NaOH, 40 c.c. Allow the mixture to stand for thirty minutes
with frequent shaking.

5. Отфильтруйте через шведскую фильтровальную бумагу.

6. Стерилизуйте кипячением два или три раза с интервалом в два часа.

7. Добавьте 600 мл обычного питательного бульона.

8. Разлейте в небольшие колбы Эрленмейера по 50 мл.

9. Инкубируйте в течение сорока восьми часов при 37° C — отбракуйте все загрязненные колбы и храните остаток для дальнейшего использования.

Агар с яичным альбумином.

1. Приготовьте раствор яичного альбумина, как описано выше в пунктах 1-6.

2. Расплавьте и отмерьте 600 мл обычного питательного агара и добавьте к раствору яичного альбумина (вместо питательного бульона).

3. Завершите приготовление, как описано выше в пунктах 8-9.

Diplococcus Meningitidis Intracellularis.

Асцитический агар (Вассерман), синоним N-as-gar (Мервин Гордон).

1. Расплавьте и отмерьте в стерильную колбу:

Nutrient agar600 c.c.

2. Отмерьте в полулитровую колбу

Distilled water210 c.c.

и добавьте к нему

Ascitic fluid90 c.c.
Nutrose6 grammes

3. Нагревайте над пламенем Бунзена, постоянно встряхивая, пока жидкость не закипит и нутроза не растворится.

4. Добавьте нутрозно-асцитический раствор к жидкому агару.

5. Нагревайте в паровом стерилизаторе в течение тридцати минут, затем отфильтруйте.

6. Разлейте в пробирки и стерилизуйте так же, как питательный агар.

Примечание. Готовая среда в данном случае составляет всего 900 мл, так как при доведении до ровно одного литра были бы введены неудобные дроби.

Diplococcus Pneumoniæ.

Кровяной агар (Уошборн).

1. Расплавьте несколько пробирок с питательным агаром (см. стр. 167) и дайте им застыть в наклонном положении.

2. Поместите пробирки в горизонтальном положении в «горячий» инкубатор на сорок восемь часов, чтобы испарить часть конденсационной воды.

3. Убейте небольшого кролика хлороформом и прибейте его к доске (как для вскрытия). Тщательно смочите шерсть 2-процентным раствором лизола.

4. Стерилизуйте несколько пар пинцетов, ножниц и т. д. кипячением.

5. Откиньте кожу над грудной клеткой с помощью стерильных инструментов.

6. Вскройте грудную полость с помощью нового набора стерильных инструментов.

7. Вскройте перикард другим набором стерильных инструментов.

8. Прижгите поверхность левого желудочка раскаленным железом и извлеките жидкую кровь из сердца с помощью стерильных пипеток (например, тех, что показаны на рис. 13, c).

9. Нанесите небольшое количество крови на наклонную поверхность агара в каждой из пробирок и дайте ей стечь по всей поверхности среды.

10. Поместите пробирки в наклонное положение и дайте крови свернуться.

11. Верните «кровяной агар» в горячий инкубатор на сорок восемь часов и удалите все загрязненные пробирки. Храните остаток для дальнейшего использования.

Питательные среды для изучения бактерий полости рта в целом.

Картофельный желатин (Годби). —

1. Приготовьте глицериновый картофельный бульон (см. стр. 203, разделы 1–5).

2. Добавьте 10% желатина к картофельному отвару и продувайте смесь острым паром в течение десяти минут.

3. Оцените реакцию; доведите реакцию среды до +5.

4. Охладите среду до температуры ниже 60°C, осветлите яичным белком, как для питательного желатина.

5. Профильтруйте через бумагу Шардена.

6. Разлейте по пробиркам и стерилизуйте, как питательный желатин.

Питательные среды для изучения простейших.

Тканевая среда (Ногучи). — Для спирохет (культивирование должно проводиться в анаэробных условиях).

1. Закройте ватными пробками и стерилизуйте пробирки размером 20 × 2 см.

2. Умертвите небольшого кролика парами хлороформа. Вскройте брюшную полость с соблюдением всех правил асептики, извлеките почки и яички и перенесите их в стерильную стеклянную чашку. Нарежьте органы стерильными ножницами на мелкие кусочки — скажем, кубики со стороной 4 миллиметра. Из четырех органов должно получиться от 25 до 30 кусочков ткани.

3. Поместите по одному маленькому кусочку стерильной ткани на дно каждой стерилизованной пробирки.

4. Возьмите колбу, содержащую около 400 см³ питательного агара (реакция +10), расплавьте среду нагреванием и охладите на водяной бане до 50°C.

5. Добавьте 200 см³ асцитической или гидроцельной жидкости (можно использовать сыворотку лошади или овцы, но она менее эффективна) к жидкому агару и осторожно перемешайте, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.

6. Разлейте примерно по 20 см³ асцитического агара в каждую из стерилизованных пробирок, в которых уже находится кусочек стерильной ткани кролика, установите все пробирки вертикально в штативы или банку и дайте агару застыть.

7. После застывания налейте на поверхность среды в каждой пробирке стерильное парафиновое масло слоем 3 сантиметра.

8. Инкубируйте пробирки при 37°C в течение нескольких дней и отбракуйте те, которые оказались загрязненными.

9. Стерильные пробирки сохраните для дальнейшего использования.

XIII. ИНКУБАТОРЫ.

Fig. 113.—Incubator.

Инкубатор (рис. 113) по существу состоит из камеры для размещения культур и т. д., окруженной водяной рубашкой, стенки которой выполнены из металла, обычно меди, а снаружи покрыты асбестовой или войлочной оболочкой либо деревянным кожухом. Вода в рубашке нагревается газом или электричеством и поддерживается при постоянной температуре с помощью терморегулятора. Ячеистый инкубатор (рис. 114), изготовленный для меня [7] несколько лет назад, обладает величайшей практической пользой. Здесь центральная полость разделена пятью двустенными перегородками (в которых циркулирует вода, связанная с водяными резервуарами в верхней и нижней частях инкубатора) и дополнительно железными полками, образующими двадцать четыре ячейки. В каждую из них вставляется железный выдвижной ящик длиной 35 см, шириной 12 см и высотой 22 см, представляющий собой автономный инкубатор. Ящик оснащен деревянной передней панелью, к которой прикреплены ручка и пронумерованная этикетка. В качестве терморегулирующего устройства используется хорошо известная капсула Хирсона.

Fig. 114.—Cellular incubator.

В лаборатории требуется как минимум два инкубатора: один, отрегулированный на поддержание температуры 37°C и известный как «горячий» инкубатор, для культивирования бактерий; другой — на 20–22°C, известный как «прохладный» или «холодный» инкубатор.

Два других инкубатора, отрегулированные на 42°C и 60°C соответственно, хотя и не являются абсолютно необходимыми, очень быстро оправдывают свое приобретение.

Терморегуляторы. — Терморегулятор является наиболее важной частью инкубатора, так как от его эффективной работы зависит поддержание постоянной температуры в камере для культивирования. Он также используется при оснащении водяных и парафиновых бань и для многих других целей.

Fig. 115.—Reichert's thermo-regulator.

Из множества форм и разновидностей терморегуляторов (помимо электрических) только две получили достаточно широкое распространение, чтобы о них стоило упомянуть. В одном из них поток газа к газовой горелке регулируется расширением или сжатием ртути внутри стеклянного баллона; в другом — изменениями положения стенок металлической капсулы, содержащей жидкость, точка кипения которой соответствует температуре, при которой должен работать инкубатор. Это:

(a) Терморегулятор Райхерта (рис. 115), состоящий из баллона с ртутью, который подвешивается в среде (воздухе или воде), температуру которой необходимо регулировать. Газ поступает через А и выходит к горелке через В. По мере повышения температуры ртуть расширяется и перекрывает основной поток газа. По мере понижения температуры ртуть сжимается и вновь открывает узкую трубку С. С помощью винта D (который механически поднимает или опускает столбик ртути независимо от температуры) и термометра прибор можно настроить на поддержание любой желаемой температуры в инкубаторе. Для этой модели требуется специальная газовая горелка с отдельной подачей газа к запальной горелке сбоку.

(b) Капсульный регулятор Хирсона состоит из металлической капсулы, герметично запаянной и заполненной жидкостью, которая кипит при требуемой температуре; он устанавливается внутри инкубатора. К верхней стороне капсулы припаяна толстая металлическая пластина с центральной чашкой для приема нижнего конца жесткого стержня, через который движения стенок капсулы передаются на газовый клапан, закрепленный снаружи инкубатора.

Газовый клапан (регулятор) показан на рисунке 116. А — входное отверстие для газа, С — выходное отверстие к горелке, нагревающей водяную рубашку, B D — рычаг, шарнирно закрепленный на стойках в точке G, на который воздействует капсула через жесткий стержень, входящий в гнездо под винтом P.

Fig. 116.—Capsule thermo-regulator.

Конструкция клапана такова, что всякий раз, когда короткое плечо рычага B D давит на диск под концом B, основная подача газа полностью прекращается. Однако в такие моменты очень небольшое количество газа проходит от А к С через отверстие внутри клапана, размер которого можно регулировать винтовой иглой S, поэтому газовое пламя под инкубатором никогда не гаснет.

Расширение металлических стенок капсулы, происходящее при кипении ее содержимого, создает движущую силу, передаваемую через жесткий стержень для подъема длинного плеча рычага B D. Поскольку это расширение происходит только при заранее определенной температуре, рычаг будет приводиться в действие только при достижении критической температуры, при этом даже при температуре на 1°C ниже той, на которую рассчитана капсула, заметного эффекта не наблюдается.

W — это груз, перемещающийся по рычагу D; при увеличении расстояния между грузом и точкой опоры на стенки капсулы оказывается большее давление, в результате чего точка кипения жидкости в капсуле немного повышается, и таким образом с любой конкретной капсулой можно получить диапазон регулировки около двух градусов.

СНОСКИ:

[7] Made by the firm of Chas. Hearson & Co., 235 Regent St.,
London, W.

XIV. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ.

Культуры микроорганизмов в лаборатории обычно готовят одним из трех способов:

Tube cultures.

Plate cultures.

Hanging-drop cultures.

Их можно инкубировать либо аэробно (т. е. в присутствии кислорода), либо анаэробно (т. е. в отсутствие кислорода или в присутствии инертного газа, такого как водород, азот или углекислый газ).

Что касается температуры, при которой выращиваются культуры, можно установить общее правило: все среды, затвердевшие при добавлении желатина, инкубируются при 20°C или, во всяком случае, при температуре, не превышающей 22°C (то есть в «холодном» инкубаторе); в то время как жидкие среды и все другие твердые среды инкубируются при 37°C (то есть в «горячем» инкубаторе). Исключений из этого правила много. Например, при изучении роста психрофильных бактерий, дрожжей и плесневых грибов холодный инкубатор используется для всех сред.

Пробирочные культуры обычно помещают в инкубатор в небольших жестяных цилиндрах, подобных тем, в которых продаются американские сигареты, или в квадратных жестяных коробках. Для той же цели можно использовать стаканы или бокалы, но они хрупкие и поэтому менее удобны. Металлические штативы для пробирок, достаточно длинные, чтобы поместиться внутри инкубатора, и вмещающие по два ряда пробирок каждый, также чрезвычайно полезны.

АЭРОБНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ.

Приготовление пробирочных культур.

Приготовление пробирочной культуры состоит из:

(a) Инокуляции пробирки со стерильной питательной средой порцией исследуемого материала.

(b) Инкубации инокулированной пробирки при подходящей температуре.

Детали первого из этих процессов должны несколько варьироваться в зависимости от того, инокулируются ли пробирки с питательными средами или «засеваются» из —

1. Существующих культур.

2. Ранее собранного патологического материала (см. стр. 373).

3. Жидкостей, тканей и т. д. или непосредственно из организма животного.

Метод приготовления пробирочных культур из существующих культур следующий:

Fig. 117.—Inoculating tubes, seen from the front.

1. Жидкие среды (например, питательный бульон). —

1. Прокалите ватную пробку пробирки, содержащей культуру, а также пробку пробирки со стерильным бульоном.

2. Удерживайте обе пробирки рядом между большим пальцем и указательным и безымянным пальцами левой руки, позволяя закрытым концам опираться на тыльную сторону кисти, и разделяя горлышки пробирок (направленные вправо) кончиком среднего пальца. Держите пробирки как можно более горизонтально, не допуская, чтобы жидкость в бульонной пробирке коснулась ватной пробки (рис. 117).

3. Стерилизуйте платиновую петлю и дайте ей остыть. [8]

4. Захватите пробку пробирки с культурой мизинцем и ладонью и извлеките ее из пробирки.

5. Захватите пробку бульонной пробирки безымянным пальцем и основанием большого пальца и извлеките ее из пробирки.

6. Введите платиновую петлю в пробирку с культурой — не позволяйте петле касаться стенок пробирки, а держателю — касаться среды — и возьмите небольшую порцию роста; извлеките петлю из пробирки, удерживая инфицированную сторону петли обращенной вниз.

7. Введите петлю в бульонную пробирку почти до уровня жидкости, переверните петлю так, чтобы инфицированная сторона была обращена вверх, и эмульгируйте порцию роста во влаге, прилипшей к стенке пробирки, которая находится сверху. Извлеките петлю.

8. Снова закройте обе пробирки пробками.

9. Стерилизуйте платиновую петлю.

10. Наклейте на бульонную пробирку этикетку с указанием (a) названия организма и (b) даты инокуляции.

11. Инкубируйте.

2. Твердые среды. — Твердые среды хранятся в пробирках одним из двух способов:

1. Скошенная пробирка (рис. 118), в которой среде дали застыть, пока пробирка находилась в наклонном положении, образуя обширную поверхность среды, простирающуюся от дна пробирки почти до ее горлышка.

Этот метод используется для «штриховых» культур (Strichcultur).

2. Прямая пробирка (рис. 119), в которой среда образует цилиндрическую массу в нижней части пробирки и имеет верхнюю поверхность, расположенную под прямым углом к длинной оси пробирки.

Этот метод используется для «укольных» культур (Stichcultur) или, путем инокуляции среды в жидком состоянии и последующего застывания в этом положении, для «трясущихся» культур.

Штриховая культура. —

1. Прокалите пробки, стерилизуйте платиновую петлю (или шпатель). Откройте пробирки и наберите инокулят, как при предыдущей инокуляции.

2. Введите инфицированную петлю до дна пробирки, которую нужно инокулировать, и проведите ею как можно легче вдоль центра поверхности среды, заканчивая «штрих» над тонким слоем среды возле горлышка пробирки.

3. Снова закройте пробирки пробками, стерилизуйте платиновую петлю.

4. Наклейте этикетку на свежеинокулированную пробирку и инкубируйте.

Культура мазком. — Действуйте в целом так же, как при штриховой культуре, но распределите инфицированную петлю по всей поверхности среды, вместо того чтобы ограничивать инокуляцию узкой линией.

Примечание. — Желатиновые и агаровые скошенные пробирки следует «скашивать» непосредственно перед использованием.

Укольная культура. —

1. Прокалите пробки, откройте пробирки, стерилизуйте платиновую иглу и зарядите ее инокулятом, как в предыдущих культурах.

2. Введите платиновую иглу в пробирку, которую нужно инокулировать, пока она не коснется центра поверхности среды. Теперь глубоко введите ее в толщу среды, стараясь держать иглу как можно ближе к оси цилиндра среды. Затем извлеките иглу.

3. Снова закройте пробирки пробками. Стерилизуйте платиновую иглу.

4. Наклейте этикетку на свежезасеянную пробирку и инкубируйте.

Примечание. — Когда желатин хранится некоторое время, верхняя поверхность цилиндра становится вогнутой из-за испарения. Пробирки с таким видом следует расплавить и снова дать им застыть перед использованием для укольной культуры, иначе при введении иглы в среду поверхностное натяжение приведет к раскалыванию желатинового цилиндра.

Fig. 118.—Sloped or slanted medium for streak or smear
culture.

Fig. 119.—Straight tube.

Трясущаяся культура. —

1. Расплавьте пробирку с питательным желатином (или агаром, или другой подобной средой) путем нагревания на водяной бане (рис. 121).

2. Инокулируйте расплавленную среду и наклейте этикетку и т. д. точно так же, как при работе с пробиркой бульона.

3. Поместите свежезасеянную пробирку в вертикальное положение (например, в штатив для пробирок) и дайте ей застыть.

4. Наклейте этикетку на пробирку; когда среда застынет, инкубируйте.

Культивирование методом вращения по Эсмарху. —

1. Расплавьте три пробирки с желатином путем нагревания.

2. Приготовьте три разведения инокулята (как описано для пластинчатых культур, стр. 228, шаги 4–7).

3. Вращайте пробирки, удерживая их почти горизонтально, в желобке, сделанном в блоке льда, пока желатин не застынет тонкой пленкой на внутренней поверхности пробирки (рис. 120); или под струей холодной воды из-под крана.

Fig. 120. Esmarch's roll culture on block of
ice.

Чтобы среда прочно прилипала к стеклу, в агар, используемый для культивирования методом вращения, перед стерилизацией следует добавить 1% желатина или 1% гуммиарабика.

Культуры методом вращения, которые служили важнейшей цели во времена до введения чашек Петри для пластинчатых культур, в современных лабораториях устарели и упоминаются лишь для пользы студентов, поскольку экзаменаторы, интересующиеся академическими и историческими аспектами бактериологии, иногда ожидают, что кандидаты будут знакомы с методом их приготовления.

Приготовление пластинчатых культур.

Если небольшое количество бактерий суспендировано в расплавленном желатине, агаре или другой подобной среде, и инфицированная среда распределена ровным слоем по плоской поверхности и оставлена для застывания, каждый отдельный микроорганизм фиксируется в определенной точке, и его дальнейшее развитие ограничивается окрестностями этой точки. Через некоторое время рост этого организма становится видимым невооруженным глазом как «колония». Это принцип, на котором основан метод пластинчатого культивирования, и его применение позволяет бактериологу изучать особый способ развития, характерный для каждого вида микробов при росте (a) беспрепятственно на поверхности среды, (b) в глубине среды. Сам метод заключается в следующем:

Необходимое оборудование. —

1. Штатив-тренога для выравнивания.

2. Большая мелкая стеклянная чашка с квадратным листом листового стекла для накрывания.

3. Ватерпас (уровень).

4. Набор стерильных чашек Петри.

5. Пробирки со стерильными питательными средами, желатином (или агаром), предварительно расплавленными путем нагревания на водяной бане и охлажденными до 42°C, иначе тепло среды уничтожит многие, если не все, внесенные бактерии.

6. Пробирка с культурой для посева.

7. Платиновая петля.

8. Бунзеновская горелка.

9. Стеклограф (карандаш по стеклу).

Fig. 121.—Handy form of water-bath for melting tubes of
agar and gelatine previous to slanting them; or to making shake cultures
or pouring plates.

Метод «заливки» пластин. —

1. Поместите стеклянную чашку на выравнивающую треногу (рис. 122, 123); если нужно залить желатиновые пластины, наполните чашку ледяной водой — желатин застывает так медленно, что необходимо ускорить процесс; если используется агар, наполните водой при 50°C — агар застывает почти мгновенно при комнатной температуре, и небольшое замедление процесса позволяет избежать комковатости; накройте чашку квадратным листом стекла.

2. Поместите ватерпас на лист стекла и с помощью выравнивающих винтов установите поверхность стекла горизонтально.

Это выравнивание является важным делом, поскольку развитие колонии в некоторой степени пропорционально запасу питательной среды, доступной для ее питания. Так, в «мазке» на скошенной пробирке колонии в верхней части среды stunted и малы, но увеличиваются в размере и пышности роста по мере приближения к дну пробирки, где находится наибольшая толщина среды.

Fig. 122.—Plate-levelling stand.

3. Поместите три стерильные чашки Петри в ряд на поверхность стеклянной пластины и пронумеруйте их 1, 2 и 3 слева направо.

Fig. 123.—Plate-levelling stand, side view.

4. Пронумеруйте предварительно расплавленные пробирки с питательными средами 1, 2 и 3. Прокалите пробки и убедитесь, что каждая пробка легко извлекается из горлышка своей пробирки.

5. Добавьте одну петлю инокулята в пробирку № 1, обращаясь с расплавленной средой как с бульоном. После того как снова закроете пробкой, захватите пробирку возле горлышка большим и указательным пальцами правой руки и равномерным круговым движением всей руки распределите инокулят по всей среде; избегайте резких движений, так как они вызывают образование пузырьков воздуха в среде.

Fig. 124.—Mixing emulsion for plates.

Искусство равномерного перемешивания без образования пузырьков воздуха не всегда легко дается этим методом. Альтернативный план — держать инокулированную пробирку вертикально между сложенными ладонями и вращать ее между ними быстрыми движениями обеих рук вперед и назад (рис. 124).

Fig. 125.—Pouring plates.

6. Стерилизуйте платиновую петлю, добавьте две петли разбавленного инокулята в пробирку № 2 и перемешайте, как прежде.

7. Подобным образом перенесите три петли расплавленной среды из пробирки № 2 в пробирку № 3 и тщательно перемешайте.

8. Прокалите пробку пробирки № 1, извлеките ее, затем прокалите края пробирки; слегка приподнимите крышку чашки Петри № 1, введите горлышко пробирки; затем, приподнимая дно пробирки, вылейте расплавленную среду в чашку Петри, чтобы образовался тонкий слой. Извлеките горлышко пробирки и закройте «пластину». Если среда не растеклась ровно по дну чашки, приподнимите чашку с выравнивающей платформы и, наклоняя в разных направлениях, исправьте ошибку.

9. Залейте пластины № 2 и № 3 подобным образом из пробирок № 2 и № 3.

10. Наклейте на пластины этикетки с отличительным названием или номером инокулята, а также датой; номер разведения должен быть указан заранее (шаг 3).

11. Поместите в холодный инкубатор на три или более дней, по мере необходимости.

Таким образом можно получить колонии, совершенно чистые и отделенные друг от друга.

На пластине № 1, вероятно, колонии будут настолько многочисленны и скученны, а следовательно, настолько малы, что это сделает ее бесполезной. На пластине № 2 они будут более широко разделены, но обычно пластина № 3 резервируется для тщательного изучения, так как на ней колонии обычно широко разделены, немногочисленны и велики по размеру.

Агаровые пластины заливаются подобным образом, но агар должен быть расплавлен в кипящей воде, а затем охлажден до 45°C или 42°C на тщательно отрегулированной водяной бане перед инокуляцией, и весь процесс должен выполняться очень быстро, иначе агар застынет до завершения операции.

Примечание. — При заливке пластин, поскольку пробирка № 1 (для первого разведения) редко дает пластину, имеющую какую-либо практическую ценность, ее часто заменяют пробиркой с бульоном или стерильным солевым раствором, и в таком случае пластина № 1 не заливается.

Поверхностные пластины. —

Этот метод заливки так называемых «цельных» пластин (поскольку колонии могут появляться как на поверхности, так и в глубине среды) необходим для точного изучения формирования колоний при различных условиях, но когда основной целью разделения бактерий является получение субкультур из ряда отдельных бактерий, необходимо готовить «поверхностные» пластины, так как здесь формирование колоний ограничено поверхностью среды. Используемый метод немного варьируется в зависимости от того, является ли используемая среда желатином или агаром, или одним из производных или вариантов последнего.

(a) Желатиновые поверхностные пластины. —

1. Расплавьте три пробирки с питательным желатином.

2. Вылейте содержимое каждой пробирки в отдельную чашку Петри и дайте застыть. Затем переверните каждую пластину и ее крышку вверх дном.

Fig. 126.—Surface plate spreader.

3. Когда они полностью остынут, приподнимите дно пластины 1, переверните ее и нанесите каплю инокулята (будь то жидкая культура или эмульсия из твердой культуры) на поверхность желатина платиновой петлей — близко к одной стороне пластины; верните нижнюю половину чашки Петри в ее крышку.

4. Возьмите кусок тонкой стеклянной палочки, толстой платиновой проволоки или, что лучше всего, кусок алюминиевой проволоки (скажем, 2 мм в диаметре) длиной около 28 см. Согните конечные 4 см под прямым углом к остальной части, сделав L-образную палочку (рис. 126). Стерилизуйте короткое плечо и прилегающую часть длинного плеча в пламени Бунзена и дайте остыть.

5. Теперь приподнимите дно чашки Петри левой рукой, оставив крышку на лабораторном столе, и, удерживая ее вертикально, размажьте каплю инокулята по всей поверхности желатина коротким плечом распределителя вращательным движением (рис. 127). Верните чашку в крышку.

6. Приподнимите дно пластины 2 и разотрите инфицированный распределитель по всей поверхности желатина — затем продолжайте подобным образом для третьей пластины в серии.

7. Стерилизуйте распределитель.

8. Наклейте этикетки и инкубируйте пластины.

Fig. 127.—Spreading surface plate.

После инкубации пластина № 1, вероятно, даст огромное количество колоний; пластина 2 покажет меньше колоний, так как на ее поверхность будут нанесены только те бактерии, которые прилипли к палочке после растирания по пластине 1, и к тому времени, когда палочка достигнет пластины 3, на ней должно остаться очень мало организмов. Так что третья пластина, как правило, покажет лишь очень немногие разбросанные колонии, в высшей степени подходящие для детального изучения.

(b) Агаровые поверхностные пластины. —

1. Расплавьте три пробирки с питательным агаром — нутрозным агаром или подобным.

2. Вылейте содержимое каждой пробирки в отдельную чашку Петри и дайте застыть.

3. Когда они полностью застынут, переверните каждую чашку, приподнимите нижнюю половину и установите ее наклонно на перевернутую крышку (рис. 128) и поместите в таком положении в инкубатор при 60°C на сорок пять минут (или в инкубатор при 42°C на два часа). Это испаряет конденсат и придает среде твердую, сухую поверхность.

4. После извлечения пластин из инкубатора закройте каждую чашку и поместите ее — все еще вверх дном — на лабораторный стол.

Fig. 128.—Drying surface plate of agar.

5. Инокулируйте пластины сериями по три, как описано для желатиновых поверхностных пластин 3–8.

Культивирование в висячей капле.

Apparatus Required.—

Hanging-drop slides.

Cover-slips.

Section rack (Fig. 75).

Blotting paper.

Bell glass to cover slides.

Original culture.

Tubes of broth, or liquefied gelatine or agar.

Forceps.

Platinum loop.

Bunsen burner.

Grease pencil.

Sterile vaseline.

Lysol.

(a) Жидкие среды. —

1. Приготовьте первое и второе разведения инокулята, как указано для пластинчатых культур (см. стр. 228–229, разделы 4–6), заменив пробирки с расплавленным желатином пробирками с питательным бульоном.

2. Стерилизуйте предметное стекло для висячей капли, тщательно промыв его в воде и высушив, затем погрузив в стакан с абсолютным спиртом, слив большую часть спирта, захватив стекло пинцетом и выжечь остатки спирта в пламени.

3. Поместите предметное стекло для висячей капли на кусок промокательной бумаги, смоченной 2% раствором лизола, и накройте его небольшим стеклянным колпаком, который был ополоснут тем же раствором и не высушен.

4. Слегка приподнимите колпак и смажьте стерильным вазелином края металлической ячейки с помощью стерильного шпателя из толстой платиновой проволоки.

5. Извлеките чистое покровное стекло из спиртовки стерильным пинцетом и выжгите спирт; снова приподнимите колпак и поместите стерильное покровное стекло на промокательную бумагу рядом с предметным стеклом для висячей капли.

6. Возьмите каплю бульона из пробирки второго разведения большой платиновой петлей; приподнимите колпак и нанесите каплю в центр покровного стекла. Стерилизуйте петлю.

7. Приподнимите колпак настолько, чтобы можно было захватить покровное стекло пинцетом, перевернуть его и установить над ячейкой предметного стекла для висячей капли. Полностью снимите колпак и плотно прижмите покровное стекло к ячейке.

8. Либо инкубируйте и исследуйте через определенные промежутки времени, либо наблюдайте непрерывно под микроскопом, используя при необходимости подогреваемый столик (рис. 53).

(b) Твердые среды. — Соблюдая точно такую же технику, несколько капель расплавленного желатина или агара из пробирки второго разведения можно распределить по поверхности стерильного покровного стекла и тем самым приготовить пластинчатую культуру в висячей капле.

Этот метод чрезвычайно полезен при изучении дрожжей, когда круглую ячейку на предметном стекле для висячей капли следует заменить прямоугольной ячейкой размером около 38 на 19 мм, а желатин распределить по покровному стеклу аналогичного размера. После герметизации препарата верхнюю поверхность покровного стекла можно расчертить на квадраты с помощью стеклографа или алмазного карандаша и пронумеровать, чтобы облегчить последующую идентификацию колоний, которые, как наблюдается, развиваются из одиночных микробов.

Культура в висячем блоке (Хилл). —

Необходимое оборудование: Как для культивирования в висячей капле, с добавлением скальпеля.

Выполняйте метод насколько возможно под прикрытием колпака, чтобы избежать загрязнения из воздуха.

1. Расплавьте пробирку с питательным агаром (или желатином) и вылейте в чашку Петри слоем около 4 мм и дайте застыть.

2. Острым скальпелем вырежьте блок размером около 8 мм из всей толщины агарового слоя.

3. Поднимите агаровый блок на лезвии скальпеля и перенесите его нижней стороной вниз в центр стерильного предметного стекла.

4. Распределите каплю жидкой культуры (или эмульсии роста с твердой среды) по верхней поверхности агарового блока, как если бы делали мазок на покровном стекле.

5. Поместите предметное стекло с блоком, накрытое колпаком, в инкубатор при 37°C на десять минут для легкого подсушивания.

6. Возьмите чистое сухое стерильное покровное стекло пинцетом и с помощью второго пинцета осторожно опустите его на инокулированную поверхность агара (избегая пузырьков воздуха), так чтобы остался чистый край покровного стекла, перекрывающий агаровый блок.

7. Переверните препарат и лезвием скальпеля отделите предметное стекло от агарового блока.

8. Платиновой петлей нанесите каплю или две расплавленного агара вокруг краев блока. Он сразу застывает и герметизирует блок на покровном стекле.

9. Подготовьте стерильное предметное стекло для висячей капли и смажьте края металлической ячейки твердым вазелином или расплавленным белым воском.

10. Переверните покровное стекло с прикрепленным блоком на предметное стекло для висячей капли и плотно загерметизируйте покровное стекло на месте.

11. Наблюдайте, как при культивировании в висячей капле.

АНАЭРОБНЫЕ КУЛЬТУРЫ.

Было разработано множество методов культивирования анаэробных бактерий, большинство из которых требуют использования специального оборудования. Принцип, на котором основан любой метод и от которого зависит его успех, подпадает под один из следующих заголовков:

(a) Исключение воздуха из культуры.

(b) Удаление воздуха из сосуда, содержащего культуру, с помощью воздушного насоса — т. е. культивирование в вакууме.

(c) Поглощение кислорода из воздуха, контактирующего с культурой, с помощью пирогалловой кислоты, подщелоченной каустической содой — т. е. культивирование в атмосфере азота.

(d) Вытеснение воздуха инертным газом, таким как водород или светильный газ — т. е. культивирование в атмосфере водорода.

(e) Комбинация двух или более из вышеперечисленных методов.

Здесь приведена подборка наиболее простых и наиболее общеприменимых методов.

Всякий раз, когда это возможно, питательные среды, используемые в любом из процессов, должны содержать какое-либо легко окисляющееся вещество, такое как формиат натрия (0,4%) или сульфиндиготат натрия (0,1%), которые поглотят весь доступный кислород, удерживаемый в растворе средой. Дополнительное добавление глюкозы (2%) способствует росту анаэробных бактерий (см. стр. 189–190).

Кроме того, рекомендуется герметизировать все соединения между резиновыми пробками и тубусами или горлышками пробирок расплавленным парафином; стеклянные пробки и краны следует смазывать смоляной мазью или смесью из 1 части пчелиного воска и 4 частей оливкового масла.

(A) Метод I (Метод Гессе). —

1. Сделайте укольную культуру в желатине или агаре, выбрав для этой цели прямую пробирку, содержащую глубокий столбик среды, и вводя инокулирующую иглу до дна пробирки.

2. Pour a layer of sterilised oil (olive oil, vaseline, or petroleum), 1
or 2 cm. deep, upon the surface of the medium.

3. Инкубируйте.

Метод II. — Этот метод доступен только при работе с чистыми культурами.

1. Расплавьте пробирку с желатином (или агаром) путем нагревания, вылейте ее в чашку Петри и дайте застыть.

2. Инокулируйте поверхность среды только в одном месте.

3. Извлеките покровное стекло из сосуда с абсолютным спиртом стерильным пинцетом; выжгите спирт в газовом пламени.

4. Осторожно опустите теперь стерильное покровное стекло на инокулированную поверхность среды, тщательно исключая пузырьки воздуха, и плотно прижмите его кончиками пинцета. (Стерильный диск из слюды можно заменить покровным стеклом.)

5. Инкубируйте.

Метод III (Физический метод Ру). —

1. Подготовьте пробирочные культуры жидких сред (или твердых сред, переведенных в жидкое состояние нагреванием) обычным способом.

2. Аспирируйте часть инокулированных сред в капиллярные пипетки.

3. Запаяйте оба конца каждой пипетки в пламени горелки.

4. Инкубируйте.

Метод IV (Биологический метод Ру). —

1. Сделайте глубокий укол, как в методе I.

2. Налейте слой бульонной культуры энергичного аэроба — например, B. aquatilis sulcatus или B. prodigiosus — глубиной 1 или 2 см на поверхность среды; или такой же слой расплавленного желатина, который затем инокулируется аэробным организмом.

3. Инкубируйте.

Рост аэроба поглотит весь кислород, который до него доходит, и не позволит ему проникнуть к среде внизу, которая, следовательно, останется в анаэробном состоянии.

(B) Метод V. —

1. Подготовьте пробирочные или колбовые культуры обычным способом.

2. Замените ватную пробку резиновой пробкой с одним отверстием, в которое вставлен отрезок стеклянной трубки, имеющий сужение примерно на 3 см выше пробки и затем согнутый под прямым углом (рис. 129). Пробку и стеклянную трубку стерилизуют кипячением в стакане с водой в течение пяти минут.

Fig. 129.—Vacuum culture.

3. Соедините трубку, идущую от культурального сосуда, с водяным или воздушным насосом, поместив между ними склянку Вульфа, оборудованную как промывная склянка и содержащую серную кислоту.

4. Откачайте воздух из культурального сосуда.

5. Перед отсоединением аппарата запаяйте стеклянную трубку от культурального сосуда в месте сужения, используя пламя горелки.

6. Инкубируйте.

(C) Метод VI (Метод Бухнера).

Необходимое оборудование и растворы. —

Трубка Бухнера (толстостенная стеклянная пробирка длиной 23 см и диаметром 4 см, снабженная резиновой пробкой, рис. 130).

Пирогалловая кислота в спрессованных таблетках, каждая весом 1 грамм.

Деканормальный раствор каустической соды.

Метод. —

1. Подготовьте пробирочную культуру обычным способом.

2. Смочите резиновую пробку трубки Бухнера водой и убедитесь, что она точно подходит к горлышку трубки.

3. Снимите пробку с бутыли с каустической содой.

4. Бросьте одну из таблеток пирогалловой кислоты [9] в трубку Бухнера (грубо говоря, используйте 1 грамм пирогалловой кислоты на каждые 100 см³ воздушной емкости приемного сосуда).

5. Добавьте около 1 см³ раствора соды.

6. Поместите инокулированную пробирку внутрь трубки Бухнера. Таблетка пирогалловой кислоты действует как буфер и предотвращает повреждение как инокулированной пробирки, так и трубки Бухнера, даже если ее вставили поспешно.

7. Плотно вставьте резиновую пробку в горлышко трубки Бухнера.

Fig. 130.—Buchner's tube.

Таблетка пирогалловой кислоты медленно растворяется в растворе соды, и ее окисление поначалу протекает очень медленно, так что при использовании этого метода имеется достаточно времени.

8. Снова закройте бутыль с каустической содой.

9. Поместите трубку Бухнера в проволочную подставку и инкубируйте.

Метод VII (Метод Райта). —

1. Подготовьте пробирочную культуру обычным способом.

2. Отрежьте ножницами ту часть ватной пробки, которая выступает над горлышком пробирки, затем протолкните пробку внутрь пробирки на 2 или 3 см.

3. С помощью пипетки капните около 1 см³ 10% водного раствора пирогалловой кислоты на пробку. Она немедленно впитается ватой.

4. Другой пипеткой влейте такое же количество раствора каустической соды.

5. Быстро закройте горлышко пробирки плотно прилегающей резиновой пробкой.

6. Инкубируйте.

Fig. 131.—McLeod's anaerobic plate base with half petri
dish inverted in situ

Метод VIII (Метод Маклеода). —

Необходимое оборудование и растворы. —

Основание для пластин Маклеода (полый глазурованный глиняный диск диаметром 9 см и глубиной 2 см: верхняя поверхность пронизана центральным отверстием диаметром 2 см, обеспечивающим доступ внутрь, нижняя часть которого разделена на две части низкой перегородкой. Неглубокий желобок опоясывает верхнюю поверхность возле края).

Plasticine.

Pyrogallic acid (1 gramme) compressed tablets.

Sodic hydroxide (0.4 gramme) compressed tablets.

Wash bottle of distilled water.

Surface plates of one or other agar medium (in petri dishes of 8 cm. diameter).

Surface plate spreader.

Метод. —

1. Раскатайте длинный цилиндр из пластилина и вставьте его в желобок на верхней поверхности глиняного основания.

2. Поместите таблетку пирогалловой кислоты в одно отделение внутри основания пластины, а две таблетки гидроксида натрия — в другое.

3. Подготовьте поверхностную пластинчатую культуру организма, который нужно культивировать.

4. Влейте несколько кубических сантиметров дистиллированной воды в то отделение основания пластины, которое содержит гидроксид натрия.

5. Переверните нижнюю половину поверхностной пластины над основанием пластины и плотно прижмите ее края к пластилину, заполняющему желобок.

6. Наклейте этикетку и инкубируйте.

(D) Метод IX. —

Необходимое оборудование. —

Small Ruffer's or Woodhead's flask (Fig. 33).

Sterile india-rubber stopper.

India-rubber tubing.

Glass tubing.

Metal screw clips.

Cylinder of compressed hydrogen; or hydrogen gas apparatus

Метод. —

1. Стерилизуйте стеклянный сосуд, имеющий форму колбы Руффера или Вудхеда, в сухожаровом шкафу. (Тубус и боковые трубки закрыты ватными пробками.) После стерилизации прикрепите короткий кусок резиновой трубки, перекрытый металлическим зажимом, к каждой боковой трубке.

2. Инокулируйте большое количество (например, 200 см³) питательной среды. Если используются твердые среды, их необходимо предварительно расплавить путем нагревания.

3. Удалите ватную пробку из тубуса и перелейте инокулированную среду в стеклянный сосуд.

4. Закройте тубус резиновой пробкой, предварительно стерилизованной кипячением в стакане с водой.

Fig. 132.—Kipp's hydrogen apparatus, (a) connected up
to two washing bottles containing (b) lead acetate 10 per cent.
solution, to remove H2S and (c) silver nitrate solution to remove
AsH3. A third washing bottle containing pyrogallic acid 10 per cent.
solution, rendered alkaline, to remove any trace of oxygen, is sometimes
introduced.

Fig. 133.—Improved gas apparatus; the metal is contained
in a perforated glass tube which is submerged in acid when the
triangular bottle is upright (a), but is above the level of the liquid
when the bottle is turned on its side (b).

5. Соедините резиновую трубку на одном из боковых отводов с баллоном со сжатым водородом (или с отводной трубкой аппарата Киппа, рис. 132, либо другим водородным аппаратом, рис. 133), вставив короткий отрезок стеклянной трубки; аналогичным образом подсоедините длинную резиновую трубку к противоположному боковому отводу, конец которой следует опустить в сосуд с водой.

6. Откройте оба металлических зажима и пропускайте водород через сосуд до тех пор, пока атмосферный воздух не будет вытеснен водородом. Это определяется путем сбора газа, выходящего пузырьками через воду в сосуде, в пробирку и проверки его с помощью зажженной лучины.

7. Закройте металлический зажим на трубке, через которую поступает газ; закройте зажим на выходной трубке.

8. Отсоедините газовый аппарат.

9. Поместите в термостат.

Метод X (Метод Боткина).—

Необходимое оборудование.—

Large glass dish 20 cm. diameter and 8 cm. deep. Flat leaden

cross slightly shorter than the internal diameter of the glass dish.

Bell glass about 15 cm. diameter and 20 to 25 cm. high.

Metal frame for plate cultivations.

Or, glass battery jar for tube cultivations.

Cylinder of compressed hydrogen.

Rubber tubing.

Two pieces of U-shaped glass tubing (each arm 8 cm. in length).

Half a litre of glycerine (or metallic mercury).

Метод.—

1. Поместите свинцовый крест внутрь стеклянной чашки, установив его на дно.

2. Подготовьте культуры обычным способом.

3. Поместите пробирки с культурами в стеклянную банку для элементов (или чашечные культуры на металлической подставке), установив их в центре свинцового креста.

4. Накройте культуры колоколом.

5. Установите U-образные стеклянные трубки в вертикальном положении с противоположных сторон колокола так, чтобы одно колено каждой трубки находилось внутри, а другое — снаружи. Эти трубки лучше всего фиксировать, погружая U-образные изгибы в два комка пластилина, прилепленных ко дну стеклянной чашки. Закрепите короткий отрезок резиновой трубки с металлическим зажимом на каждом из внешних колен (рис. 134).

6. Заполните стеклянную чашку глицерином или металлической ртутью до уровня около 5 см.

Fig. 134.—Botkin's apparatus.

7. Соедините одну U-образную трубку с баллоном с водородом (или газовым аппаратом) с помощью резиновой трубки. Вытесните атмосферный воздух водородом, как в методе IX.

8. Пережмите трубки зажимами и отсоедините газовый аппарат.

9. Поместите в термостат.

Метод XI (Метод Нови).—

Необходимое оборудование.—

Jar for plate cultivations (Fig. 135).

Or, jar for tube cultivations (Fig. 136).

Lubricant for stopper of jar.

Rubber tubing.

Cylinder of compressed hydrogen.

Метод.—

1. Подготовьте культуры обычным способом.

2. Поместите их внутрь банки.

3. Смажьте пробку и вставьте ее в горлышко банки так, чтобы ручка находилась на одной линии с двумя боковыми трубками.

4. Соедините отводную трубку «a» с источником водорода с помощью резиновой трубки.

Fig. 135.—Novy's jar for plate cultivations.

Fig. 136.—Novy's jar for tube cultivations.

5. Присоедините отрезок резиновой трубки к выходной трубке «b», собирайте пробы выходящего газа (над водой) и периодически проверяйте их.

6. Когда воздух будет полностью вытеснен водородом, поверните ручку пробки под прямым углом к линии входной и выходной трубок; это перекроет отверстия обеих трубок.

7. Отсоедините газовый аппарат и поместите в термостат.

(E) Метод XII (Метод Буллока).—

Необходимое оборудование.—

Bulloch's jar.

Pot of resin ointment.

Small glass dish 14 cm. diameter by 5 cm. deep.

Vessel for tube cultures or metal rack for plate cultures.

Pyrogallic acid tablets.

Cylinder of compressed hydrogen.

Geryk or other air pump.

Rubber pressure tubing.

10 c.c. pipette.

Glass tubing.

Dry granulated caustic soda or compressed tablets each, containing

0.4 grammes sodic hydroxide.

Small beaker of water.

Метод.—

1. Подготовьте культуры обычным способом.

2. Поместите стеклянную чашку в центр стеклянной пластины и установите культуры внутри нее.

3. Поместите достаточное количество таблеток пирогалловой кислоты с одной стороны стеклянной чашки (т. е. 1 таблетку на каждые 100 кубических сантиметров объема воздуха под колоколом). Поместите небольшую горку сухой гранулированной соды (или полдюжины таблеток гидроксида натрия) рядом с таблетками пирогаллола.

4. Смажьте фланец колокола смоляной мазью и плотно прижмите колокол к стеклянной пластине, накрыв культуры — так, чтобы длинная трубка проходила своим нижним концом в стеклянную чашку в точке, прямо противоположной таблеткам пирогалловой кислоты. Смажьте оба крана смоляной мазью (рис. 137).

5. Соедините короткую трубку «a» с источником газа с помощью резиновой вакуумной трубки и откройте оба крана.

6. Соедините длинную прямую стеклянную трубку с длинной трубкой «b» с помощью отрезка резиновой трубки, вставив винтовой зажим; периодически собирайте пробы выходящего газа и проверяйте их.

7. Когда воздух будет вытеснен, закройте кран входной трубки, затем кран выходной трубки «b». Затяните зажим, отсоедините стеклянную трубку от резинового соединения и подсоедините короткую трубку «a» к воздушному насосу с помощью вакуумной трубки.

8. Откройте кран трубки «a» и двумя-тремя качками воздушного насоса откачайте небольшое количество газа, создав небольшое разрежение. Затем закройте кран и отсоедините воздушный насос.

9. Наполните 10-кубовую пипетку с расширением водой; вставьте ее кончик в резиновую трубку на длинной трубке «b» до винтового зажима. Откройте винтовой зажим и впускайте воду до тех пор, пока она не остановится из-за внутреннего давления. Закройте кран. (Вода растворяет соду и пирогалловую кислоту, превращая последнюю в щелочной пирогаллол и тем самым активируя ее скрытую способность поглощать кислород).

Fig. 137.—Bulloch's jar.

10. Переверните трубки от тубусов так, чтобы они соединились в безопасном месте над верхушкой колокола; еще раз убедитесь, что все соединения герметичны, и перенесите аппарат в термостат.

Этот последний метод является наиболее удовлетворительным для анаэробных культур, так как с его помощью можно достичь полной анаэробиоза с наименьшими затратами времени и усилий.

СНОСКИ:

[8] См. также метод открывания и закрывания пробирок с культурами, стр. 74-76.

[9] Если невозможно получить спрессованные таблетки пирогалловой кислоты, приготовьте основной раствор «кислого пирогаллола»

Pyrogallic acid, 10 grammes

Hydrochloric acid, 1.5 c.c.

Distilled water, 100 c.c.

и на этапе 4 введите 10 см³ этого раствора.

XV. МЕТОДЫ ИЗОЛЯЦИИ.

Работа в предыдущих разделах, организованная для демонстрации основных биологических характеристик бактерий в целом, предназначена для выполнения с помощью культур различных организмов, предварительно выделенных, идентифицированных и предоставленных студенту в чистом виде. Культура, состоящая из потомства одной клетки, называется «чистой культурой»; та, которая содержит представителей двух или более видов бактерий, называется «нечистой» или «смешанной культурой», и теперь необходимо указать основные методы, с помощью которых один или несколько организмов могут быть выделены в чистом виде из смеси; независимо от того, существует ли эта смесь в виде нечистой лабораторной культуры или содержится в гное и других патологических экссудатах, инфицированных тканях, воде или пищевых продуктах.

Fig. 138.—Hæmatocytometer cell, showing, a, section
through the centre of the cell, and b, a magnified image of the cell
rulings.

До внедрения твердых сред единственным методом получения чистых культур был метод «разведения» — отнюдь не надежный метод. «Разведение» заключалось в приблизительной оценке количества бактерий, присутствующих в заданном объеме жидкости (с помощью предметного стекла с градуированной камерой, напоминающей гемоцитометр, рис. 138), и разведении жидкости путем добавления стерильной воды или бульона до тех пор, пока заданный объем (обычно 1 см³) разведения не содержал только один организм. При посеве этого объема жидкости в несколько пробирок или колб с питательными средами иногда случалось, что полученный рост был продуктом одной особи микроба. Столь ненадежный метод в настоящее время, к счастью, заменен многими другими, более надежными и удобными, и в методах, выбранных здесь для описания, разделение и изоляция требуемых бактерий могут быть осуществлены—

A. Механическим разделением.

1. Поверхностным посевом на пластины:

(a) Gelatine.

(b) Agar.

(c) Serum agar.

(d) Blood agar.

(e) Hanging-drop or block.

[2. Посевом вращением по Эсмарху:

Этот архаичный метод (см. стр. 226) больше не используется для изоляции бактерий.]

3. Серийным посевом.

B. Биологической дифференциацией.

4. Дифференциальными средами.

(a) Selective.

(b) Deterrent.

5. Дифференциальной инкубацией.

6. Дифференциальной стерилизацией.

7. Дифференциальным культивированием в атмосфере.

8. Инокуляцией животным.

Выбор метода, который будет применяться в каждом конкретном случае, зависит от множества обстоятельств, и часто комбинация двух или более методов обеспечивает более быстрый и надежный результат, чем строгое следование какому-либо одному методу. Опыт — единственный надежный проводник, но, как правило, использование первого или третьего метода окажется наиболее удобным, поскольку каждый из них дает возможность одновременной изоляции нескольких или всех разновидностей бактерий, присутствующих в смеси.

1. Поверхностные посевы на пластины.—

(a) Желатин (см. стр. 164).

(b) Агар (см. стр. 167).

(c) Щелочная сывороточная агаровая среда (см. стр. 211).

Эти пластины готовятся способом, в точности аналогичным тому, который принят для поверхностных посевов на желатин и агар (см. стр. 231-233).

(d) Сывороточный агар.—

1. Расплавьте три пробирки с питательным агаром, промаркируйте их 1, 2 и 3 и поместите их вместе с тремя пробирками стерильной жидкой сыворотки, также промаркированными 1a, 2a и 3a, в водяную баню, отрегулированную на 45° C; дайте достаточно времени, чтобы температура содержимого каждой пробирки достигла температуры водяной бани.

2. Возьмите пробирку с сывороткой № 1a и пробирку с агаром № 1. Прокалите пробки и удалите их из пробирок (удерживая пробку пробирки с агаром в руке); прокалите горлышки пробирок, перелейте сыворотку в пробирку с расплавленным агаром и верните пробку на место.

3. Тщательно перемешайте и залейте пластину № 1 secundum artem.

4. Обработайте оставшиеся пробирки с агаром и сывороткой аналогичным образом и залейте пластины № 2 и 3.

5. Высушите пластины с сывороточным агаром в термостате при 60° C в течение одного часа (см. стр. 232).

6. Инокулируйте пластины серийно, как описано для поверхностных посевов на желатин (стр. 231).

(e) Кровяной агар, человеческий.—

1. Расплавьте пробирку со стерильным агаром и вылейте ее в стерильную чашку; дайте застыть.

2. Соберите несколько капель человеческой крови в стерильных асептических условиях в стерильную капиллярную пипетку с резиновой грушей.

3. Слегка приподнимите крышку чашки Петри, вставьте кончик капиллярной пипетки и нанесите кровь в центр поверхности агара. Закройте чашку.

4. Возьмите платиновой петлей небольшое количество инокулята. Приподнимите крышку пластины, введите петлю, смешайте ее содержимое с каплей крови, удалите петлю, закройте чашку и простерилизуйте петлю.

5. Наконец, распределите смесь по поверхности агара стерилизованным L-образным шпателем.

6. Промаркируйте и поместите в термостат.

(При необходимости можно инокулировать серийно две, три или более подобных пластин.)

(f) Кровяной агар, животный.—

При приготовлении цитратного кровяного агара (стр. 171) всегда рекомендуется разливать несколько пробирок с кровяным агаром в чашки, которые можно хранить в леднике, готовыми к использованию в любой момент для поверхностных посевов.

(g) Культура в висячей капле или блоке (см. стр. 233).

3. Серийные посевы.—Обычно делаются на агаре или сыворотке крови, хотя можно использовать и желатин.

Метод заключается в следующем:

1. Возьмите не менее четырех «скошенных» пробирок со средами и пронумеруйте их по порядку.

2. Прокалите все пробки и убедитесь, что каждую из них можно легко удалить.

3. Зарядите платиновую петлю небольшим количеством инокулята, соблюдая обычный порядок, и засейте пробирку № 1, тщательно распределяя по всей поверхности. Если на дне пробирки скопилась конденсационная вода, используйте ее как разбавитель перед распределением содержимого петли по поверхности среды.

4. Не стерилизуя и не перезаряжая петлю, инокулируйте пробирку № 2, сделав три параллельных штриха от одного конца скошенной поверхности до другого.

5. Засейте остальные пробирки в серии «штрихами», как пробирку № 1.

6. Промаркируйте отличительным именем или номером и датой; поместите в термостат.

Рост, который последует в первых двух или трех пробирках серии, вероятно, будет настолько плотным, что окажется бесполезным. Однако ближе к концу серии будут обнаружены отдельные колонии, каждую из которых можно перенести в свежую пробирку с питательной средой без риска загрязнения соседними колониями.

«Обработка» пластин.—

Успешно получив пластину (или пробирочную культуру), на которой колонии хорошо выросли и достаточно отделены друг от друга, следует приступить к процессу «обработки», «выкалывания» или «вылавливания» колоний, чтобы получить субкультуры в чистом виде из каждой из присутствующих различных бактерий.

Иногда это довольно простая задача. Например, исходная смешанная культура при микроскопическом исследовании содержала грамположительный микрококк, грамположительную прямую палочку и грамотрицательную короткую палочку. Третья желатиновая пластина, приготовленная из этой смеси, при осмотре после четырехдневной инкубации показала двадцать пять колоний — семь влажных желтых колоний, каждая из которых погружалась в неглубокую ямку разжиженного желатина, четырнадцать плоских переливающихся пленочных колоний и четыре приподнятые белые слизистые колонии. Пленочный препарат (окрашенный по Граму) из каждой разновидности, исследованный микроскопически, показал, что желтая разжижающая колония состояла из грамположительных микрококков; плоская колония — из грамположительных палочек, а белая колония — из грамотрицательных палочек. По одной из каждой разновидности этих колоний переносили с помощью стерилизованной петли в свежую пробирку с желатиновой культурой, и после инкубации рост в каждой субкультуре соответствовал культурно и микроскопически росту колонии на пластине, из которой она была получена — таким образом, поставленная цель была бы достигнута.

Обычно, однако, колонии нельзя так легко дифференцировать, и если их не «обрабатывать» упорядоченным и систематическим образом, много труда будет потрачено впустую, а ценное время потеряно. Следующий метод минимизирует связанные с этим трудности.

(A) Осмотр.

a. Не открывая пластину, внимательно изучите различные колонии невооруженным глазом, с помощью часовой лупы или перевернув пластину на предметном столике микроскопа и рассматривая ее с помощью 1-дюймового объектива через дно пластины и слой среды.

b. Если можно обнаружить явные различия, отметьте маленьким кружком на дне пластины местоположение каждой из выбранных колоний с помощью воскового карандаша.

c. Если нельзя выделить очевидных различий, выберите девять колоний наугад и укажите их положение карандашными отметками на дне пластины.

(B) Вылавливание колоний.—

a. Возьмите стерильную чашку Петри и переверните ее на лабораторном столе. Проведите две параллельные линии на дне чашки восковым карандашом и еще две параллельные линии под прямым углом к первой паре — таким образом разделив площадь чашки на девять частей. Пронумеруйте верхнюю правую часть 1, а центральную нижнюю часть 8 (рис. 139). Переверните чашку обратно. Номера 1 и 8 легко распознаются через стекло и благодаря своему положению позволяют локализовать любое из других делений по номеру. Это «рабочая чашка».

b. Слегка приподнимите крышку чашки и с помощью стерильной пипетки с грушей нанесите маленькую каплю стерильной воды в центр каждого из девяти делений.

c. Стерилизованным платиновым шпателем поднимите одну из отмеченных колоний с «пластины 3» и перенесите ее в первое деление в расчерченной чашке, эмульгируя в ожидающей ее капле воды. Повторите этот процесс с оставшимися колониями, эмульгируя отдельную колонию в каждой капле воды.

(C) Предварительная дифференциация бактерий.—

a. Подготовьте мазок на покровном стекле из каждой капли эмульсии в «рабочей чашке» и пронумеруйте их в соответствии с делением, из которого они были взяты. Окрасьте по методу Грама.

b. Исследуйте микроскопически, используя иммерсионный объектив, и отметьте номера тех мазков, которые морфологически и по результатам окраски по Граму представляются состоящими из различных видов бактерий.

Fig. 139.—Diagram for stock plate.

(D) Подготовка изоляционных субкультур.—

a. Инокулируйте скошенный агар и пробирку с бульоном из эмульсии в рабочей чашке, соответствующей каждому из этих специально выбранных номеров.

b. Установите, включают ли мазки из девяти эмульсий в рабочей чашке все разновидности, представленные в мазке, сделанном из исходной смеси перед посевом на пластины.

c. Если некоторые разновидности отсутствуют, подготовьте вторую рабочую чашку из других колоний на пластине 3 и повторяйте процесс до тех пор, пока каждая морфологическая форма или тинкториальная разновидность не будет получена в субкультуре.

d. Поместите рабочие чашки в ледник в ожидании результатов инкубации. (Если какая-либо из субкультур не удалась, дополнительный материал можно получить из соответствующей эмульсии; или, если она высохла, увлажнив ее дополнительной каплей стерильной дистиллированной воды.)

e. Поместите все субкультуры в термостат и идентифицируйте отобранные организмы.

4. Дифференциальные среды.—

(a) Селективные.—Некоторые разновидности сред особенно подходят для определенных видов бактерий и позволяют им перерастать и, в конечном итоге, подавлять другие разновидности; например, сусло является наиболее подходящей основой среды для роста торул и дрожжей, и его следует использовать при заливке пластин для изоляции этих организмов. Чтобы получить чистую культуру дрожжей из смеси, содержащей также бактерии, часто достаточно инокулировать сусло из смеси и инкубировать при 37° C в течение двадцати четырех часов. Засейте свежую пробирку с суслом из полученного роста и инкубируйте. Повторите процесс еще раз, и из роста в этой третьей пробирке сделайте штрих на сусло-желатине и инкубируйте при 20° C. Полученный рост почти наверняка будет чистой культурой дрожжей.

(b) Подавляющие.—Верное утверждение также справедливо. Некоторые среды обладают способностью ингибировать рост большего или меньшего числа видов. Например, среды, содержащие карболовую кислоту в количестве 1 процента, будут ингибировать рост практически всего, кроме Bacillus coli communis.

5. Дифференциальная инкубация.—

При изоляции определенных бактерий используется тот факт, что разные виды различаются по своей оптимальной температуре. Смесь, содержащую Bacillus typhosus и Bacillus aquatilis sulcatus, например, можно засеять на две пробирки со скошенным агаром, одну инкубировать при 40° C, а другую при 12° C. После двадцати четырех часов инкубации первая покажет чистую культуру Bacillus typhosus, в то время как вторая будет почти чистой культурой Bacillus aquatilis.

6. Дифференциальная стерилизация.—

(a) Неспорообразующие бактерии.—Аналогичным образом можно воспользоваться различиями в термических точках гибели бактерий. Из смеси двух организмов, чьи термические точки гибели различаются, скажем, на 4° C — например, Bacillus pyocyaneus, термическая точка гибели 55° C, и Bacillus mesentericus vulgatus, термическая точка гибели 60° C — чистую культуру последнего можно получить путем нагревания смеси на водяной бане до 58° C и поддержания ее при этой температуре в течение десяти минут. Затем смесь засевают на свежие среды и инкубируют, после чего полученный рост будет состоять исключительно из B. mesentericus.

(b) Спорообразующие бактерии.—Этот метод находит свое основное практическое применение при дифференциации спорообразующего организма от того, который не образует спор. В этом случае смесь нагревают на водяной бане при 80° C в течение пятнадцати-двадцати минут. По истечении этого времени неспорообразующие бактерии погибают, и культуры, сделанные из смеси, дадут рост, возникающий только в результате прорастания спор.

Дифференциальная стерилизация при 80° C наиболее удобно осуществляется на водяной бане специальной конструкции, разработанной Бальфуром Стюартом (рис. 140). Она состоит из медного сосуда с двойными стенками, установленного на ножках и снабженного тубусом, сообщающимся с пространством между стенками. Это пространство почти заполнено бензолом (температура кипения 80° C; для этой цели необходимо использовать чистый бензол, свободный от тиофена, иначе температура кипения со временем постепенно и заметно повышается), а к тубусу прикреплена длинная стеклянная трубка длиной около 2 метров и диаметром около 0,75 см, служащая конденсатором (трубка вдвое меньшей длины, если она снабжена конденсационным расширением в центре, будет столь же эффективна). Внутренняя часть сосуда частично заполнена водой и накрыта крышкой с отверстием для термометра. Последний погружается в воду и регистрирует ее температуру. Очень маленького пламени горелки Бунзена под аппаратом достаточно, чтобы поддерживать кипение бензола и постоянную температуру воды внутри 80° C. Таким образом, баня всегда готова к использованию.

Метод.—Использование аппарата.

1. Поместите часть самой смеси, если она жидкая и содержит споры, или эмульсию таковой, если она получена из твердого материала, в пробирку.

2. Погрузите пробирку в воду, содержащуюся в бензольной бане, следя за тем, чтобы верхний уровень жидкости в пробирке находился по крайней мере на 2 см ниже поверхности воды в медном сосуде.

3. Температура воды, конечно, падает на несколько градусов после открытия бани и внесения пробирки с более холодной жидкостью, но через несколько минут температура снова достигнет 80° C.

4. Когда термометр снова покажет 80° C, отметьте время, а пятнадцать минут спустя удалите пробирку со смесью из бани.

5. Сделайте посевы на подходящие среды; поместите в термостат.

Fig. 140.—Benzole bath.

7. Дифференциальное культивирование в атмосфере.—

(a) Адаптируя атмосферные условия к конкретному организму, который желательно изолировать, сравнительно легко отделить строгий аэроб от строгого анаэроба и наоборот. В первом случае, однако, важно, чтобы культуры были сделаны на твердых средах, так как при проведении в жидких средах аэробы, размножающиеся в верхних слоях жидкости, делают глубину полностью анаэробной, и в этих условиях рост анаэробов будет продолжаться беспрепятственно.

(b) Когда желательно отделить факультативный анаэроб от строгого анаэроба, обычно достаточно засеять смесь на поверхность скошенного агара, инкубировать аэробно при 37° C и тщательно осматривать через частые интервалы. При первых признаках роста необходимо подготовить субкультуры и обработать их аналогичным образом. В результате этих быстрых субкультивирований факультативный анаэроб будет получен в чистой культуре примерно в третьем или четвертом поколении.

(c) Если, с другой стороны, требуется строгий анаэроб из смеси факультативных и строгих анаэробов, залейте пластины глюкозо-формиатного агара (или желатина) обычным способом, поместите их в банку Буллока или Нови и инкубируйте при подходящей температуре. Выберите колонии требуемого организма, когда появится рост, и перенесите в пробирки с различными средами.

Инкубируйте при подходящих условиях температуры и атмосферы.

8. Инокуляция животным.—

Наконец, при работе с патогенными организмами часто целесообразно инокулировать часть нечистой культуры (или даже часть исходного патологического материала) животному, специально выбранному из-за его восприимчивости к конкретному патогенному организму, который желательно инокулировать. Действительно, для некоторых из наиболее чувствительных и строго паразитических бактерий этот метод инокуляции животным является практически единственным методом, который даст удовлетворительный результат.

XVI. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ИЗУЧЕНИЯ.

Чтобы идентифицировать организм после изоляции, необходимо подготовить пробирочные, пластинчатые и другие культуры, инкубировать их при подходящих условиях температуры и окружающей среды и периодически исследовать (a) макроскопически, (b) микроскопическими методами, (c) химическими методами, (d) физическими методами, (e) методами инокуляции, и результаты этих исследований должны быть должным образом записаны.

Необходимо определенно заявить, что ни один микроорганизм не может быть идентифицирован по какому-либо одному признаку или свойству, будь то микроскопическому, биологическому или химическому, но, напротив, его полная история жизни должна быть тщательно изучена, и затем его идентичность установлена на основе рассмотрения суммы всех этих наблюдений.

Чтобы придать записанным результатам их максимальную ценность, необходимо, чтобы они были точными и систематическими, поэтому следует придерживаться какой-либо подобной схемы; и это особенно необходимо при описании организма, который ранее не был изолирован и изучен.

СХЕМА ИЗУЧЕНИЯ.

Обозначение:

Первоначально выделен (имя наблюдателя) в (дата), из (источник организма).

1. Культуральные признаки.—(См. Макроскопическое исследование культуры, стр. 261.)

Gelatine plates,}
Gelatine streak,} at 20°C.
Gelatine stab,}
Gelatine shake,}
 

Agar plates,}
Agar streak or smear,}
Agar stab,}
Inspissated blood-serum,} at 20° C. and 37°C.
Bouillon,}
Litmus milk,}
Potato,}

Специальные среды для демонстрации характерного внешнего вида.

2. Морфология.—(См. Микроскопическое исследование культур, стр. 272.)

Vegetative forms:

Shape.

Size.

Motility.

Flagella (if present).

Capsule (if present).

Involution forms.

Pleomorphism (if observed).

Sporing forms (if observed). Of which class?

Staining reactions.

3. Химические продукты роста.—(См. Химическое исследование культур, стр. 276.)

Chromogenesis.

Photogenesis.

Enzyme formation.

Fermentation of carbohydrates:

Acid formation.

Alkali formation.

Indol formation.

Phenol formation.

Reducing and oxidising substances.

Gas formation.

4. Биология.—(См. Физическое исследование культур, стр. 295.)

Atmosphere.

Temperature.

Reaction of nutrient media.

Resistance to lethal agents:

Physical:

Desiccation.

Light.

Colours.

Chemical germicides.

Vitality.

5. Патогенность:

Susceptible animals, subsequently arranged in order of susceptibility.

Immune animals.

Experimental inoculation, symptoms of disease.

Post-mortem appearances.

Virulence:

Length of time maintained.

Optimum medium?

Minimal lethal dose.

Exaltation and attenuation of virulence?

Toxin formation.

МАКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КУЛЬТУР.

При описании внешнего вида бактериального роста невооруженным глазом и при малом увеличении следует использовать описательные термины, введенные Честером (и включенные в следующую схему).

Твердые среды.

Чашечные культуры.—

Желатин.—Отметьте наличие или отсутствие разжижения окружающей среды. Если разжижение присутствует, отметьте форму и характер (см. стр. 269, «уколы»).

Агар.—В этой среде разжижения не происходит. Жидкость, обнаруженная на поверхности агара (или на дне пробирки в агаровых пробирочных культурах), является лишь водой, которая выделилась во время быстрого затвердевания среды и впоследствии сконденсировалась.

Желатин и агар.—Исследуйте колонии с интервалом в двадцать четыре часа.

(a) Невооруженным глазом.

(b) С помощью ручной лупы или часового стекла.

(c) Под малым увеличением (1 дюйм) микроскопа или с помощью небольшого препаровального микроскопа.

Различайте поверхностные и глубинные колонии и отметьте характеристики отдельных колоний.

(A) Размер.—Диаметр в миллиметрах в разном возрасте.

(B) Форма.—

Точечная: Размеры слишком малы для определения формы невооруженным глазом; крошечные, приподнятые, полусферические.

Круглая: Более или менее кругового очертания.

Эллиптическая: Более или менее овального очертания.

Неправильная: Очертания не соответствуют какой-либо распознаваемой форме.

Веретеновидная: Веретенообразная, сужающаяся на каждом конце.

Улиткообразная: Спиральная или скрученная, как раковина улитки (рис. 141, a).

Fig. 141.—Types of colonies: a, Cochleate; b,
amœboid; c, mycelioid.

Амебоидная: Очень неправильная, струящаяся (рис. 141, b).

Мицелиоидная: Нитевидная колония с радиальным характером плесени (рис. 141, c).

Нитевидная: Неправильная масса слабо переплетенных нитей (рис. 142, a).

Хлопьевидная: Плотной шерстистой структуры.

Ризоидная: Неправильного, разветвленного, корнеподобного характера (рис. 142, b).

Конгломератная: Агрегат колоний одинакового размера и формы (рис. 142, c).

Торулоидная: Агрегат колоний, похожий на почкование дрожжевого растения (рис. 142, d).

Розеточная: Формой напоминающая розетку.

Fig. 142.—Types of colonies: a, Filamentous; b,
rhizoid; c, conglomerate; d, toruloid.

(C) Возвышение поверхности.—

1. Общий характер поверхности в целом:

Плоская: Тонкая, листовидная, распространяющаяся по поверхности (рис. 143, a).

Эффузная: Распространенная по поверхности в виде тонкого, вуалеподобного слоя, более нежного, чем предыдущий.

Приподнятая: Рост толстый, с резкими террасовидными краями (рис. 143, b).

Выпуклая: Поверхность — сегмент круга, но очень полого выпуклая (рис. 143, c).

Пульвинатовидная: Поверхность — сегмент круга, но решительно выпуклая (рис. 143, d).

Капитатовидная: Поверхность полусферическая (рис. 143, e).

Умбиликатовидная: Имеющая центральную ямку или углубление (рис. 143, f).

Коническая: Конус с закругленной вершиной (рис. 143, g).

Умбонатная: Имеющая центральное выпуклое сосковидное возвышение (рис. 143, h).

2. Детальные характеристики поверхности:

Гладкая: Поверхность ровная, без каких-либо из следующих отличительных признаков.

Альвеолярная: Отмечена углублениями, разделенными тонкими стенками, так что напоминает соты (рис. 144).

Пунктированная: Покрыта точками, как от уколов булавкой.

Буллатная: Как волдыристая поверхность, поднимающаяся выпуклыми выступами, довольно грубая.

Везикулярная: Более или менее покрыта крошечными пузырьками из-за образования газа; более мелкая, чем буллатная.

Fig. 143.—Surface elevation of colonies: a, Flat; b,
raised; c, convex; d, pulvinate; e, capitate; f, umbilicate;
g, conical; h, umbonate.

Fig. 144.—Types of colonies—alveolate.

Веррукозная: Бородавчатая, несущая бородавчатые выступы.

Сквамозная: Чешуйчатая, покрытая чешуйками.

Эхинатная: Покрытая заостренными выступами.

Папиллатная: Покрытая сосковидными или мамма-подобными отростками.

Рутозная: Короткие неправильные складки из-за сморщивания поверхностного роста.

Гофрированная: Длинные складки из-за сморщивания.

Контурная: Неправильная, но плавно волнистая поверхность, напоминающая поверхность рельефной карты.

Римозная: Изобилующая трещинами, расщелинами или разломами.

(D) Внутренняя структура колонии (микроскопическая).—

Слабая рефракция: Контур и поверхность рельефа не сильно выражены.

Сильная рефракция: Контур и поверхность рельефа сильно выражены; плотные, не нитевидные колонии.

Fig. 145.—Types of colonies: a, Grumose; b,
moruloid; c, clouded.

1. Общие:

Аморфная: Без какой-либо определенной структуры, такой как указано ниже.

Гиалиновая: Прозрачная и бесцветная.

Гомогенная: Структура однородна во всех частях колонии.

Гомохромная: Цвет однороден по всей площади.

2. Грануляции или пятнистость:

Мелкозернистая.

Крупнозернистая.

Грумозная: Более грубая, чем предыдущая, с комковатым видом и частицами в виде скоплений зерен (рис. 145, a).

Морулоидная: Имеющая характер шелковицы, сегментированная, посредством чего колония разделена на более или менее правильные сегменты (рис. 145, b).

Облаковидная: Имеющая бледный фон с нечетко выраженными пятнами более глубокого оттенка (рис. 145, c).

Fig. 146.—Types of colonies: a, Reticulate; b,
gyrose; c, marmorated.

3. Маркировка или полосатость колонии:

Ретикулярная: В форме сети, как жилки листа (рис. 146, a).

Ареолярная: Разделенная на довольно неправильные или угловатые пространства более или менее определенными границами.

Гирозная: Отмеченная волнистыми линиями, расположенными неопределенно (рис. 146, b).

Марморированная: Показывающая слабые неправильные полосы или пересеченная жилкоподобными отметинами, как в мраморе (рис. 146, c).

Ривулозная: Отмеченная линиями, как реки на карте.

Римозная: Показывающая трещины, разломы или расщелины.

Fig. 147.—Types of colonies—curled.

4. Нитевидные колонии:

Нитевидная: Как определено ранее.

Хлопьевидная: Состоящая из нитей, плотно расположенных.

Курчавая: Нити в параллельных прядях, как локоны или колечки (рис. 147).

(E) Края колоний.—

Цельные: Без зубцов или делений (рис. 148, a).

Волнистые: Волнистые (рис. 148, b).

Репандовидные: Как край открытого зонтика (рис. 148, c).

Эрозивные: Как будто изъеденные, неправильно зубчатые (рис. 148, d).

Fig. 148.—Edges of colonies: a, Entire; b, undulate;
c, repand; d, erose.

Лопастные.

Лобулятные: Мелколопастные (рис. 149, e).

Аурикулятные: С ушковидными лопастями (рис. 149, f).

Лацератные: Неправильно расщепленные, как будто разорванные (рис. 149, g).

Фимбриатные: Бахромчатые (рис. 149, h).

Цилиатные: Волосковидные расширения, расположенные радиально (рис. 149, j).

Хохолковые.

Нитевидная: Как определено ранее.

Курчавая: Как определено ранее.

Fig. 149.—Edges of colonies: e, Lobar-lobulate; f,
auriculate; g, lacerate; h, fimbriate; i, ciliate.

(F) Оптические характеристики (по Шаттлворту).—

1. Общие характеристики:

Прозрачная: Пропускающая свет.

Стекловидная: Прозрачная и бесцветная.

Маслянистая: Прозрачная и желтая; от оливкового до цвета льняного масла.

Смолистая: Прозрачная и коричневая, цвета лака или смолы.

Полупрозрачная: Слабо прозрачная.

Фарфоровидная: Полупрозрачная и белая.

Опалесцирующая: Полупрозрачная; серовато-белая в отраженном свете.

Перламутровая: Полупрозрачная, серовато-белая, с жемчужным блеском.

Сальная: Полупрозрачная, желтоватая или серовато-белая.

Маслянистая (бутирозная): Полупрозрачная и желтая.

Восковидная: Полупрозрачная и цвета воска.

Непрозрачная.

Меловая: Непрозрачная и белая, известковая.

Матовая: Без блеска.

Блестящая: Сияющая.

Флуоресцирующая.

Переливающаяся.

2. Хромогенность:

Цвет пигмента.

Пигмент ограничен колониями.

Пигмент ограничен средой, окружающей колонии.

Пигмент присутствует в колониях и в среде.

Посевы штрихом или мазком.—

Желатин и агар.—Отметьте общие моменты, как указано для чашечных культур.

Сгущенная сыворотка крови.—Отметьте наличие или отсутствие разжижения среды. (Наличие конденсационной воды на дне пробирки не следует путать с разжижением среды.)

Все культуры на скошенной среде.—

1. Колонии изолированные: Размер, форма и т. д., как для чашечных культур (см. стр. 261).

2. Колонии сливающиеся: Возвышение поверхности и характер края, как для чашечных культур (см. стр. 263).

Хромогенность: Как для чашечных культур.

Культуры уколом в желатин.

(A) Поверхностный рост. — Как и для отдельных колоний в чашечных культурах (см. стр. 261).

Fig. 150.—Stab cultivations—types of growth: a,
Filiform; b, beaded; c, echinate; d, villous; e, arborescent.

(B) Линия укола. —

Филиформный (нитевидный): равномерный рост без особых характеристик (рис. 150, a).

Нодозный (узловатый): состоящий из тесно сгруппированных колоний.

Четковидный: состоящий из редко расположенных или разобщенных колоний (рис. 150, b).

Папиллярный (сосочковый): покрытый сосочковидными выростами.

Эхинатный (шиповатый): покрытый игольчатыми выростами (рис. 150, c).

Виллезный (ворсинчатый): покрытый короткими, неразветвленными волосовидными выростами (рис. 150, d).

Плюмозный (перистый): нежный перистый рост.

Fig. 151.—Stab cultivations—types of growth: f,
Crateriform; g, saccate; h, infundibuliform; j, napiform; k,
fusiform; l, stratiform.

Арборесцентный (древовидный): разветвленный или древовидный, покрытый разветвленными волосовидными выростами (рис. 150, e).

(C) Зона разжижения (если присутствует). —

Кратериформный (чашевидный): разжижение желатина в форме блюдца (рис. 151, f).

Саккатный (мешковидный): форма удлиненного мешка, трубчато-цилиндрическая (рис. 151, g).

Инфундибулиформный (воронковидный): форма воронки, коническая (рис. 151, h).

Напиформный (реповидный): форма репы (рис. 151, j).

Фузиформный (веретеновидный): контур пастернака, суженный на обоих концах, наиболее широкий под поверхностью (рис. 151, k).

Стратиформный (пластовидный): разжижение, распространяющееся до стенок пробирки и горизонтально вниз (рис. 151, l).

(D) Характер разжиженного желатина. —

1. Пленка на поверхности.

2. Равномерное помутнение.

3. Зернистость.

4. Преимущественно прозрачный, но содержащий хлопья.

5. Осадок на дне разжиженной части.

(E) Образование пузырьков газа.

Культуры в толще агара (shake cultures). —

1. Наличие или отсутствие разжижения.

2. Образование пузырьков газа.

3. Основная масса роста на поверхности — аэробный.

4. Основная масса роста в глубине — анаэробный.

Жидкие питательные среды.

1. Поверхность жидкости. —

Наличие или отсутствие пены из-за пузырьков газа.

Наличие или отсутствие образования пленки.

Характер пленки.

2. Толща жидкости. —

Равномерное помутнение.

Хлопья во взвешенном состоянии.

Гранулы во взвешенном состоянии.

Прозрачная, с осадком на дне пробирки.

Окрашивание жидкости, наличие или отсутствие.

3. Осадок. —

Характер.

Количество.

Цвет.

Углеводные среды. —

Рост.

Реакция.

Газообразование.

Коагуляция или отсутствие коагуляции сывороточного альбумина (при использовании сред на сывороточной воде).

Культивирование на лакмусовом молоке. —

{Unaltered.
1. Reaction:{Acid.
{Alkaline.
2. Odour.
3. Formation of gas.
{Unaltered.
4. Consistency:{Peptonised (character of solution).
{Coagulated.
{hard: solid.
5. Clot: Character{soft: floculent.
{ragged and broken up by gas bubbles.

(a) Сгусток не растворяется.

(b) Сгусток в конечном итоге пептонизируется: полностью, не полностью.

Получающийся раствор: прозрачный, мутный.

{Abundant.
{Scanty.
6. Whey:{Clear.
{Turbid.
{Coagulated by boiling, or not.

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

В идеале препараты должны быть приготовлены из чистых культур через 4, 6, 8, 12, 18 и 24 часа; а затем с интервалами, скажем, в двадцать четыре часа в течение всего периода наблюдения, и исследованы —

(A) Живые. — 1. В висячей капле, для определения подвижности или неподвижности.

В этой связи необходимо помнить, что при определенных условиях окружающей среды (например, при исследовании в неподходящей среде, атмосфере, температуре и т. д.) подвижные бациллы могут не проявлять активности. Поэтому ни один микроорганизм не должен быть записан как неподвижный на основании только одного наблюдения; серия наблюдений в разном возрасте и при различных условиях должна составлять основу мнения об отсутствии истинного движения.

Размер. — В случае неподвижных или вялоподвижных организмов следует попытаться измерить несколько особей в каждой висячей капле с помощью окулярного микрометра или эйконометра (см. стр. 63) и усреднить результаты.

Если организм является спорообразующим, наблюдайте —

(a) Спорообразование. — Приготовьте культуры в висячей капле (см. стр. 78) из вегетативных форм организма, добавив в каплю на кончике платиновой иглы следы раствора мадженты (0,5%) или другого прижизненного красителя (см. стр. 77), чтобы облегчить наблюдение за явлением, сделав бациллы более отчетливыми.

Поместите препарат на предметный столик микроскопа; при необходимости используйте термостолик.

Настройте освещение и т. д. и выберите одиночную бациллу для наблюдения с помощью 1/6-дюймового объектива.

Замените 1/6-дюймовый объектив на 1/12-дюймовый иммерсионный и наблюдайте за образованием споры; если возможно, измерьте любые изменения размера, которые могут произойти, с помощью микрометра Рамсдена.

(b) Прорастание спор. — Приготовьте культуры в висячей капле из старых культур, в которых отсутствуют живые вегетативные формы, и наблюдайте процесс прорастания аналогичным образом.

Комфорт микроскописта значительно повышается в тех случаях, когда период наблюдения довольно длительный, за счет использования какой-либо формы глазного экрана перед неработающим глазом, подобного тому, который изображен на стр. 58 (рис. 49).

Если невозможно выполнить предложенный выше метод, действуйте следующим образом:

(a) Спорообразование. — Посейте организм в бульон и инкубируйте при оптимальных условиях.

Через регулярные интервалы, скажем каждые тридцать минут, берите петлю культуры и готовьте мазок на покровном стекле.

Фиксируйте, пока препарат еще влажный, в фиксирующем растворе сулемы.

Окрасьте анилиновым генциан-фиолетовым и частично обесцветьте 2% уксусной кислотой.

Заключите в среду, пронумеруйте последовательно, а затем исследуйте.

(b) Прорастание спор. — Подвергните густую эмульсию спор воздействию температуры 80° C в течение десяти минут в дифференциальном стерилизаторе (см. стр. 257).

Перенесите эмульсию в пробирку со стерильным питательным бульоном и инкубируйте.

Берите образцы из культуры в пробирке с интервалами, скажем, в пять минут.

Фиксируйте, окрашивайте и т. д. во влажном состоянии, как в пункте (a), и исследуйте.

(B) Фиксированные. — 2. В окрашенных препаратах.

(a) Для определения морфологических признаков:

Форма (см. классификацию, стр. 131).

Размер:

(a) Приготовьте мазки на покровных стеклах в разном возрасте и зафиксируйте путем воздействия температуры 115° C в течение двадцати минут в сушильном шкафу.

(b) Окрасьте препараты по методу Грама (если применимо) или разбавленным карболовым фуксином и заключите обычным способом.

(c) Измерьте (см. стр. 66) около двадцати пяти особей в каждом мазке с помощью микрометра Рамсдена или предметного микрометра и усредните результат.

Плеоморфизм: Если отмечен, запишите —

The predominant character of the variant forms.

On what medium or media they are observed.

At what period of development.

(b) Для демонстрации деталей структуры:

Жгутики: Если отмечены, запишите —

Method of staining (vide page 101).

Position and arrangement (vide page 136).

Number.

Споры: Если отмечены, запишите —

Method of staining.

Shape.

Size.

Position within the parent cell.

Condition, as to shape, of the parent cell (vide page 139).

Optimum medium and temperature.

Age of cultivation.

Conditions of environment as to temperature, atmosphere.

Method of germination (vide page 140).

Инволюционные формы: Если отмечены, запишите —

Method of staining.

Character (e. g., if living or dead).

Shape.

On what medium they are observed.

Age of medium.

Environment.

Метахроматические гранулы: Если отмечены, запишите —

Method of staining.

Character of granules.

Number of granules.

Colour of granules.

3. Реакции окрашивания. —

1. Метод Грама. — Положительный или отрицательный.

2. Метод Нейссера. — Если отмечены гранулы, запишите —

1. Position.

2. Number.

3. Метод Циль-Нильсена. — Кислотоустойчивый или обесцвеченный.

4. Простые анилиновые красители. — (Отметьте те, которые дают наилучшие результаты, с подробным описанием процессов окрашивания.)

Methylene-blue}
Fuchsin} and their modifications.
Gentian violet}
Thionine blue}

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

Протестируйте культуры организма на наличие —

Растворимых ферментов — протеолитических, диастатических, инвертазы.

Органических кислот — (a) количественно — т. е. оцените общее производство кислоты; (b) качественно на муравьиную, уксусную, пропионовую, масляную, молочную.

Аммиака.

Нейтральных летучих веществ — этилового спирта, альдегида, ацетона.

Ароматических продуктов — индола, фенола.

Растворимых пигментов.

Проверьте способность к восстановлению (a) красящих веществ, (b) нитратов в нитриты.

Исследуйте газообразование — H2S, CO2, H2. Оцените соотношение между двумя последними газами.

Подготовьте все культуры для этих методов исследования при оптимальных условиях, предварительно определенных для каждого из организмов, которые предполагается исследовать, в отношении

(a) Reaction of medium;

(b) Incubation temperature;

(c) Atmospheric environment;

и ведите тщательный учет этих моментов, а также возраста культуры, использованной при окончательном исследовании.

Исследуйте культуры на наличие различных продуктов бактериального метаболизма через сорок восемь часов роста и никогда не забывайте исследовать «контрольную» (неинокулированную) пробирку или колбу со средой из той же партии, выдержанную в течение аналогичного периода при идентичных условиях.

Если результаты отрицательные, протестируйте дополнительные культуры через три дня, пять дней и десять дней.

1. Образование ферментов. —

(A) Протеолитические ферменты. — (Превращают белки в протеозы, пептоны и дальнейшие продукты гидролиза; например, B. pyocyaneus.)

Необходимые среды:

Сыворотка крови и сыворотка молока, которые были тщательно отфильтрованы через фарфоровую свечу.

Необходимые реактивы:

Ammonium sulphate.

Thirty per cent. caustic soda solution.

Copper sulphate, 0.5 per cent. aqueous solution.

One per cent. acetic acid solution.

Millon's reagent.

Glyoxylic acid solution.

Concentrated sulphuric acid.

Метод. —

1. Приготовьте культуры в большом объеме (50 мл) в колбе и инкубируйте.

2. Сделайте жидкость слабокислой с помощью уксусной кислоты, затем прокипятите. (Это осаждает неизмененные белки.)

3. Отфильтруйте.

4. Возьмите 10 мл фильтрата в пробирку и добавьте 1 мл каустической соды, затем добавляйте сульфат меди по каплям.

Розовый цвет, который становится фиолетовым при добавлении большего количества сульфата меди = протеозы и пептоны.

5. Насытьте остаток фильтрата сульфатом аммония.

Осадок = протеоза.

6. Отфильтруйте и разделите фильтрат на три части a, b и c.

a. Повторите тест с сульфатом меди, используя избыток каустической соды для вытеснения аммиака из сульфата аммония.

Розовый цвет = пептон.

b. Прокипятите с реактивом Миллона.

Красный цвет = тирозин.

c. Добавьте раствор глиоксиловой кислоты и влейте концентрированную серную кислоту.

Фиолетовое кольцо на верхнем уровне кислоты = триптофан.

И тирозин, и триптофан могут находиться как в свободном состоянии, так и в соединении в виде полипептида или пептона.

(B) Диастаза. — (Превращает крахмал в сахар; например, B. subtilis.)

Необходимая среда:

Бульон, свободный от инозита.

Необходимые реактивы:

Starch.

Thymol.

Fehling's solution.

Метод. —

1. Приготовьте культуру в пробирке и инкубируйте.

2. Приготовьте жидкий крахмальный клейстер и добавьте к нему 2% тимола.

3. Смешайте равные части тестируемой культуры и крахмального клейстера и поместите в инкубатор при 37° C на шесть-восемь часов.

4. Отфильтруйте.

Протестируйте фильтрат на сахар.

Прокипятите немного реактива Фелинга в пробирке.

Добавляйте фильтрат по каплям до тех пор, пока, если необходимо, не будет добавлено количество, равное объему использованного реактива Фелинга, поддерживая смесь при температуре кипения во время процесса.

Желтый или оранжевый осадок = сахар.

(C) Инвертаза. — (Превращает сахарозу в смесь декстрозы и левулозы; например, B. fluorescens liquefaciens.)

Medium Required:

Inosite-free bouillon.

Reagents Required:

Cane sugar, 2 per cent. aqueous solution.

Carbolic acid.

Метод. —

1. Приготовьте культуры в пробирках и инкубируйте.

2. Добавьте 2% карболовой кислоты к раствору сахара.

3. Смешайте равные количества карболизованного раствора сахара и культуры в пробирке; дайте смеси постоять несколько часов.

4. Отфильтруйте.

Протестируйте фильтрат на восстанавливающий сахар, как в предыдущем разделе.

(D) Реннин и ферменты типа «Lab». — (Коагулируют молоко независимо от действия кислот; например, B. prodigiosus.)

Media Required:

Inosite-free bouillon.

Litmus milk.

Метод. —

1. Приготовьте культуры в пробирках и инкубируйте.

2. После инкубации нагрейте культуру до 55° C в течение получаса для стерилизации.

3. С помощью стерильной пипетки внесите 5 мл культуры в каждую из трех пробирок с лакмусовым молоком.

4. Поместите в холодный инкубатор при 22° C и исследуйте каждый день в течение десяти дней.

Отсутствие коагуляции по истечении этого периода будет указывать на отсутствие образования фермента реннина.

Реакции ферментации.

При тестировании на углеводных веществах и органических солях.

Необходимые среды:

Пептонная вода, содержащая различные процентные доли (обычно 2%) каждого из веществ, упомянутых в разделе «сахарные» среды (стр. 177), а также пробирки с пептонной водой, содержащие по 1% каждого из следующих веществ:

Органические соли: цитрат натрия, формиат, лактат, малат, тартрат.

Метод. —

1. Приготовьте культуры в пробирках на каждой из вышеуказанных сред.

2. Наблюдайте изо дня в день до истечения десяти дней, если необходимо.

3. Отметьте рост, реакцию, газообразование.

2. Образование кислоты.

(a) Quantitative.—

Medium Required:

Sugar (glucose) bouillon of known "optimum" reaction.

Apparatus and Reagents Required:

As for estimating reaction of media (vide page 150).

Метод. —

1. Приготовьте культуру в большом объеме (100 мл) в колбе; также «контрольную» колбу со средой из той же партии.

2. После соответствующей инкубации нагрейте обе колбы в паровом стерилизаторе при 100° C в течение тридцати минут для стерилизации.

3. Определите титр среды в «инокулированной» и «контрольной» колбах, как описано при приготовлении питательных сред (см. стр. 151).

4. Разница между титром среды в двух колбах дает общее количество кислоты, образованной исследуемой бактерией, в пересчете на нормальный NaOH.

Примечание. — Если рост очень обильный, определение конечной точки может быть затруднительным. В этом случае культуру следует отфильтровать через свечу Беркефельда перед шагом 2 и использовать фильтрат при титровании.

(b) Qualitative (of all the organic acids present).—

Medium Required:

Sugar (glucose or lactose) bouillon as in quantitative examination.

Reagents Required:

Hydrochloric acid, concentrated.

Hydrochloric acid, 25 per cent.

Sulphuric acid, concentrated (pure).

Phosphoric acid, concentrated solution.

Ammonia.

Ammonium sulphate.

Baryta water.

Sodium carbonate, saturated aqueous solution.

Absolute alcohol.

Ether.

Calcium chloride.

Calcium chloride solution.

Zinc carbonate.

Copper sulphate saturated aqueous solution.

Alcoholic thiophene solution (0.15 c.c. in 100 c.c.).

Animal charcoal.

Five per cent. sodium nitroprusside solution.

Potassium bichromate.

Schiff's reagent.

Arsenious oxide.

Ferric chloride, 4 per cent. aqueous solution.

Silver nitrate, 1 per cent. aqueous solution.

Lugol's iodine.

Ten per cent. caustic soda solution.

Hard paraffin wax (melting-point about 52° C.).

Метод. —

1. Приготовьте культуру в большом объеме (500 мл) в литровой колбе и добавьте 10 граммов стерилизованного осажденного мела. Инкубируйте при оптимальной температуре.

2. После инкубации бросьте в культуру кусочек парафина (кубик около сантиметра) и соедините колбу с холодильником.

Парафин, который плавится и образует тонкий слой на поверхности жидкости, необходим для предотвращения вспенивания культуры и ее попадания в неизмененном виде в холодильник во время последующего процесса дистилляции.

3. Отогнать 200–300 мл.

Используйте горелку с рассекателем, чтобы минимизировать опасность растрескивания колбы; с той же целью хорошо перемешивайте содержимое колбы, чтобы мел не оседал.

Дистиллят «A» будет содержать спирт и т. д. (см. стр. 285); остаток «a» будет содержать летучие и нелетучие кислоты.

4. Отсоедините колбу и отфильтруйте. Остаток «a» затем = фильтрат B и остаток b.

Fig. 152.—Arrangement of distillation apparatus for
acids, etc.

5. Остаток b. Смойте остаток с фильтровальной бумаги, растворите путем нагревания с разбавленной соляной кислотой и добавьте раствор хлорида кальция и аммиак до щелочной реакции.

Белый осадок, нерастворимый в уксусной кислоте = щавелевая кислота.

6. Доведите фильтрат B до 500 мл дистиллированной водой и разделите на две части.

7. Подкислите 250 мл 20 мл концентрированной фосфорной кислоты (это высвобождает летучие кислоты) и отогнать до малого объема.

Дистиллят «B» может содержать муравьиную, уксусную, пропионовую, масляную и бензойную кислоты.

ДИСТИЛЛЯТ «B». (Летучие кислоты.) ¦ ¦ 1. Добавьте баритовую воду до щелочной реакции и выпарьте досуха. 2. Добавьте 50 мл абсолютного спирта и дайте постоять при частом перемешивании в течение двух-трех часов. 3. Отфильтруйте и промойте спиртом. ¦ ¦ ¦---------------------------------------¦ ¦ ¦ ¦ ФИЛЬТРАТ ОСТАТОК ¦ ¦ ¦ ¦ может содержать пропионат бария, может содержать ацетат бария, бутират бария. формиат бария, бензоат бария. ¦ ¦ ¦ ¦ 1. Выпарьте досуха. 1. Выпарьте спирт и растворите 2. Растворите остаток в 150 остаток на фильтре в горячей воде мл воды. и нейтрализуйте. 3. Подкислите фосфорной 2. Разделите раствор на кислотой и отогнать. четыре порции: 4. Насытьте дистиллят (a) Добавьте раствор хлорида хлоридом кальция и отогнать железа. несколько мл. Коричневый цвет = уксусная или 5. Протестируйте дистиллят на муравьиная кислоты. масляную кислоту: Буроватый осадок = бензойная Добавьте 3 мл спирта и 4 капли кислота (см. кислоты, растворимые концентрированной серной кислоты. в эфире). Запах ананаса = масляная (b) Добавьте раствор нитрата кислота. серебра; затем добавьте одну каплю Пропионовая кислота в малых аммиачной воды и прокипятите. количествах не может быть Черный осадок металлического отличима от масляной кислоты серебра = муравьиная кислота. с помощью тестов в рамках бактериологической лаборатории. (c) Выпарьте досуха; смешайте с равным количеством оксида мышьяка и нагрейте на платиновой фольге. Неприятный запах какодила = уксусная кислота. (d) Добавьте несколько капель раствора хлорида ртути в пробирку и нагрейте до 70° C. Осадок хлорида ртути(I), который медленно восстанавливается до ртути = муравьиная кислота.

8. Если дистилляцию «B» продолжать до тех пор, пока кислота продолжает переходить (периодически добавляя дистиллированную воду в перегонную колбу), дистиллят можно измерить и использовать 50 мл для титрования. Это даст количество образовавшейся летучей кислоты.

9. Вторую часть фильтрата «B» (см. стр. 282) следует исследовать на молочную, щавелевую, янтарную, бензойную, салициловую, галловую и дубильную кислоты следующим образом:

Кислоты, растворимые в эфире. —

1. Выпарьте до состояния жидкого сиропа, сильно подкислите фосфорной кислотой.

2. Экстрагируйте пятикратным объемом эфира путем встряхивания в делительной воронке.

3. Выпарьте эфирный экстракт до состояния жидкого сиропа.

4. Добавьте 100 мл воды и тщательно перемешайте.

5. К небольшой порции этого раствора добавьте небольшой избыток карбоната натрия, выпарьте досуха на водяной бане, растворите в 5–10 мл чистой серной кислоты, добавьте 2 капли насыщенного раствора сульфата меди, поместите в пробирку и нагревайте на кипящей водяной бане в течение 2 минут, охладите, добавьте 2 или 3 капли спиртового раствора тиофена и слегка подогрейте.

Вишнево-красный цвет = молочная кислота.

Если при добавлении серной кислоты появляется коричневый цвет, следует взять другой образец и прокипятить с животным углем перед выпариванием.

6. Если молочная кислота определенно присутствует, приготовьте лактат цинка путем кипячения части раствора эфирного экстракта с избытком карбоната цинка, фильтрования и выпаривания до кристаллизации. Полученные таким образом кристаллы имеют характерную форму и при высушивании при 110° C должны содержать 26,87% цинка.

7. Протестируйте порцию остатка раствора эфирного экстракта на щавелевую кислоту (стр. 282, шаг 5). Тщательно нейтрализуйте остаток и добавьте раствор хлорида железа.

Красно-коричневый студенистый осадок = янтарная кислота.

Буроватый осадок = бензойная кислота и другие кислоты, родственные бензойной кислоте.

Фиолетовый цвет = салициловая кислота.

Чернильно-черный цвет или осадок = галловая кислота или дубильная кислота.

Для дальнейшей идентификации следует определить температуры плавления кристаллических кислот и процентное содержание серебра в их серебряных солях.

3. Образование аммиака. —

Medium Required:

Nutrient bouillon.

Reagent Required:

Nessler reagent.

Метод. —

1. Приготовьте культуру в большом объеме (100 мл) в колбе на 250 мл и инкубируйте вместе с контрольной колбой.

Протестируйте культуру и контроль на аммиак следующим образом:

2. В каждую колбу добавьте 2 грамма прокаленной магнезии, затем соедините с холодильниками и отогнать.

3. Соберите по 50 мл дистиллята из каждой в стакан Несслера.

4. Добавьте 1 мл реактива Несслера в каждый стакан с помощью чистой пипетки.

Желтый цвет = аммиак.

Интенсивность цвета пропорциональна количеству присутствующего вещества.

4. Образование спирта и т. д. — Разделите дистиллят «A», полученный в ходе предыдущего эксперимента (см. стр. 282, шаг 3), на четыре порции и протестируйте на образование спирта, ацетальдегида, ацетона.

1. Добавьте йод Люголя, затем немного раствора NaOH и перемешайте стеклянной палочкой, пока цвет йода не исчезнет.

Бледно-желтый кристаллический осадок йодоформа с его характерным запахом, появляющийся в холоде, указывает на ацетальдегид или ацетон; появляющийся только при нагревании указывает на спирт.

Осадок может отсутствовать, даже если запах выражен.

2. Добавьте реактив Шиффа.

Фиолетовый или красный цвет = альдегид.

3. К 10 мл раствора добавьте 2,5 мл 25% серной кислоты и кристаллик или два бихромата калия и отогнать. Восстановление бихромата до зеленого цвета и дистиллят, который пахнет ацетальдегидом и реагирует с реактивом Шиффа, показывают наличие спирта в исходной жидкости.

4. Добавьте несколько капель раствора нитропруссида натрия, сделайте щелочным с помощью аммиака, затем насытьте кристаллами сульфата аммония. Ацетон дает слабый цвет при добавлении аммиака, но после добавления сульфата аммония — глубокий перманганатный цвет, который достигает своей полной интенсивности через десять минут. Альдегид дает карминно-красный цвет, не изменяющийся сульфатом аммония.

5. Образование индола. —

Media Required:

Inosite-free bouillon (vide page 183).

Or peptone water (vide page 177).

Reagents Required:

Potassium persulphate, saturated aqueous solution.

Paradimethylamino-benzaldehyde solution. This is prepared by mixing:

Paradimethylamino-benzaldehyde 4 grammes

Absolute alcohol 380 c.c.

Hydrochloric acid, concentrated 80 c.c.

Метод. —

Приготовьте несколько культур организма в пробирках и инкубируйте.

Протестируйте на индол с помощью реакции Розиндола следующим образом. (Если культура инкубировалась при 37° C, ее необходимо охладить до комнатной температуры перед проведением теста.)

1. Возьмите 2 мл культуры с помощью стерильной пипетки и перенесите в чистую пробирку, затем,

2. Добавьте 2 мл раствора парадиметиламинобензальдегида.

3. Добавьте 2 мл раствора персульфата калия.

Присутствие индола обозначается появлением нежного розово-розового цвета во всей смеси, который слегка углубляется при стоянии.

Индол во многих лабораториях тестируется с помощью обычной нитрозоиндольной реакции, которая, однако, не является таким чувствительным методом, как описанный выше. Тест проводится следующим образом:

1. Удалите ватную пробку из пробирки и влейте 1 мл чистой концентрированной серной кислоты по стенке пробирки с помощью стерильной пипетки. Поместите пробирку вертикально в штатив и дайте ей постоять, если необходимо, в течение десяти минут.

Розово-розовый или красный цвет на границе двух жидкостей = индол (плюс нитрит).

2. Если цвет среды остается неизменным, добавьте 2 мл 0,01% водного раствора нитрита натрия и снова дайте культуре постоять десять минут.

Красное окрашивание = индол.

Примечание. — Вместо выполнения теста в две стадии, как указано выше, в культуру можно влить 2 мл концентрированной коммерческой серной, соляной или азотной кислоты (все из которых содержат следы нитрита в растворе). Появление красного цвета в течение двадцати минут будет указывать на присутствие индола.

5a. Образование фенола. —

Medium Required:

Nutrient bouillon.

Reagents Required:

Hydrochloric acid, concentrated.

Millon's reagent.

Ferric chloride, 1 per cent. aqueous solution.

Метод. —

1. Приготовьте культуру в богемской колбе, содержащей не менее 50 мл среды, и инкубируйте.

Протестируйте на фенол следующим образом:

2. Add 5 c.c., 25 per cent. sulphuric acid to the cultivation and
connect up the flask with a condenser.

3. Отогнать 15–20 мл. Разделите дистиллят на три порции a, b и c.

4. Добавьте к (a) 0,5 мл реактива Миллона и прокипятите.

Красный цвет = фенол.

5. Добавьте к (b) около 0,5 мл раствора хлорида железа. Фиолетовый цвет = фенол.

(Если дистиллят кислый, реакция будет отрицательной.)

6. Добавьте к (c) бромную воду. Кристаллический белый осадок трибромфенола = фенол.

Примечание. — Если в культурах одного и того же организма, по-видимому, присутствуют и индол, и фенол, их следует разделить перед тестированием. Это можно сделать следующим образом:

1. Приготовьте культуру на бульоне, свободном от инозита, скажем 200 или 300 мл, в колбе, как и раньше.

2. Сделайте среду определенно кислой путем добавления уксусной кислоты и соедините колбу с холодильником.

3. Отогнать 50–70 мл.

Дистиллят будет содержать и индол, и фенол.

4. Сделайте дистиллят сильно щелочным с помощью едкого кали и перегоните повторно.

Дистиллят будет содержать индол; остаток будет содержать фенол.

5. Протестируйте дистиллят на индол (см. выше).

6. Насытьте остаток, когда он остынет, углекислым газом и перегоните повторно.

7. Протестируйте этот дистиллят на фенол (см. выше).

6. Образование пигмента. —

1. Приготовьте культуры в пробирках на различных средах и инкубируйте при различных условиях температуры (при 37° C и при 20° C), атмосферы (аэробной и анаэробной) и света (воздействие и защита от него).

Отметьте условия, наиболее благоприятные для образования пигмента.

2. Отметьте растворимость пигмента в различных растворителях, таких как вода (горячая и холодная), спирт, эфир, хлороформ, бензол, сероуглерод.

3. Отметьте влияние кислот и щелочей соответственно на пигментированную культуру или на растворы пигмента.

4. Отметьте спектроскопические реакции.

7. Образование восстанавливающего агента. —

(a) Разрушение цвета. —

1. Приготовьте культуры в пробирках на питательном бульоне, подкрашенном лакмусом, розоловой кислотой, нейтральным красным, и инкубируйте.

2. Исследуйте культуры каждый день и отметьте, происходит ли изменение цвета.

(b) Нитраты в нитриты. —

Medium Required:

Nitrate bouillon (vide page 185).

Or nitrate peptone solution (vide page 186).

Reagents Required:

Sulphuric acid (25 per cent.).

Metaphenylene diamine, 5 per cent. aqueous solution.

Метод. —

1. Приготовьте культуры в пробирках и инкубируйте вместе с контрольными пробирками (т. е. неинокулированными пробирками с той же средой, помещенными в идентичные условия окружающей среды).

Эта мера предосторожности необходима, так как среда склонна поглощать нитриты из атмосферы, и мнение об отсутствии нитритов в культуре часто основывается на равном окрашивании среды в контрольной пробирке.

Протестируйте как культуральную пробирку, так и контрольную пробирку на наличие нитритов.

2. Добавьте несколько капель серной кислоты к среде в каждой из пробирок.

3. Затем влейте 2 или 3 мл метафенилендиамина в каждую пробирку. Коричневато-красный цвет = нитриты.

Интенсивность цвета пропорциональна количеству присутствующего вещества.

8. Газообразование. —

(A) Углекислый газ и водород. —

Необходимая аппаратура:

Ферментационные трубки (см. стр. 161), содержащие сахарный бульон (глюкоза, лактоза и т. д.). Среда должна быть приготовлена из бульона, свободного от инозита (см. стр. 183).

Необходимый реактив:

n/2 каустическая сода.

Метод. —

1. Инокулируйте поверхность среды в расширенной части ферментационной трубки и инкубируйте.

2. Отмечайте уровень жидкости в закрытом колене ферментационной трубки с интервалами в двадцать четыре часа, и когда выделение газа прекратится, измерьте длину столбика газа с помощью миллиметровой шкалы.

Выразите этот столбик газа в процентах от всей длины закрытого колена.

3. Чтобы проанализировать газ и грубо определить относительные пропорции CO2 и H2, действуйте следующим образом:

Заполните расширенную часть ферментационной трубки раствором каустической соды.

Закройте отверстие расширенной части резиновой пробкой.

Попеременно переворачивайте трубку шесть или восемь раз, чтобы привести раствор соды в тесный контакт с газом.

Верните остаточный газ в конец закрытого колена и измерьте.

Потеря в объеме газа = углекислый газ.

Остаточный газ = водород.

Перенесите газ в расширенную часть трубки и взорвите его, поднеся зажженную лучину.

(B) Сероводород. —

Media Required:

Iron peptone solution (vide page 185).

Lead peptone solution.

1. Инокулируйте пробирки со средами и инкубируйте вместе с контрольными пробирками.

2. Исследуйте изо дня в день с интервалами в двадцать четыре часа.

Выделение H2S приведет к тому, что желтовато-белый осадок потемнеет до коричневато-черного или угольно-черного цвета, причем интенсивность цвета будет пропорциональна количеству присутствующего сероводорода.

Количественный метод: Для точного количественного анализа газов, производимых бактериями из определенных сред с заданным составом, необходимо использовать методы, разработанные Пейксом, следующим образом:

Fig. 153.—Gas-collecting apparatus.

Необходимая аппаратура:

Богемская колба (емкостью от 300 до 1500 мл), содержащая от 100 до 400 мл среды. Горлышко колбы снабжено перфорированной резиновой пробкой, несущей L-образную стеклянную трубку (короткое плечо проходит как раз через пробку). К длинному плечу трубки прикреплен кусок вакуумного шланга длиной около 8 см, заткнутый на свободном конце кусочком ваты. Точно измерьте общую емкость колбы и отводной трубки, а также количество содержащейся среды. Отметьте разницу.

Газоприемник. Это колокол из толстого стекла, высотой 14 см и диаметром 9 см. На его вершине вплавлена стеклянная трубка. Она поднимается вертикально на 5 см, а затем изогнута под прямым углом, горизонтальное плечо имеет длину 10 см. Трехходовой кран горизонтально вставлен в вертикальную трубку чуть выше места ее соединения с колоколом.

Железный цилиндр, достаточно большой, чтобы вместить колокол.

Около 15 кг металлической ртути.

Расплавленный парафин.

Аппарат Орсата-Лунге, работающий на ртути вместо воды, снабженный двумя газовыми трубками увеличенной длины (емкостью 120 и 60 мл соответственно и градуированными по всей длине, обе с водяной рубашкой) или другим аппаратом для анализа газов, способным работать с CO2, O2, H2 и N2.

Метод. —

1. Инокулируйте среду в колбе обычным способом с помощью платиновой иглы, следя за тем, чтобы горлышко колбы и резиновая пробка были тщательно обожжены до и после операции.

Fig. 154.—Orsat-Lunge gas analysis apparatus.

2. Заполните железный цилиндр ртутью.

3. Поместите колокол отверстием вниз в ртуть — сначала убедившись, что есть свободное сообщение между внутренней частью колокола и внешним воздухом — и втяните ртуть в кран; затем закройте кран.

4. Заткните открытый конец трехходового крана расплавленным воском.

5. Соедините горизонтальное плечо культуральной колбы с плечом газоприемника с помощью вакуумного шланга (после удаления ватной пробки из резиновой трубки), как показано на рис. 153.

6. Поверните трехходовой кран на пол-оборота, чтобы открыть сообщение между колбой и приемником, и загерметизируйте все соединения, покрыв их пленкой расплавленного воска. Когда кран будет повернут, ртуть в приемнике естественным образом опустится.

7. Поместите весь аппарат в термостат. (Спустя два часа, когда температура аппарата сравняется с температурой термостата, отметьте уровень ртути в приемнике.)

8. Ежедневно осматривайте аппарат и отмечайте уровень ртути в приемнике с интервалом в двадцать четыре часа.

9. Когда выделение газа прекратится, извлеките аппарат из термостата; удалите воск из сопла трехходового крана (предварительно установив кран так, чтобы исключить утечку газа) и соедините его с аппаратом Орса.

10. Извлеките, скажем, 100 куб. см газа из приемника, переключите кран и нагнетайте его в колбу с культурой. Извлеките 100 куб. см смеси газов из колбы с культурой и верните в приемник.

Повторите эти действия три или четыре раза, чтобы обеспечить тщательное перемешивание содержимого колбы и приемника.

11. Теперь отберите пробу смеси газов в аппарат Орса и проанализируйте.

При расчете результатов будьте внимательны и учитывайте объем воздуха, содержавшегося в колбе в начале эксперимента.

Для сбора газов, образующихся в анаэробных условиях, применяется несколько иная процедура:

1. Закрепите колбу с культурой (емкостью 500 куб. см) с помощью перфорированной резиновой пробки, через которую проходит L-образная манометрическая трубка, каждое плечо которой имеет длину 5 см.

2. Подготовьте вторую L-образную трубку с коротким плечом 5 см и длинным плечом 20 см и соедините ее короткое плечо с горизонтальным плечом трубки в колбе с культурой с помощью отрезка вакуумного шланга, снабженного винтовым зажимом.

3. Полностью заполните колбу с культурой кипящей средой и пропустите длинную трубку через пробку колбы Эрленмейера (емкостью 150 куб. см), содержащей 100 куб. см той же среды.

4. Стерилизуйте эти соединенные колбы дробным методом обычным способом.

Сразу после завершения последней стерилизации затяните зажим на соединительном шланге и дайте им остыть.

По мере остывания и сжатия жидкости в горлышке колбы под резиновой пробкой образуется вакуум.

5. Для инокуляции колбы с культурой извлеките длинное плечо изогнутой трубки из колбы Эрленмейера и опустите его до дна пробирки, содержащей молодую культуру (в жидкой среде, аналогичной той, что находится в колбе с культурой) исследуемого организма.

6. Слегка ослабьте зажим на шланге, чтобы позволить 4 или 5 куб. см культуры попасть в колбу.

7. Плотно зажмите резиновый шланг; извлеките изогнутую стеклянную трубку из пробирки с культурой и погрузите ее в колбу, содержащую свежепрокипяченную и быстро охлажденную дистиллированную воду.

8. Снова ослабьте зажим и промойте остатки культуры, пока колба с культурой и трубки полностью не заполнятся водой.

9. Плотно зажмите резиновый шланг и уберите длинную стеклянную трубку.

10. Подготовьте газовый приемник, как в предыдущем методе (в данном случае ртуть следует слегка подогреть), и заполните горизонтальное плечо приемника горячей водой.

11. Соедините колбу с культурой с горизонтальным плечом газового приемника.

12. Снимите винтовой зажим с резинового шланга, отрегулируйте трехходовой кран, загерметизируйте все соединения расплавленным воском и поместите в термостат.

13. Завершите исследование, как описано для предыдущего метода.

ФИЗИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ.

Исследуйте культуры организма в отношении его роста и развития по следующим пунктам:

Атмосфера:

(а) В присутствии кислорода.

(б) В отсутствие кислорода.

(в) В присутствии газов, отличных от кислорода.

Температура:

(а) Диапазон.

(б) Оптимум.

(в) Термическая точка гибели:

Moist: Vegetative forms.

Spores.

Dry: Vegetative forms.

Spores.

Реакция среды.

Устойчивость к летальным агентам:

(а) Высушивание.

(b) Light: Diffuse.

Direct.

Primary colours.

(в) Нагревание.

(г) Химические антисептики и дезинфицирующие средства.

Жизнеспособность в искусственных культурах.

I. Атмосфера. — Вопрос о том, является ли наблюдаемый организм (а) облигатным аэробом, (б) факультативным анаэробом или (в) облигатным анаэробом, приблизительно решается по виду культур в бродильных пробирках. Очевидный рост как в закрытом колене, так и в луковице, или как в перевернутой газовой трубке, так и в основной массе среды, указывает на то, что это факультативный анаэроб; в то время как рост, происходящий только в луковице или только в закрытом колене, показывает, что это облигатный аэроб или анаэроб соответственно. Однако этот метод недостаточно точен для текущих целей, и исследование организма в отношении его поведения в отсутствие кислорода проводится следующим образом:

Необходимое оборудование:

Buchner's tubes.

Bulloch's apparatus.

Exhaust pump.

Pyrogallic acid.

Dekanormal caustic soda.

Необходимые среды:

Glucose formate agar.

Glucose formate gelatine.

Glucose formate bouillon.

Метод. —

1. Подготовьте четыре серии культур:

(А) Скошенный глюкозо-формиатный агар, инкубировать аэробно при 37° C.

Скошенный глюкозо-формиатный желатин, инкубировать аэробно при 20° C.

(Б) Скошенный глюкозо-агар для инкубации анаэробно при 37° C.

Скошенный глюкозо-формиатный желатин для инкубации анаэробно при 20° C.

(В) Скошенный глюкозо-формиатный агар для инкубации анаэробно при 37° C.

Глюкозо-формиатный бульон для инкубации анаэробно при 37° C.

(Г) Скошенный глюкозо-формиатный желатин для инкубации анаэробно при 20° C.

Глюкозо-формиатный бульон для инкубации анаэробно при 20° C.

2. Запечатайте культуры, составляющие серию Б, в пробирках Бухнера (см. стр. 239).

3. Запечатайте культуры, составляющие серию В, в аппарате Буллока; откачайте воздух с помощью вакуумного насоса и обеспечьте поглощение остаточного кислорода путем введения раствора пирогалловой кислоты и едкого натра (см. стр. 245). Аналогичным образом обработайте серию Г.

4. Наблюдайте за культурами макроскопически и микроскопически с интервалом в двадцать четыре часа до завершения, при необходимости, семидневной инкубации.

5. Проконтролируйте эти результаты.

Газы, отличные от кислорода. —

Необходимое оборудование:

Bulloch's apparatus.

Sterile gas filter (vide page 40).

Gasometer containing the gas it is desired to test (SO2, N2O, NO,

CO2, etc.) or gas generator for its production.

Метод. —

1. Подготовьте не менее семи пробирочных культур на твердых средах и поместите их в аппарат Буллока.

2. Соедините входную трубку аппарата Буллока со стерильным газовым фильтром, а его, в свою очередь, с отводной трубкой газометра или газогенератора.

3. Откройте оба крана аппарата Буллока и пропускайте газ до тех пор, пока он полностью не вытеснит воздух из колокола, что подтверждается результатами анализа проб, отобранных из выходной трубки.

4. Инкубируйте при оптимальных температурных условиях.

5. Осматривайте культуры с интервалом в двадцать четыре часа до завершения семи суток.

6. Ежедневно извлекайте одну пробирку из аппарата. Если рост не виден, инкубируйте пробирку при оптимальных условиях температуры и атмосферы, и таким образом определите время воздействия газа, необходимое для гибели наблюдаемых организмов.

7. Проконтролируйте эти результаты.

II. Температура. —

(А) Диапазон. —

1. Подготовьте серию из десяти пробирочных культур в жидких средах с оптимальной реакцией.

2. Подготовьте ряд термостатов с фиксированными температурами, различающимися на 5° C и включающими температуры от 5° C до 50° C.

(При отсутствии достаточного количества термостатов используйте водяную баню, применяемую для определения термической точки гибели вегетативных форм.)

3. Инкубируйте по одной пробирочной культуре организма аэробно или анаэробно, по мере необходимости, в каждом термостате и осматривайте с получасовыми интервалами в течение от пяти до восемнадцати часов.

4. Отметьте температуру, при которой рост впервые наблюдается макроскопически (Оптимальная температура).

5. Продолжайте инкубацию до завершения семи суток. Отметьте пределы температур, при которых происходит рост (Температурный диапазон).

6. Проконтролируйте эти результаты — при необходимости организовав серию термостатов с шагом в один градус Цельсия на пять градусов за пределы каждого из ранее отмеченных экстремумов.

(Б) Оптимум. —

1. Подготовьте вторую серию из десяти пробирочных культур при аналогичных условиях реакции среды.

2. Инкубируйте в серии термостатов, в которых температура регулируется с интервалом в 1° C на пять градусов в обе стороны от оптимальной температуры, наблюдаемой в предыдущем эксперименте (А, шаг 4).

3. Снова наблюдайте с получасовыми интервалами и отметьте температуру, при которой рост впервые становится видимым невооруженным глазом = Оптимальная температура.

(В) Термическая точка гибели (т. т. г.) —

Влажная — Вегетативные формы:

Т. т. г. здесь — это температура, которая с уверенностью убивает водную суспензию исследуемых организмов после 10-минутного воздействия.

Fig. 155.—Hearson's water-bath.

Необходимое оборудование:

Водяная баня. Для наблюдения термической точки гибели необходима специальная водяная баня. Температура этого аппарата регулируется с помощью капсульного регулятора, который можно настроить с интервалом в полградуса Цельсия в диапазоне 30°, от 50° C до 80° C, с помощью пружины, приводимой в действие рукояткой a, которая увеличивает давление внутри капсулы. Предусмотрено отверстие для приема сопла воздушного насоса, чтобы через воду во время использования бани можно было продувать поток воздуха, обеспечивая тем самым равномерную температуру содержимого. Через второе отверстие подвешен сертифицированный термометр со шкалой Цельсия, резервуар которого, будучи полностью погруженным в воду, поднят не менее чем на 2 см над дном бани.

Стерильные стеклянные капсулы.

Колба, содержащая 250 куб. см стерильного физиологического раствора.

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths of a cubic
centimetre).

Специальная платиновая петля.

Test-tubes, 18 by 1.5 cm., of thin German glass.

Набор стерильных чашек Петри.

Пробирки с агаром или желатином.

Метод. —

1. Подготовьте пробирочные культуры на твердых средах с оптимальной реакцией; инкубируйте сорок восемь часов при оптимальных условиях температуры и атмосферы.

2. Исследуйте препараты из культуры микроскопически, чтобы убедиться в отсутствии спор.

3. Пипеткой внесите 5 куб. см солевого раствора в каждую из двенадцати капсул.

4. Суспендируйте три петли поверхностного роста (используя специальную платиновую петлю, см. стр. 316) в физиологическом растворе, равномерно эмульгируя о влажные стенки каждой капсулы.

5. Перенесите эмульсию из каждой капсулы в стерильную колбу на 250 куб. см и перемешайте.

6. Пипеткой внесите 5 куб. см эмульсии в каждую из двенадцати стерильных пробирок, пронумерованных по порядку.

7. Установите первую пробирку в водяную баню, отрегулированную на 40° C, с помощью двух резиновых колец вокруг пробирки, одно над, другое под перфорированной крышкой бани, так, чтобы верхний уровень жидкости в пробирке был примерно на 4 см ниже поверхности воды в бане, а дно пробирки находилось на таком же расстоянии от дна бани.

8. Подготовьте контрольную пробирку, содержащую 5 куб. см стерильного физиологического раствора, в аналогичных условиях. Закройте пробирку ватной пробкой и пропустите через нее термометр так, чтобы его резервуар был погружен в воду.

9. Закройте свободные отверстия в крышке водяной бани стеклянными шариками.

10. Следите за термометром в пробирке, пока он не покажет температуру 40° C. Отметьте время. Десять минут спустя извлеките пробирку с суспензией и быстро охладите, погрузив ее нижний конец в струю проточной воды.

11. Залейте три желатиновые (или агаровые) чашки, содержащие соответственно 0,2, 0,3 и 0,5 куб. см суспензии, и инкубируйте.

12. Пипеткой внесите оставшиеся 4 куб. см суспензии в колбу с культурой, содержащую 250 куб. см питательного бульона, и инкубируйте.

13. Наблюдайте за этими культурами изо дня в день. «Отсутствие роста» не должно регистрироваться как окончательный результат до завершения семидневной инкубации.

14. Распространите эти наблюдения на оставшиеся пробирки серии, но варьируя условия так, чтобы каждая пробирка подвергалась воздействию температуры на 2° C выше, чем предыдущая — т. е. 42° C, 44° C, 46° C и так далее.

15. Отметьте температуру, после воздействия которой не наблюдается роста до конца семидневной инкубации, = термическая точка гибели.

16. Если требуется большая точность, можно подготовить вторую серию пробирок и подвергнуть их воздействию фиксированных температур в течение десяти минут с интервалом всего 0,5° C в диапазоне 5° C в обе стороны от ранее наблюдаемой точки гибели.

Влажная — Споры: Термическая точка гибели в случае спор — это время воздействия фиксированной температуры 100° C, необходимое для гибели всех спор, присутствующих в суспензии.

Примечание. — Если желательно сохранить постоянную времени 10 минут и исследовать температуру, необходимую для уничтожения спор, в воду в бане необходимо добавлять различное количество хлорида кальция, при этом точка кипения будет повышаться выше 100° C в зависимости от процентного содержания кальция в растворе. В таком случае используйте баню, изображенную на стр. 227; баню, изображенную на стр. 299, можно использовать только после снятия капсулы.

Она определяется следующим образом

Необходимое оборудование:

Паровой котел, оснащенный отводной трубкой и предохранительным клапаном большого диаметра.

Водяная баня при 100° C.

Колба Эрленмейера емкостью 500 куб. см, содержащая 140 куб. см стерильного физиологического раствора и оснащенная резиновой пробкой с четырьмя отверстиями.

Резиновая пробка оснащена следующим образом:

(а) Термометр до 120° C, его резервуар погружен в физиологический раствор.

(б) Прямая входная трубка, достигающая дна колбы, верхний конец закрыт ватной пробкой.

(в) Изогнутая сифонная трубка с соплом пипетки, прикрепленным с помощью резинового шланга и оснащенным зажимом.

Сопло защищено от случайного загрязнения путем пропускания его через ватную пробку небольшой пробирки.

(г) Серповидный отрезок стеклянной трубки, проходящий только через пробку, закрытый ватой, для отвода пара.

Стерильные чашки.

Стерильные пипетки.

Стерильные пробирки, градуированные на 5 куб. см.

Необходимые среды:

Желатин или агар.

Колбы с культурой, содержащие 200 куб. см питательного бульона.

Fig. 156.—Apparatus arranged for the determination of
the death-point of spores.

Метод. —

1. Подготовьте двенадцать пробирочных культур на поверхности (или две культуры в больших плоских флаконах для культур — см. стр. 5) питательного агара и инкубируйте при оптимальных условиях (определенных ранее) для образования спор.

Исследуйте препараты из культур микроскопически, чтобы определить наличие спор.

2. Пипеткой внесите 5 куб. см стерильного физиологического раствора в каждую пробирку с культурой или 30 куб. см в каждый флакон и с помощью стерильного платинового шпателя эмульгируйте весь поверхностный рост с раствором.

3. Добавьте 60 куб. см эмульсии к 140 куб. см физиологического раствора, содержащегося в подготовленной колбе Эрленмейера.

4. Поместите колбу в водяную баню с кипящей водой.

5. Соедините прямую трубку, предварительно удалив ватную пробку, с отводной трубкой парового котла; удалите пробку из вентиляционной трубки.

6. Когда термометр достигнет 100° C, откройте пружинный зажим на сифоне, слейте первый кубический сантиметр суспензии, который вытекает через сифон (т. е. содержимое сифонной трубки); соберите следующие 5 куб. см суспензии в стерильную градуированную пробирку, залейте чашки и подготовьте из них колбовые культуры, как в предыдущих экспериментах.

7. Повторяйте этот процесс с интервалами в двадцать пять минут пропаривания.

8. Наблюдайте за инокулированными чашками и колбами до завершения, при необходимости, семидневной инкубации.

9. Проконтролируйте эти эксперименты, но в данном случае отбирайте порции суспензии через сифон с интервалами от половины до одной минуты в течение пяти или десяти минут, предшествующих ранее определенной точке гибели.

Термическая точка гибели. —

Сухая — Вегетативные формы: Термическая точка гибели в этом случае — это температура, которая с уверенностью убивает тонкую пленку исследуемого организма после 10-минутного воздействия.

Необходимое оборудование:

Сухожаровой шкаф, снабженный терморегулятором.

Стерильные покровные стекла.

Колба, содержащая 250 куб. см стерильного физиологического раствора.

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths of a cubic
centimetre).

Набор стерильных капсул.

Тигельные щипцы.

Метод. —

1. Подготовьте эмульсию из трех петель оптимальной культуры в 5 куб. см физиологического раствора в стерильной капсуле и исследуйте микроскопически, чтобы убедиться в отсутствии споровых форм.

2. Сделайте двенадцать мазков на стерильных покровных стеклах; поместите каждое в стерильную капсулу для высушивания.

3. Подвергайте каждую капсулу по очереди воздействию в сухожаровом шкафу в течение десяти минут при различной фиксированной температуре, варьирующейся на 5° C в диапазоне от 60° C до 120° C.

4. Извлекайте каждую капсулу из шкафа тигельными щипцами сразу после завершения десяти минут; извлеките покровное стекло изнутри стерильным пинцетом.

5. Поместите мазок в колбу, содержащую 200 куб. см питательного бульона.

6. Подготовьте пересевы из тех колб, которые показывают признаки роста, чтобы убедиться, что случайного загрязнения не произошло, а рост вызван именно тем организмом, который был изначально нанесен на мазок.

7. Проконтролируйте результат этих экспериментов.

Сухая — Споры: Термическая точка гибели в этом случае — это температура, которая с уверенностью убивает споры исследуемого организма, присутствующие в тонкой пленке, после 10-минутного воздействия.

Необходимое оборудование:

Как для вегетативных форм.

Метод. —

1. Подготовьте культуру на скошенном агаре и инкубируйте при оптимальных условиях для образования спор.

2. Пипеткой внесите 5 куб. см стерильного физиологического раствора в пробирку с культурой и эмульгируйте в нем весь поверхностный рост. Исследуйте микроскопически, чтобы определить наличие спор в большом количестве.

3. Распределите тонкие ровные мазки на двенадцати стерильных покровных стеклах и поместите каждое покровное стекло в отдельную стерильную капсулу.

4. Подвергайте каждую капсулу по очереди в течение десяти минут воздействию различной фиксированной температуры, варьирующейся на 5° C, в диапазоне от 100° C до 160° C.

5. Завершите исследование, как для вегетативных форм.

III. Реакция среды.

(А) Диапазон. —

1. Подготовьте бульонную культуру организма и инкубируйте при оптимальных условиях температуры и атмосферы в течение двадцати четырех часов.

2. Пипеткой внесите 0,1 куб. см культуры в стерильную капсулу; добавьте 9,9 куб. см стерильного бульона и тщательно перемешайте.

3. Подготовьте серию пробирок с питательным бульоном различной реакции, от +25 до -30 (см. стр. 155), а именно: +25, +20, +15, +10, +5, нейтральная, -5, -10, -15, -20, -25, -30.

4. Инокулируйте каждую из бульонных пробирок 0,1 куб. см разведенной культуры с помощью стерильной градуированной пипетки и инкубируйте при оптимальных условиях.

5. Осматривайте культуры с получасовыми интервалами с третьего по двенадцатый час. Отметьте реакцию пробирки или пробирок, в которых рост впервые виден макроскопически (вероятно, оптимальная реакция).

6. Продолжайте инкубацию до завершения, при необходимости, семи суток. Отметьте пределы кислотности и щелочности, при которых развился макроскопический рост (Диапазон реакции).

7. Проконтролируйте результат этих наблюдений.

(Б) Оптимальная реакция. — Оптимальная реакция уже была приблизительно определена при наблюдении диапазона. Ее можно зафиксировать в более узких пределах, инокулируя аналогичным образом серию пробирок с бульоном, которые представляют меньшие вариации реакции, чем использованные ранее (скажем, 1 вместо 5), для пяти точек по обе стороны от ранее наблюдаемого оптимума. Например, оптимальная реакция, наблюдаемая в серии экспериментов по определению диапазона, была +10. Теперь засейте пробирки с реакциями +15, +14, +13, +12, +11, +10, +9, +8, +7, +6, +5 и наблюдайте, как и прежде.

IV. Устойчивость к летальным агентам. —

(А) Высушивание. —

Необходимое оборудование:

Эксикатор Мюллера. Он состоит из стеклянного колокола, оснащенного вытяжной трубкой и краном (d), который можно закрепить на зеркальном стеклянном основании (c) с помощью воска или смазки. Он содержит цилиндрический сосуд из пористой глины (a), в верхнюю часть которого наливается чистая серная кислота, в то время как материал для высушивания помещается внутри его стенок на стеклянную полку (b). Воздух откачивается изнутри, и кислота быстро превращает глиняный сосуд в большую поглощающую поверхность (Рис. 157).

Вакуумный насос.

Чистая концентрированная серная кислота.

Стерильные покровные стекла.

Стерильный пинцет.

Колба с культурой, содержащая 200 куб. см питательного бульона.

Стерильная вентилируемая чашка Петри. Она готовится путем сгибания трех коротких отрезков алюминиевой проволоки в V-образную форму, подвешивания их на край нижней чашки и установки крышки на них (Рис. 158).

Метод. —

1. Подготовьте поверхностную культуру на питательном агаре во флаконе для культур и инкубируйте при оптимальных условиях в течение сорока восьми часов.

2. Исследуйте препараты из культуры микроскопически, чтобы убедиться в отсутствии спор.

3. Пипеткой внесите 5 куб. см стерильного физиологического раствора в колбу и суспендируйте в нем весь рост.

4. Распределите суспензию тонкими ровными мазками на стерильных покровных стеклах и поместите внутрь стерильных «чашек» для высушивания.

5. Как только они высохнут, перенесите мазки на покровных стеклах в вентилируемую чашку Петри с помощью стерильного пинцета.

Fig. 157.—Mueller's desiccator.

6. Поместите чашку Петри внутрь эксикатора Мюллера; заполните верхнюю камеру чистой серной кислотой, накройте стеклянным колоколом и откачайте воздух изнутри. Десять минут спустя соедините эксикатор с промывной склянкой с серной кислотой, установив воздушный фильтр, чтобы внутрь поступал только сухой стерильный воздух.

Fig. 158.—Petri dish for drying cultivations.

7. С интервалом в пять часов открывайте аппарат, извлекайте один из мазков на покровном стекле из чашки Петри и переносите его внутрь колбы с культурой, соблюдая все меры предосторожности против загрязнения. Снова загерметизируйте эксикатор и снова откачайте воздух, а затем впустите сухой стерильный воздух, как и прежде.

8. Инкубируйте колбу с культурой при оптимальных условиях до завершения семи суток, при необходимости; и определите время воздействия, при котором наступает гибель.

9. Залейте чашки из тех колб с культурой, в которых наблюдается рост, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения.

10. Повторите эти наблюдения с часовыми интервалами в течение пяти часов до и после времени гибели, определенного в первой серии экспериментов.

(Б) Свет. —

(а) Рассеянный дневной свет:

1. Подготовьте пробирочную культуру в питательном бульоне и инкубируйте при оптимальных условиях в течение сорока восьми часов.

Fig. 159.—Plate with star for testing effect of light.

2. Залейте двадцать чашечных культур, десять на питательном желатине и десять на питательном агаре, каждая из которых содержит 0,1 куб. см бульонной культуры.

3. Поместите одну агаровую чашку и одну желатиновую чашку в горячий и холодный термостаты соответственно в качестве контроля.

4. Прикрепите кусочек черной бумаги, вырезанный в форме креста или звезды, в центре крышки каждой из оставшихся чашек (Рис. 159).

5. Подвергните эти чашки воздействию рассеянного дневного света (не прямых солнечных лучей) в лаборатории в течение одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, восьми, десяти, двенадцати часов.

6. После воздействия света инкубируйте при оптимальных условиях.

7. Осмотрите чашечные культуры после двадцати четырех и сорока восьми часов инкубации и сравните с двумя контрольными образцами. Запишите результаты. Если рост отсутствует на той части чашки, которая не была защищена черной бумагой, продолжайте инкубацию и ежедневное наблюдение до конца семи суток.

8. Проконтролируйте результаты.

(б) Прямой солнечный свет:

1. Подготовьте чашечные культуры точно так же, как в предыдущих экспериментах, и поместите два контрольных образца в термостаты.

2. Расположите оставшиеся чашки на платформе под прямыми лучами солнца.

3. Сверху на каждую чашку поставьте небольшую стеклянную посуду диаметром 14 см и глубиной 5 см.

4. Налейте раствор алюмокалиевых квасцов (2% в дистиллированной воде) в каждую посуду до глубины 2 см, чтобы поглотить тепло солнечных лучей и тем самым исключить возможное влияние температуры на культуры.

5. После воздействия в течение периодов, аналогичных тем, что использовались в предыдущем эксперименте, инкубируйте и завершите наблюдение, как указано выше.

(в) Основные цвета: Каждый цвет — фиолетовый, синий, зеленый и красный — должен быть протестирован отдельно.

1. Подготовьте чашечные культуры, как в предыдущих «световых» экспериментах, и инкубируйте контрольные образцы.

2. Fasten a strip of black paper, 3 cm. wide, across one diameter of the
cover of each plate.

3. Покройте остальную часть поверхности крышки пленкой из чистого фотографического коллодия, содержащего 2% любого из следующих анилиновых красителей, по мере необходимости:

Chrysoidin (for red).

Malachite green (for green).

Eosin, bluish (for blue).

Methyl violet (for violet).

4. Подвергните чашки, подготовленные таким образом, воздействию яркого дневного света (но не прямых солнечных лучей) в течение различных периодов времени и завершите наблюдения, как в предыдущих экспериментах. Бактерицидное действие света, по-видимому, зависит от более преломляемых лучей фиолетового конца спектра и отмечается независимо от того, пропускаются ли красно-желтые лучи.

5. Проконтролируйте результаты.

Примечание. — Ультрафиолетовые лучи, полученные от кварцевой ртутной лампы, с большой скоростью уничтожают бактериальную жизнь в лабораторных условиях.

(в) Нагревание. — (См. Термическая точка гибели, стр. 298.)

(г) Антисептики и дезинфицирующие средства. — Устойчивость, проявляемая любой данной бактерией по отношению к любому указанному дезинфицирующему средству или гермициду, должна исследоваться со ссылкой на следующие пункты:

(А) Коэффициент ингибирования — т. е. тот процент дезинфицирующего средства, присутствующий в питательной среде, который достаточен для предотвращения роста и размножения бактерии.

(Б) Нижний летальный коэффициент — т. е. время воздействия, необходимое для уничтожения вегетативных форм бактерии, суспендированных в воде при 20°–25° C, в которой дезинфицирующее средство присутствует в средней концентрации (концентрация недостаточна для вызова плазмолиза). И если бактерия является спорообразующей,

(В) Верхний летальный коэффициент — т. е. время воздействия, необходимое для уничтожения спор бактерии в условиях, аналогичных тем, что указаны в Б.

Пример, подробно описанный здесь, относится только к некоторым дезинфицирующим средствам:

viz:—Bichloride of mercury;

Formaldehyde;

Carbolic acid;

исследованным в отношении B. anthracis, но техника практически одинакова для всех других химических дезинфицирующих средств.

Коэффициент ингибирования. —

Необходимое оборудование:

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths).

Case of sterile pipettes, 1 c.c. (in tenths).

Стерильные пробирки или капсулы для разведений.

Пробирки с питательным бульоном, каждая из которых содержит отмеренные 10 куб. см среды.

Двадцатичетырехчасовая агаровая культура недавно выделенной B. Anthracis.

Гермициды:

1. Пятипроцентный водный раствор карболовой кислоты.

2. Однопроцентный водный раствор сулемы (перхлорида ртути).

3. Однодесятипроцентный водный раствор формальдегида.

Метод. —

1. Пронумеруйте шесть бульонных пробирок по порядку от 1 до 6. Инокулируйте каждую из исходной культуры B. anthracis и сразу добавьте различное количество [10] раствора карболовой кислоты, а именно:

To tube 1 add 2.0 c.c. (= 1:100)

To tube 2 add 1.0 c.c. (= 1:200)

To tube 3 add 0.6 c.c. (= 1:300)

To tube 4 add 0.5 c.c. (= 1:400)

To tube 5 add 0.4 c.c. (= 1:500)

To tube 6 add 0.2 c.c. (= 1:1,000)

2. Подготовьте аналогичную серию пробирочных культур, пронумерованных по порядку от 7 до 12, и добавьте различное количество раствора сулемы, а именно:

To tube 7 add 0.1 (= 1:1,000)

To tube 8 add 0.05 (= 1:2,000)

To tube 9 add 0.03 (= 1:3,000)

To tube 10 add 0.025 (= 1:4,000)

To tube 11 add 0.02 (= 1:5,000)

To tube 12 add 0.01 (= 1:10,000)

3. Подготовьте аналогичную серию пробирочных культур, пронумерованных по порядку от 13 до 18, и добавьте различное количество раствора формальдегида, а именно:

To tube No. 13 add 1.0 c.c. (= 1:1,000)

To tube No. 14 add 0.4 c.c. (= 1:2,500)

To tube No. 15 add 0.2 c.c. (= 1:5,000)

To tube No. 16 add 0.1 c.c. (= 1:10,000)

To tube No. 17 add 0.075 c.c. (= 1:15,000)

To tube No. 18 add 0.05 c.c. (= 1:20,000)

4. Инкубируйте все три серии культур при оптимальных условиях температуры и атмосферы.

5. Осматривайте каждую из пробирок с культурой изо дня в день до завершения семи суток и отметьте те пробирки, если таковые имеются, в которых происходит рост.

6. Из тех пробирок, в которых наблюдается рост, подготовьте пересевы на подходящие среды и убедитесь, что организм, вызывающий рост, является тем самым, который изначально использовался в тесте, а не случайным загрязнением.

Нижний летальный коэффициент. —

Необходимое оборудование:

Высококонцентрированные растворы дезинфицирующих средств.

Стерильные пробирки для приготовления разведений из концентрированных растворов дезинфицирующих средств.

Предметные стекла для висячей капли.

Покровные стекла.

Колба Эрленмейера, содержащая 100 куб. см стерильной дистиллированной воды.

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths of a cubic
centimetre).

Case of sterile pipettes, 1 c.c. (in tenths of a cubic
centimetre).

Метод. —

1. Подготовьте поверхностную культуру «тестового» организма B. anthracis на питательном агаре во флаконе для культур и инкубируйте при оптимальных условиях в течение двадцати четырех часов; затем исследуйте культуру микроскопически, чтобы убедиться в отсутствии спор.

2. Подготовьте растворы различных процентных концентраций каждого дезинфицирующего средства.

3. Сделайте серию препаратов «висячая капля» из агаровой культуры, используя петлю раствора дезинфицирующего средства различных процентных концентраций для приготовления эмульсии на каждом покровном стекле.

4. Исследуйте микроскопически и отметьте самый сильный раствор, который не вызывает плазмолиза, и самый слабый раствор, который вызывает плазмолиз организма.

5. Сделайте контрольные препараты этих двух растворов и определите процентную концентрацию для тестирования.

6. Пипеткой внесите 10 куб. см стерильной воды во флакон для культур и суспендируйте в нем весь поверхностный рост.

7. Перенесите суспензию в колбу Эрленмейера и смешайте ее с 90 куб. см стерильной воды, оставшейся в колбе.

8. Пипеткой внесите 10 куб. см разведенной суспензии в каждую из десяти стерильных пробирок.

9. Промаркируйте одну из пробирок «Контроль» и поместите ее в термостат при 18° C.

10. Добавьте в каждую из оставшихся пробирок достаточное количество [11] концентрированного раствора дезинфицирующего средства для получения ранее определенной процентной концентрации (см. шаг 5).

11. Инкубируйте пробирки при 18°–20° C.

12. С часовыми интервалами извлекайте контрольную пробирку и одну из пробирок с добавленным дезинфицирующим средством из термостата.

13. Сделайте пересев как из контрольной, так и из тестовой суспензии на поверхность питательного агара; инкубируйте при оптимальных условиях.

14. Осматривайте эти пробирки с культурой изо дня в день до завершения семи суток и определите кратчайшее время воздействия, необходимое для гибели вегетативных форм.

Верхний летальный коэффициент. —

1. Подготовьте поверхностные культуры «тестовых» организмов на питательном агаре во флаконе для культур и инкубируйте при оптимальных условиях в течение трех дней для образования их спор.

2. Перенесите эмульсию в стерильную пробирку и нагревайте в дифференциальном стерилизаторе в течение десяти минут при 80° C для уничтожения всех вегетативных форм.

3. Используя тот процентный раствор дезинфицирующего средства, который был определен в предыдущем эксперименте, завершите исследования, как подробно описано в нем, шаги 7–14, увеличивая интервал между посевами до двух, трех или пяти часов, если это считается целесообразным.

Примечание. — Там, где необходимо оставить организмы в контакте с сильным раствором дезинфицирующего средства на длительные периоды, необходимо принять меры для удаления каждого следа дезинфицирующего средства с бактерий перед переносом их на свежие питательные среды; в противном случае, хотя они и не будут фактически убиты, присутствие дезинфицирующего средства может предотвратить их развитие и тем самым привести к ошибочному выводу. Следовательно, во всех гермицидных экспериментах важно прежде всего определить коэффициент ингибирования используемого гермицида. В обстоятельствах, упомянутых выше, обычно достаточно подготовить пересевы в таком объеме жидкой питательной среды, которого было бы достаточно для снижения концентрации гермицида примерно до одной сотой процента ингибирования, предполагая, что весь объем инокулята состоял из той концентрации гермицида, которая использовалась в тесте. В некоторых случаях просто нейтрализовать гермицид и сделать его инертным путем промывания организмов в каком-либо негермицидном растворе (например, в сульфиде аммония при использовании солей ртути в качестве гермицида). Однако, когда желательно удалить последние следы гермицида, действуйте следующим образом:

1. Перенесите суспензию бактерий в стерильные центрифужные пробирки; добавьте необходимое количество дезинфицирующего средства и оставьте его в контакте с бактериями на необходимый период.

2. Тщательно центрифугируйте, слейте пипеткой надосадочную жидкость; заполните пробирку стерильной водой и равномерно распределите осадок по всей жидкости.

3. Снова центрифугируйте, слейте пипеткой надосадочную жидкость; заполните пробирку стерильной водой; равномерно распределите осадок по всей жидкости и перенесите суспензию в литровую колбу.

4. Доведите до литра добавлением стерильной воды; профильтруйте суспензию через стерильную фарфоровую свечу.

5. Эмульгируйте бактериальный остаток с 5 куб. см стерильного бульона.

6. Подготовьте необходимые пересевы из этой эмульсии.

ПАТОГЕНЕЗ.

Живые бактерии. —

(а) Психрофильные бактерии: Когда организм растет только при 18°–20° C или ниже,

1. Подготовьте культуры в питательном бульоне и инкубируйте при оптимальных условиях.

2. После семидневной инкубации введите то количество культуры, которое соответствует 1% от массы тела здоровой лягушки, в спинной лимфатический мешок рептилии.

3. Наблюдайте до наступления смерти или, в случае отрицательного результата, до завершения двадцати восьми суток (см. Глава XVIII).

4. Если и когда наступит смерть, проведите тщательное вскрытие (см. Глава XIX).

(б) Мезофильные бактерии: Когда организм растет при 35°–37° C,

1. Приготовьте культуры в питательном бульоне и инкубируйте при оптимальных условиях в течение сорока восьми часов.

2. Выберите двух белых мышей, по возможности одного возраста, размера и веса.

3. Инокулируйте первую мышь подкожно в корень хвоста количеством культуры, эквивалентным 1 проценту от массы ее тела.

4. Инокулируйте вторую мышь внутрибрюшинно аналогичной дозой.

5. Наблюдайте тщательно до наступления смерти или до истечения двадцати восьми дней.

6. Если инокулированные животные погибают, проведите полное патологоанатомическое вскрытие.

Если смерть наступает вскоре после инъекции бактериальных культур, эксперименты по инокуляции следует повторить два или три раза. Затем, если исследуемый микроорганизм неизменно проявляет патогенные эффекты, следует принять меры для установления, по возможности, минимальной летальной дозы (см. ниже) роста на твердых средах для лягушки или белой мыши соответственно. Других подопытных животных — например, белую крысу, морскую свинку и кролика — следует затем протестировать аналогичным образом.

7. Если инокулированные мыши остаются здоровыми, проверьте действие данного микроорганизма на белых крысах, морских свинках, кроликах и т. д.

Минимальная летальная доза (м. л. д.); если целью инокуляции является определение минимальной летальной дозы, необходимо следовать несколько иной процедуре. Для этого и других точных экспериментов изготавливается специальная платиновая петля размером около 2,5 мм на 0,75 мм с параллельными сторонами, откалиброванная путем тщательного взвешивания для определения приблизительного количества влажного бактериального роста, которое удерживает петля при заполнении.

1. Культура должна быть приготовлена на твердой среде с оптимальной реакцией, инкубирована при оптимальной температуре и введена в период наибольшей активности и жизнеспособности конкретного микроорганизма, который требуется протестировать.

2. Расставьте четыре стерильные капсулы в ряд и промаркируйте их I, II, III и IV. В первую внесите 10 куб. см стерильного бульона с помощью стерильной градуированной пипетки; а в каждую из оставшихся трех — по 9,9 куб. см.

3. Возьмите одну петлю бактериального роста с поверхности среды в пробирке с культурой, соблюдая обычные меры предосторожности против загрязнения, и равномерно эмульгируйте ее с бульоном в первой капсуле. Каждый кубический сантиметр эмульсии теперь будет содержать одну десятую часть микроорганизмов, содержавшихся в исходной петле (кратко записывается как 0,1 петли).

4. Возьмите 0,1 куб. см эмульсии из первой капсулы с помощью стерильной градуированной пипетки, перенесите ее во вторую капсулу и тщательно перемешайте. Опустите использованную пипетку в банку с раствором лизола. Это доводит объем жидкости во второй капсуле до 10 куб. см, и, следовательно, каждый кубический сантиметр бульона в капсуле II содержит 0,001 петли.

5. Аналогичным образом 0,1 куб. см смеси переносится из капсулы II в капсулу III (1 куб. см бульона в капсуле III содержит 0,00001 петли), а затем из капсулы III в капсулу IV (1 куб. см бульона в капсуле IV содержит 0,0000001 петли).

Приготовленные таким образом разведения можно свести в таблицу;

Capsule I = 1 loopful + 10 c.c. water ∴ 1 c.c.=0.1 loop.

Capsule II = 0.1 c.c. capsule I + 9.9 c.c. water ∴ 1 c.c.=0.001 loop.

Capsule III = 0.1 c.c. capsule II + 9.9 c.c. water ∴ 1 c.c.=0.00001 loop.

Capsule IV = 0.1 c.c. capsule III + 9.9 c.c. water ∴ 1 c.c. = 0.0000001 loop.

6. С помощью стерильных градуированных пипеток возьмите необходимое количество бульона, соответствующее различным десятичным долям петли, из соответствующих капсул, перенесите каждую «дозу» в отдельную стерильную капсулу и промаркируйте; а в те дозы, которые имеют малый объем, добавьте необходимое количество стерильного бульона, чтобы довести его до 1 куб. см.

7. Кратные петли готовятся путем эмульгирования 1, 2, 5 или 10 петель, каждая с 1 куб. см стерильного бульона в отдельных стерильных капсулах.

8. Инокулируйте серию животных этими измеренными дозами, наполняя шприц сначала из той капсулы, которая содержит наименьшую дозу, затем из капсулы, содержащей следующую по величине дозу, и так далее. При соблюдении осторожности не возникнет необходимости стерилизовать шприц во время серии инокуляций.

9. Засейте пробирки с желатином или агаром, разжиженным нагреванием, из каждого из более высоких разведений, скажем, от 0,0000001 петли до 0,01 петли; залейте чашки и инкубируйте. Когда рост станет видимым, подсчитайте количество присутствующих микроорганизмов, вычислите среднее значение и определите количество бактерий, присутствующих в одной петле инокулята.

10. Наименьшая доза, вызывающая инфекцию и смерть инокулированного животного, отмечается как минимальная летальная доза.

Токсины. —

Приготовьте колбовые культуры исследуемого микроорганизма в глюкозо-формиатном бульоне и инкубируйте в течение четырнадцати дней при оптимальных условиях.

(а) Внутриклеточные или нерастворимые токсины:

1. Нагрейте жидкую культуру на водяной бане при 60° C в течение тридцати минут. (Полученная стерильная мутная жидкость часто называется «убитой» культурой.)

2. Инокулируйте пробирку со стерильным бульоном таким же количеством и инкубируйте при оптимальных условиях. Этот «контроль» затем служит для демонстрации отсутствия в токсине живых бактерий.

Fig. 160.—Apparatus arrange for toxin filtration.

3. Введите внутривенно количество культуры, соответствующее 1 проценту от массы тела выбранного животного, обычно одного из мелких грызунов.

4. Наблюдайте в течение жизни или до завершения двадцати восьми дней, и в случае смерти, наступившей в этот период, проведите полное патологоанатомическое вскрытие.

5. Повторите эксперимент по крайней мере один раз. В случае положительного результата оцените минимальную летальную дозу «убитой» культуры для каждого из видов подопытных животных.

(б) Внеклеточные или растворимые токсины:

1. Отфильтруйте культуру через фарфоровую фильтровальную свечу (Беркефельд) в стерильную фильтровальную колбу, расположив аппарат, как показано на прилагаемом рисунке (Рис. 160).

2. Инокулируйте мышей, крыс, морских свинок и кроликов подкожно таким количеством токсина, которое соответствует 1 проценту от массы тела каждого из них соответственно, и наблюдайте, при необходимости, до истечения одного месяца.

3. Инокулируйте «контрольную» пробирку с бульоном таким же количеством и инкубируйте, чтобы определить отсутствие в отфильтрованном токсине живых бактерий.

4. В случае летального исхода проведите полное и тщательное патологоанатомическое вскрытие.

5. Повторите эксперименты и, если результаты положительные, установите минимальную летальную дозу токсина для каждого из восприимчивых животных.

Оценка м. л. д. токсина проводится по принципам, аналогичным тем, что установлены для живых бактерий (см. стр. 316), просто заменяя 1 куб. см токсина в качестве единицы измерения вместо единицы «петля» живой культуры.

Часто случается, что в ходе случайных исследований имеется бульонная пробирочная культура для теста на токсин, в то время как колбовой культуры нет. В таких случаях неоценима маленькая фильтровальная свеча и трубка Мартена (Рис. 161), специально разработанная для фильтрации небольших количеств жидкости. Она состоит из узкой фильтровальной колбы, достаточно большой, чтобы вместить обычную пробирку размером 18 × 2 см. Горлышко трубчатой свечи Шамберлана размером 15 × 1,5 см закрыто перфорированной резиновой пробкой, в которую вставляется конец ножки воронки с чертополоховой головкой, в то время как непосредственно под основанием воронки расположена резиновая пробка для закрытия горлышка фильтровальной колбы. Когда аппарат зафиксирован в нужном положении и подключен к вытяжному насосу, культура наливается в головку воронки, и благодаря относительно большой фильтрующей поверхности свободный от микробов фильтрат быстро втягивается в приемную пробирку.

Повышение вирулентности микроорганизма. — Если желательно повысить или «экзальтировать» вирулентность слабопатогенного микроорганизма, необходимы специальные методы инокуляции, тщательно адаптированные к требованиям каждого отдельного случая. Среди наиболее важных — следующие:

1. Пассаж вируса. — Инокуляция чистых культур микроорганизма высоковосприимчивым животным и пассирование его как можно быстрее от животного к животному, всегда выбирая тот метод инокуляции — например, внутрибрюшинный, — который создает для микроорганизма наиболее благоприятные условия для роста и размножения.

Fig. 161—Martin's filtering apparatus for small
quantities of fluid.

2. Вирус плюс вирулентные микроорганизмы. — Инокуляция чистых культур микроорганизма вместе с чистыми культурами какого-либо другого микроба, который сам по себе достаточно вирулентен, чтобы обеспечить смерть подопытного животного, либо в то же самое место, либо в другую часть тела. Благодаря такой ассоциации микроорганизм с низкой вирулентностью часто приобретает более высокую степень вирулентности, которая может быть еще больше повышена с помощью «пассажей» (см. выше).

3. Вирус плюс токсины. — Инокуляция чистых культур микроорганизма в какое-либо выбранное место вместе с подкожной, внутрибрюшинной или внутривенной инъекцией токсина — например, одного из тех, что вырабатываются группой Proteus — одновременно с инъекцией слабого вируса, до нее или сразу после нее. Таким образом естественная резистентность животного снижается, и инокулированный микроорганизм получает возможность размножаться и производить свой патогенный эффект, а его вирулентность впоследствии повышается с помощью «пассажей».

Аттенуация вирулентности микроорганизма. — Аттенуация или снижение вирулентности патогенного микроба обычно достигается с гораздо меньшими трудностями, чем экзальтация его вирулентности, и, как правило, осуществляется путем изменения среды обитания культур, как, например:

1. Культивирование в таких средах, которые непригодны по причине их (а) состава или (б) реакции.

2. Культивирование в подходящих средах, но при неподходящей температуре.

3. Культивирование в подходящих средах, но в неподходящей атмосфере.

4. Культивирование в подходящих средах, но в неблагоприятных условиях в отношении света, движения и т. д.

Аттенуация вируса также может быть достигнута путем

5. Пассажа через естественно резистентных животных.

6. Воздействия высушивания.

7. Воздействия газообразных дезинфицирующих средств.

8. Комбинации двух или более вышеуказанных методов.

ИММУНИЗАЦИЯ.

Дальнейшее изучение патогенетических свойств любой конкретной бактерии включает активную иммунизацию одного или нескольких ранее нормальных животных. Эта цель может быть достигнута различными средствами; но следует помнить, что иммунизация не проводится по какому-либо жесткому правилу или только одним методом, а обычно комбинацией методов, адаптированных к требованиям каждого конкретного случая. Обычные методы включают:

А. Активная иммунизация.

I. Инокуляция мертвыми бактериями (т. е. бактериями, убитыми нагреванием; действием ультрафиолетовых лучей, химических бактерицидных средств или аутолизом).

II. Инокуляция аттенуированными штаммами бактерий.

III. Инокуляция живыми вирулентными бактериями (при необходимости с повышенной вирулентностью).

Б. Комбинированная активная и пассивная иммунизация:

IV. Инокуляция смесями токсин-антитоксин.

АКТИВНАЯ ИММУНИЗАЦИЯ.

Иммунизация кролика против Diplococcus pneumoniæ может служить примером общих методов иммунизации лабораторных животных.

1. Возьмите взрослого кролика весом не менее 1200–1500 граммов (крупные кролики весом 2000 граммов и более наиболее подходят для экспериментов по иммунизации). Тщательно следите за весом и температурой в течение нескольких дней, занятых следующими этапами.

2. Инокулируйте небольшого кролика внутрибрюшинно одной или двумя петлями двадцатичетырехчасовой культуры вирулентного штамма Diplococcus pneumoniæ на кровяном агаре.

Смерть должна наступить в течение двадцати четырех часов, и в любом случае она не задержится дольше сорока восьми часов.

3. При соблюдении асептических мер предосторожности во время вскрытия перенесите петлю крови из сердца в колбу Эрленмейера, содержащую 50 куб. см стерильного питательного бульона. Инкубируйте при 37° C в течение двадцати четырех часов.

4. Приготовьте также несколько культур на кровяном агаре из крови сердца кролика, промаркируйте их все как O.C. (исходная культура). После двадцати четырех часов инкубации при 37° C наденьте резиновый колпачок на закрытое пробкой горлышко пробирки всех культур, кроме одной, и покройте колпачок канадским бальзамом или шеллачным лаком, высушите и верните в термостат.

Это предотвратит испарение, и культуры, запечатанные таким образом, будут сохранять неизменную вирулентность в течение значительного времени.

5. Сделайте свежий пересев на кровяной агар из незапечатанной культуры O.C. и после двадцати четырех часов инкубации при 37° C определите минимальную летальную дозу этого штамма на серии мышей (см. стр. 316).

6. Поместите колбу, содержащую двадцатичетырехчасовую бульонную культуру (этап 3), на водяную баню при 60° C на один час. Быстро охладите колбу под струей холодной воды.

7. Определите стерильность этой (?) убитой культуры, перенеся один кубический сантиметр в каждую из нескольких пробирок с питательным бульоном, и инкубируйте при 37° C в течение двадцати четырех часов. Если происходит рост Diplococcus pneumoniæ, снова нагрейте культуру на водяной бане при 60° C в течение одного часа и снова проверьте на стерильность.

8. Введите выбранному кролику внутривенно (см. стр. 363) 2 куб. см убитой культуры и введите еще 10 куб. см в брюшную полость.

В течение следующих нескольких дней животное потеряет немного в весе и, возможно, проявит некоторую степень пирексии.

9. Когда температура и вес снова вернутся к норме — обычно примерно через семь дней после инокуляции — снова введите убитую культуру, на этот раз дав дозу 5 куб. см внутривенно и 20 куб. см внутрибрюшинно. Вероятно, будет наблюдаться температурная и весовая реакция, аналогичная той, что была после первой инъекции, но менее выраженная, но примерно через неделю животное будет готово к следующей инъекции.

10. Когда будете готовы сделать третью инъекцию, приготовьте свежий пересев на кровяной агар из другой пробирки O.C. и после двадцати четырех часов инкубации приготовьте минимальную летальную дозу (как определено в п. 5) и введите ее подкожно в брюшную стенку кролика.

Вероятно, будет наблюдаться легкая местная реакция, а также реакции веса и температуры.

11. Через неделю-десять дней введите аналогичную минимальную летальную дозу в брюшную полость.

12. Очень внимательно наблюдайте за весом и температурой кролика и, регулируя даты инокуляции в зависимости от общего состояния животного, продолжайте вводить живые культуры пневмококка в брюшную полость, постепенно увеличивая дозу кратными десяти.

13. С интервалами в два месяца можно собирать образцы крови из задней ушной вены и проверять сыворотку на наличие специфических антител.

14. При благоприятных условиях после шести месяцев постоянной работы будет обнаружено, что кролику можно вводить внутрибрюшинно целую культуру на кровяном агаре без каких-либо видимых вредных последствий; и эта характеристика — устойчивость к летальным эффектам больших доз вируса — является единственным критерием иммунитета. Более того, сыворотка, отделенная от крови, взятой у животного примерно через неделю после инъекции, при использовании в дозах 0,01 куб. см защитит мышь от летальных эффектов по крайней мере десяти минимальных летальных доз живых пневмококков.

В предыдущей иллюстрации предполагалось, что подопытному кролику был придан полный приобретенный активный иммунитет вследствие образования антител, специфичных к diplococcus pneumoniæ, в количестве, достаточном для обеспечения разрушения огромных доз живых кокков — антигеном (то есть веществом, введенным в ответ на которое было выработано антитело) в данном конкретном случае является бактериальная протоплазма пневмококка с его эндотоксинами.

Но при условии, что смерть не наступает немедленно после инъекции антигена, специфическое антитело всегда образуется в большем или меньшем количестве; и в экспериментальной работе достаточное количество любого необходимого антитела часто можно получить, не доводя процесс иммунизации до его логического завершения.

Например, если иммунизация кролика против Bacillus typhosus начинается по уже изложенным принципам, часто будет обнаружено, после нескольких инъекций «убитой» культуры, что сыворотка крови животного (даже при разведении в несколько сотен раз ее объема нормальным физиологическим раствором) содержит специфический агглютинин для B. typhosus — и если единственной целью эксперимента была подготовка агглютинина, инокуляции вполне можно прекратить на этом этапе, хотя животное еще не является иммунным в строгом смысле этого слова.

Опять же, антитела могут образовываться в ответ на антигены, отличные от инфекционных частиц — таким образом, инъекция подходящим животным чужеродных белков, таких как яичный альбумин, гетерологичные сыворотки крови или эритроциты крови от другого вида животного, приведет к образованию специфических антител, обладающих определенным сродством к их соответствующим антигенам.

Наиболее важным антителом этого последнего типа является гемолизин, вещество, которое появляется в сыворотке крови животного, предварительно инъецированного отмытыми клетками крови от животного другого вида. Сыворотка такого животного обладает способностью разрушать эритроциты того вида, который использовался в качестве антигена, и вызывать высвобождение содержащегося в них гемоглобина, и является специфической в своем действии до такой степени, что не оказывает никакого вредного воздействия на эритроциты любого другого вида животных.

Действие этой сыворотки обусловлено присутствием двух различных тел: комплемента и гемолизина.

Комплемент (или алексин) — это термолабильное, легко окисляющееся тело, присутствующее в переменном, но неизменном количестве в нормальной сыворотке каждого животного. Это вещество, которое оказывает литическое действие на все чужеродные вещества, введенные в кровь или ткани; но само по себе является сравнительно инертным телом и способно оказывать свое максимальное литическое действие только в присутствии и в сочетании со специфическим антителом, или иммунным телом.

Комплемент получают (не смешанным с антителом) путем сбора свежей сыворотки крови от любого здорового нормального (то есть неинокулированного) животного. Сыворотка морских свинок наиболее часто используется для экспериментальной работы.

Гемолизин (иммунное тело, копула, сенсибилизирующее тело, амбоцептор) — это термостабильное антитело, образующееся в ответ на инъекцию эритроцитов, которое, хотя само по себе инертно, способно связывать комплемент, присутствующий в нормальной сыворотке, с эритроцитами того вида, который использовался в качестве антигена, — комбинация, приводящая к гемолизу.

Гемолизин получают путем сбора свежей сыворотки крови от соответствующим образом инокулированного животного и подвергания ее воздействию температуры 56° C (для разрушения термолабильного комплемента) в течение 15–30 минут перед использованием. Затем он называется инактивированным и реактивируется добавлением свежей нормальной сыворотки — то есть сыворотки, содержащей комплемент.

Гемолизин важен в академическом плане благодаря тому, что многие проблемы иммунитета были прояснены с его помощью; но его нынешнее практическое значение заключается в применении гемолитической системы (то есть гемолизина, соответствующего эритроцитарного раствора и комплемента) к определенным лабораторным методам, имеющим своей целью либо идентификацию инфекционного агента, либо диагностику наличия инфекции.

Для использования в этих лабораторных методах диагностики наиболее удобно готовить гемолитическую сыворотку, специфичную для человеческой крови — независимо от того, является ли лаборатория изолированной или прикрепленной к большой больнице. Однако вместо нее можно использовать бычью, овечью или козью кровь, если она легко доступна, и, хотя следующий метод направлен на приготовление человеческого гемолизина, та же процедура применима во всех случаях.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ.

Необходимый аппарат:

Small centrifuge, preferably electrically driven, with two receptacles

for tubes, and enclosed in a safety shield (Fig. 162).

Sterile centrifuge tubes (10 c.c. capacity), Fig. 163.

Sterile pipettes (10 c.c. graduated) in case.

Sterile glass capsules (in case).

Sterile test-tubes.

Sterile all glass syringe (5 c.c. or 10 c.c. capacity)

and needle.

Fig. 162.—Small electrical centrifuge.

Fig. 163.—Centrifuge tube.

Необходимые реагенты:

Normal saline solution.

10 per cent. sodium citrate solution in normal saline.

Human blood (vide infra).

Метод. —

1. Выберите здорового взрослого кролика весом не менее 2500 граммов в соответствии с уже данными указаниями (стр. 322) и подготовьте его к внутрибрюшинной инокуляции.

2. Отмерьте 2 куб. см цитратной человеческой крови (собранной при хирургической операции или венесекции, или взятой путем венепункции из срединной локтевой или срединной головной вены нормального взрослого человека) в центрифужную пробирку и тщательно отцентрифугируйте.

3. Промойте тремя сменами нормального физиологического раствора (см. также стр. 388).

4. Перенесите отмытые клетки в стерильную капсулу с помощью стерильной пипетки. Добавьте 5 куб. см нормального физиологического раствора и тщательно перемешайте.

5. Наберите смесь клеток и физиологического раствора в цельностеклянный шприц и введите в брюшную полость кролика.

6. Семь дней спустя введите внутрибрюшинно отмытые клетки из 5 куб. см человеческой крови, смешанные с 5 куб. см нормального физиологического раствора.

7. Семь дней спустя введите отмытые клетки из 10 куб. см человеческой крови, смешанные с 5 куб. см нормального физиологического раствора.

8. После дальнейшего интервала в семь дней повторите инъекцию отмытых клеток из 10 куб. см человеческой крови, смешанных с 5 куб. см нормального физиологического раствора.

Примечание. — Лучшие результаты получаются, если вторая и последующие инъекции делаются внутривенно, даже если используются меньшие количества отмытых эритроцитов. Если, однако, выбран внутривенный путь, необходимо соблюдать чрезвычайную осторожность, чтобы избежать попадания воздуха в вену — несчастный случай, за которым в течение нескольких минут следует смерть кролика от легочной эмболии.

9. Дайте пройти пяти дням, затем возьмите предварительный образец крови, скажем, около 2 куб. см, из уха кролика. Дайте ей свернуться, отделите сыворотку и перенесите в стерильную пробирку. Поместите пробирку на водяную баню при 56° C на пятнадцать минут (для инактивации) и протестируйте сыворотку количественно на гемолитические свойства следующим образом:

ТИТРОВАНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ.

Необходимый аппарат:

Electrical centrifuge.

Sterile centrifuge tubes.

Water-bath regulated at 56°C.

Sterilised pipettes 10 c.c. graduated in tenths.

Sterilised pipettes 1 c.c. graduated in tenths.

Sterile test-tubes, 16 × 2 cm.

Small sterile test-tubes, 9 × 1 cm.

Small test-tube rack, or roll of plasticine.

Capillary teat pipettes.

Stout rubber band or length of small rubber tubing.

Необходимые реагенты и метод приготовления:

1. Нормальный физиологический раствор.

2. Гемолитическая сыворотка, инактивированная предварительным нагреванием до 56° C в течение 15 минут (см. выше) в пробирке с маркировкой H. S.

3. Комплемент. Свежая сыворотка морской свинки в пробирке с маркировкой C.

Убейте нормальную морскую свинку парами хлороформа.

Вскройте грудную клетку со всеми асептическими мерами предосторожности и соберите как можно больше крови из сердца с помощью стерильной пипетки Пастера.

Перенесите ее в стерильную центрифужную пробирку и поместите пробирку в термостат при 37° C. Два часа спустя отделите сгусток от стенок пробирки и тщательно отцентрифугируйте.

Пипеткой отберите прозрачную сыворотку в чистую стерилизованную пробирку.

4. Эритроцитарный раствор, в пробирке с маркировкой E.

Соберите и отмойте человеческие эритроциты (см. стр. 388, 1–8). Измерьте объем доступных эритроцитов и приготовьте 2-процентную суспензию в нормальном физиологическом растворе.

Метод. —

1. Возьмите две пробирки, пронумеруйте их 1 и 2 и внесите пипеткой в каждую по 9 куб. см нормального физиологического раствора.

2. Добавьте 1 куб. см гемолитической кроличьей сыворотки в пробирку № 1 и тщательно перемешайте: наберите 1 куб. см смеси и добавьте его в пробирку № 2; тщательно перемешайте.

3. Установите десять маленьких пробирок в штатив для пробирок или в рулон пластилина и пронумеруйте от 1 до 10.

4. Pipette into tube No. 1 0.5 c.c. = 0.5 c.c. hæmolytic serum} From tube H. S.
Pipette into tube No. 2 0.1 c.c. = 0.1 c.c. hæmolytic serum}
 
Pipette into tube No. 3 0.5 c.c. = 0.05 c.c. hæmolytic serum} From tube 1.
Pipette into tube No. 4 0.3 c.c. = 0.03 c.c. hæmolytic serum}
Pipette into tube No. 5 0.2 c.c. = 0.02 c.c. hæmolytic serum}
pipette into tube No. 6 0.1 c.c. = 0.01 c.c. hæmolytic serum}

 
Pipette into tube No. 7 0.5 c.c. = 0.005 c.c. hæmolytic serum} From tube 2.
Pipette into tube No. 8 0.3 c.c. = 0.003 c.c. hæmolytic serum}
Pipette into tube No. 9 0.2 c.c. = 0.002 c.c. hæmolytic serum}
Pipette into tube No. 10 0.1 c.c. = 0.001 c.c. hæmolytic serum}

5. В каждую пробирку добавьте 1 куб. см эритроцитарного раствора.

6. При необходимости (то есть в пробирках 2, 4, 5, 6, 8, 9 и 10) добавьте нормальный физиологический раствор к смеси в пробирках, пока столбик жидкости в каждой не достигнет одного и того же уровня.

7. Встряхните каждую пробирку по очереди, чтобы тщательно перемешать ее содержимое. Закройте горлышко каждой пробирки ватой и поместите весь набор в термостат при 37° C на один час.

8. Выньте пробирки из термостата и в каждую пробирку внесите пипеткой 0,1 куб. см комплемента (сыворотки морской свинки) и верните пробирки в термостат при 37° C на дополнительный период в один час.

9. Выньте пробирки из термостата, и если полный гемолиз не произошел в каждой пробирке, отставьте в сторону, желательно в ледяной шкаф, на час.

10. Затем осмотрите пробирки.

Полный гемолиз обозначается прозрачным красным раствором без осадка эритроцитов на дне пробирки.

Отсутствие гемолиза обозначается прозрачной или мутной бесцветной жидкостью с осадком эритроцитов на дне пробирок.

Наименьшее количество гемолитической сыворотки, вызвавшее полный гемолиз, известно как минимальная гемолитическая доза (М. Г. Д.), и если гемолиз произошел во всех пробирках до № 7, то м. г. д. этой конкретной сыворотки составляет 0,005 куб. см = 200 минимальных гемолитических доз на кубический сантиметр. Такая сыворотка достаточно сильна для экспериментальной работы; действительно, для многих целей полный гемолиз до пробирки 6 будет указывать на сыворотку достаточной силы (= 100 м. г. д. на кубический сантиметр). Если, однако, полностью гемолизированы только первые одна или две пробирки, это является показателем того, что кролик должен получить дополнительные инъекции, чтобы повысить гемолитическую силу до достаточно высокого уровня.

ХРАНЕНИЕ ГЕМОЛИЗИНА.

Если и когда содержание гемолизина в сыворотке кролика окажется достаточным, умертвите животное парами хлороформа.

Удалите как можно больше крови из сердца при соблюдении асептических мер предосторожности в стерилизованные центрифужные пробирки.

Перенесите пробирки с кровью в термостат при 37° C на два часа — затем тщательно отцентрифугируйте.

Пипеткой отберите прозрачную сыворотку и разлейте ее количествами по 1 куб. см в маленькие стеклянные ампулы или пипетки и герметично запаяйте в пламени горелки, стараясь избежать подгорания сыворотки.

Поместите ампулы, когда они наполнены сывороткой и запаяны, на водяную баню при 56° C на 30 минут. Это разрушает комплемент, т. е. инактивирует сыворотку, и в то же время, при условии, что различные операции проводились при соблюдении асептических мер предосторожности, обеспечивает ее стерильность. Более длительное воздействие снижает гемолитическую силу.

Поместите ампулы в закрытую металлическую коробку и храните в ледяном шкафу для будущего использования.

СНОСКИ:

[10] Приведенные здесь количества не являются абсолютно точными. Если важна точность, студент должен рассчитать необходимое количество с помощью Формулы процентов, Приложение, стр. 496.

[11] См. Формулу процентов, Приложение, стр. 496.

XVII. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ИНОКУЛЯЦИЯ ЖИВОТНЫХ.

Использование живых животных для экспериментов по инокуляции может стать необходимой процедурой в бактериологической лаборатории по одной или нескольким из следующих причин:

А. Определение патогенетических свойств бактерий, уже выделенных в чистую культуру (см. стр. 315).

Точное изучение условий, влияющих на вирулентность (включая ее поддержание, экзальтацию и аттенуацию) микроорганизма, и точные наблюдения за патогенными эффектами, вызванными его проникновением в ткани организма и размножением в них, очевидно, могут быть проведены только с помощью экспериментальной инокуляции; в то время как многие вопросы, касающиеся жизнеспособности, долголетия и т. д., могут быть наиболее легко прояснены с помощью таких экспериментов.

Б. Выделение патогенных бактерий.

Некоторые высокопаразитарные бактерии (которые с трудом растут на искусственных средах лаборатории) могут быть выделены с большим трудом из ассоциированных сапрофитных бактерий, когда используются только культуральные методы; но если смесь паразита и сапрофитов вводится животному, восприимчивому к действию первого, патогенный микроорганизм может быть легко выделен из тканей инфицированного животного. Пневмококк, например, встречается в мокроте пациентов, страдающих острым лобарным воспалением легких, но обычно в ассоциации с различными сапрофитами, происходящими из полости рта и глотки. Оптимальная среда для роста пневмококка, кровяной агар, также является отличным питательным субстратом для сапрофитов полости рта, и чашечные культуры быстро зарастают ими, что приводит к гибели более нежного пневмококка. Но инокулируйте часть мокроты под кожу мыши, и через три или четыре дня пневмококк попадет в кровоток (оставив сапрофиты в месте инокуляции) и убьет животное. Культуры, сделанные при вскрытии (см. стр. 398) из крови сердца мыши, дадут чистый рост пневмококка.

В. Идентификация патогенных бактерий.

Сходства, морфологические и культуральные, существующие между некоторыми патогенными бактериями, в некоторых случаях настолько велики, что полностью подавляют различия; опять же, одна и та же бактерия может при различных условиях принимать вид, настолько отличающийся от тех, что считаются типичными или нормальными, что вызывает сомнения в ее идентичности. В каждом случае простой эксперимент по инокуляции может сразу решить этот вопрос. В качестве конкретного примера можно привести вскрытие животного, умершего от неизвестной инфекции. Культуры из крови сердца дали чистый рост типичного (капсулированного) пневмококка. Культуры из печени дали чистый рост того, что казалось типичным (некапсулированным) Streptococcus pyogenes longus. Последний, инокулированный кролику, вызвал смерть животного от пневмококкового сепсиса, а культуры из крови кролика дали чистый рост типичного (капсулированного) пневмококка.

Г. Изучение проблем иммунитета.

Только путем тщательного и детального изучения поведения животной клетки и жидкостей организма по отношению к инфицирующей бактерии становится возможным пролить свет на сложную проблему, посредством которой клетка противопоставляет успешное сопротивление диффузии вторгающегося микроба или преуспевает в изгнании микроба после возникновения этой диффузии.

В данный момент, однако, наше внимание направлено на первый из этих широких заголовков, ибо именно применением знаний, приобретенных в его преследовании, мы способны справляться с проблемами, возникающими в рамках любого из остальных.

Для какой бы цели ни проводилась инокуляция, важно, чтобы эксперимент был спланирован так, чтобы обеспечить максимальное количество информации и минимум дискомфорта для используемого животного. Поэтому необходимо проявлять всяческую осторожность, чтобы гарантировать, что вирус вводится точно в выбранную ткань или орган; и сама операция должна выполняться с мастерством и быстротой, и в строго асептических условиях.

В ходе исследований инокуляции будет встречено много случаев естественного иммунитета, как расового, так и индивидуального; но следует помнить, что естественный иммунитет является лишь относительным и никогда не бывает абсолютным, и следует проявлять осторожность, чтобы не маркировать микроорганизм как непатогенный, пока не будет выполнено много различных методов инокуляции на различных видах животных, в сочетании при необходимости с различными процедурами, рассчитанными на преодоление любого кажущегося иммунитета, и они неизменно давали отрицательные результаты.

В некоторых странах эксперименты на животных разрешены только по прямой лицензии правительства и только в помещениях, специально лицензированных для этой цели. В Англии эта лицензия выдается министром внутренних дел и дает разрешение на эксперименты на животных под общей анестезией при условии, что после завершения эксперимента животное должно быть умерщвлено до того, как придет в сознание. Если предполагается проведение простых подкожных инокуляций и поверхностных венесекций, необходимо получить Сертификат А, предоставляющий это конкретное разрешение и освобождающий от необходимости общей анестезии, в дополнение к лицензии; в то время как если инокуляция влечет за собой более обширные оперативные процедуры и необходимо наблюдать за последующим течением инфекции, если таковая возникнет, лицензия должна быть дополнена Сертификатом B — поскольку этот сертификат снимает обязательство умерщвлять животное, пока оно находится под анестезией. Дальнейшие специальные сертификаты и комбинации сертификатов требуются, если объектами эксперимента должны быть кошки, собаки, лошади, ослы или крупный рогатый скот. По каждому сертификату прямо оговорено, что если животное проявляет признаки боли, оно должно быть немедленно умерщвлено.

Животные, обычно используемые при изучении патогенных свойств различных микроорганизмов, — это:

Cold Blooded.Warm Blooded.Hot Blooded.
Frog.Mouse.Fowl.
Toad.Rat.Pigeon.
Lizard.Guinea pig.
Rabbit.
Monkey.

Подготовка. — Перед инокуляцией подопытных животных следует тщательно осмотреть, чтобы избежать риска использования уже больных: поскольку следует помнить, что в естественном состоянии, так же как и в неволе, животные, используемые для лабораторных инокуляций, подвержены инфекции различными животными и растительными паразитами, и в некоторых случаях такая инфекция не проявляет симптомов, очевидных при случайном осмотре; следует отметить пол, записать вес и измерить ректальную температуру. Остальными важными пунктами являются время инокуляции, материал, который инокулируется, метод инокуляции и, наконец, под чьим руководством проводится эксперимент. В лаборатории автора эти данные заносятся на розовую карточку, которая является частью картотечной системы. Карточка также предоставляет место для заметок о ходе результирующей инфекции и содержит на обороте график веса и температуры (Рис. 164 и 165).

Fig. 164.—Front of inoculation card.

Предварительный осмотр и обследование. — Предварительное обследование должно включать наблюдение за животным в покое и в движении; внешний вид шерсти, перьев или чешуи, осмотр глаз и внешних отверстий тела; тактильное обследование тела и конечностей, а также пальпацию паха и живота; и во многих случаях микроскопическое исследование свежих и окрашенных мазков крови.

Некоторые из более распространенных форм естественно приобретенной инфекции могут быть кратко упомянуты, не затрагивая, однако, различных блох, вшей и клещей, которые временами заражают обычных лабораторных животных.

Fig. 165.—Back of inoculation card.

Кролик, особенно в неволе, подвержен нападениям Psoric Acari, и инфекция легко передается кроликам в соседних клетках, а также морским свинкам, но не крысам и мышам. Один вид (Sarcoptes minor var. cuniculi) вызывает обычную чесотку. Инфекция сначала проявляется в виде толстых желтоватых чешуек и корок вокруг носа, рта и глаз, распространяется на основания и внешние поверхности ушей (никогда не внутрь ушной раковины), на передние и задние лапы, в пах и вокруг гениталий. Клещи могут быть легко продемонстрированы микроскопически в соскобах кожи, обработанных раствором поташа. Другая форма чесотки (вызванная Psoroptes communis cuniculi) начинается на дне ушной раковины, которая заполняется беловато-желтыми массами, состоящими из высушенных корок, чешуек, фекалий и мертвых клещей. Основание уха твердое и опухшее, и поднятие животного за уши — как это обычно делается — вызывает значительную боль; действительно, этот симптом может быть тем, который первым привлекает внимание к инфекции, вызывающей прогрессирующее истощение и заканчивающейся смертью. Иногда наблюдается смешанная инфекция — саркоптоз плюс псороптоз.

Если принято решение попытаться спасти животных, страдающих от инфекции этими паразитами, их необходимо изолировать, струпья тщательно очистить с инфицированных участков, а обнаженные поверхности промыть 5-процентным раствором персульфата калия (несколько капель дать стечь в ушную раковину) или препаратом, содержащим равные части мягкого парафина и вазелина с несколькими каплями лизола. Это лечение следует повторять ежедневно, пока клещ не будет уничтожен и животное не вернется в нормальное состояние. Клетки должны быть продезинфицированы, все соседние животные тщательно осмотрены, и любые, проявляющие признаки инфекции, должны быть обработаны аналогичным образом. Парша также поражает кролика, и типичные пятна сначала отмечаются вокруг основания уха.

Инфекция Coccidium oviforme очень распространена, не проявляя, однако, никаких симптомов, по которым инфекцию можно было бы распознать. Обычно состояние отмечается только при вскрытии, когда печень оказывается усеянной многочисленными казеозными бугорками, которые при исследовании оказываются кистозными областями, заполненными кокцидиями. Иногда также печень кролика, умершего от какой-либо преднамеренной или случайной бактериальной инфекции, при вскрытии оказывается отмеченной тонкими желтоватыми полосками и небольшими бугорками из-за эмбрионов Tænia serrata, в то время как кистозная форма (Cysticercus pisiformis) часто отмечается свободно в брюшной полости или поражающей брыжейку.

Образование абсцессов от инфекции обычными пиогенными бактериями встречается у кролика естественным образом, и часто виварий лаборатории бывает опустошен инфекционным сепсисом, вызванным B. cuniculicida.

Мышь и крыса страдают от сепсиса и от цистицеркоидной формы Tænia murina; кистозная форма (Cysticercus fasciolaris) T. crassicollis имеет свое место обитания в их печени. Эти мелкие грызуны часто заражены чесоткой, но если их обеспечить чистой соломой, они будут очищаться, протираясь сквозь нее. Мышь также поражается паршой, а крыса часто заражена Trypanosoma Lewisi.

Морская свинка, как и кролик, страдает от чесотки и кокцидиоза. Кроме того, она часто естественно инфицирована B. tuberculosis, и разумной предосторожностью является проверка животных, как только они попадают в лабораторию, путем инъекции старого туберкулина Коха — 0,5 куб. см вызывают смерть туберкулезной морской свинки в течение 48 часов.

Обезьяна естественно склонна к туберкулезу, и ей следует ввести 1 куб. см старого туберкулина по прибытии в лабораторию. Ткани обезьяны также служат местом обитания для нематоды, паразитирующей у крупного рогатого скота (Œsophagostoma inflatum), напоминающей Anchylostomum, и этот паразит часто пробуравливает стенку кишечника и провоцирует образование небольших кист в непосредственно прилегающей брыжейке. Наличие этих кист может вызвать значительные размышления при вскрытии.

Голубь может быть инфицирован Hæmosporidia, и в его крови может быть обнаружено присутствие halteridia. Эта птица также может быть объектом бактериальной инфекции, известной как дифтерия голубей; в то время как домашняя птица может быть подвержена чесотке и стригущему лишаю или страдать от холеры птиц или сепсиса птиц — инфекций, вызванных представителями группы геморрагического сепсиса.

Взвешивание. — Крупных животных наиболее удобно взвешивать на десятичных весах, снабженных металлической клеткой для их размещения вместо обычной чаши (Рис. 166). Мышей и крыс взвешивают на модификации почтовых весов, взвешивающих до 250 граммов, у которых коническая проволочная клетка (тщательно уравновешенная) заменена на их первоначальную чашу (Рис. 167).

Fig. 166.—Rabbit scales.

Температура. — Для измерения ректальной температуры у любого из лабораторных животных помощник должен осторожно, но крепко удерживать животное. Введите наконечник обычного клинического термометра, хорошо смазанный вазелином, непосредственно за сфинктер ануса. Оставьте его в этом положении на несколько секунд, а затем осторожно и плавно продвигайте его до тех пор, пока весь наконечник и часть стержня, до сужения, не войдут в прямую кишку. Через три-пять минут, время варьируется, конечно, в зависимости от чувствительности используемого термометра, извлеките инструмент и снимите показания. Термометры, используемые для регистрации температуры, должны время от времени проверяться путем сравнения со стандартным сертифицированным термометром Кью, хранящимся в лаборатории для этой цели.

Fig. 167.—Mouse scales

Клетки. — В период между инокуляцией и смертью или полным выздоровлением подопытных животных необходимо содержать в подходящих емкостях, которые можно легко содержать в чистоте и быстро дезинфицировать.

Мышей обычно содержат в стеклянной банке (рис. 168) высотой 11 см и диаметром 11 см, закрытой крышкой из проволочной сетки, которая утяжелена свинцом или прикреплена к горлышку банки байонетным затвором. Небольшая прямоугольная этикетка размером 5 см на 2,5 см, нанесенная пескоструйным методом на боковую сторону цилиндра, является очень удобным приспособлением, так как записи, сделанные на ней обычным графитовым карандашом, хорошо видны и для их удаления требуется лишь влажная ткань (рис. 168).

Крысу содержат под наблюдением в стеклянной банке, аналогичной той, что используется для мыши, но большего размера.

Fig. 168.—Mouse jar.

Fig. 169.—Tripod.

Слой опилок на дне банки впитывает влагу, а в качестве подстилки следует использовать вату или бумажную стружку. Корм должен состоять из отрубей и овса с периодическим добавлением хлеба, размоченного в молоке.

Использование металлической треноги, на платформе которой внутри клетки припаяны две небольшие чашки для корма, предотвращает его разбрасывание или загрязнение экскрементами (рис. 169).

После использования банки и треноги стерилизуют либо химическими реагентами, либо автоклавированием.

Кроликов и морских свинок содержат в клетках подходящего размера, изготовленных полностью из металла (рис. 170). Боковые стороны, верх и низ выполнены из плетеной проволоки; под клеткой находится выдвижной металлический поддон, наполненный опилками, для сбора экскрементов. Клетка в целом приподнята над землей на коротких ножках. Боковые стороны и другие элементы обычно крепятся на петлях, чтобы клетку можно было сложить в плоскую конструкцию для удобства хранения и стерилизации.

Обычная крысиная клетка, представляющая собой прямоугольный ящик из проволочной сетки размером 30 см спереди назад, 20 см в ширину и 14 см в высоту, отлично подходит для морских свинок, если ее установить на неглубокий цинковый поддон размером 35 см на 24 см.

Fig. 170.—Metal rabbit rage.

Для подстилки следует обеспечить обильное количество соломы, а корм должен состоять из свежих овощей, листьев капусты, ботвы моркови и репы и тому подобного для утреннего кормления, а также разломанного галетного печенья для вечернего кормления. Иногда в клетку можно поставить немного воды в глиняной посуде.

Поддон, в который попадают экскременты, следует ежедневно очищать и засыпать свежими опилками, а загрязненные опилки, остатки пищи и т. д. — сжигать.

Эти клетки после использования стерилизуют либо автоклавированием, либо опрыскиванием формалином.

Поскольку инокуляция животных является чисто хирургической операцией, необходимые инструменты будут аналогичны тем, что используются хирургом, и, подобно им, должны быть стерильными. При выполнении инокуляции необходимо строго соблюдать асептику и принимать соответствующие меры предосторожности для защиты от случайного загрязнения материала, вводимого животному. Кроме того, руки оператора должны быть тщательно продезинфицированы.

Приведенный ниже список аппаратуры, используемой при инокуляции животных, включает практически все необходимое для любой инокуляции. Излишне говорить, что вся аппаратура никогда не потребуется для одной конкретной инокуляции.

Fig. 171.—Hypodermic syringe with finger rests.

Аппаратура, необходимая для инокуляции животных:

1. Стерилизатор для воды (см. стр. 33). Также удобно иметь второй стерилизатор для воды, аналогичный, но меньшего размера (23 на 7 на 5 см), для стерилизации шприцев.

2. Шприц для инъекций. Лучшей формой является обычный подкожный шприц емкостью 1 куб. см, градуированный с делениями по одной двадцатой кубического сантиметра (0,05 куб. см), оснащенный упорами для пальцев, но с кожаными прокладками и поршневым уплотнением, замененными на асбестовые (рис. 171). Инструмент должен легко разбираться, а запасные части должны быть под рукой на случай случайной поломки или потери. Другими полезными шприцами являются шприцы емкостью 2, 5, 10 и 20 куб. см. Необходимо иметь хороший запас игл, как остроконечных, так и с тупыми концами. Для стерилизации шприца наполните его водой, ослабьте уплотнение поршня и все винтовые соединения, поместите его в стерилизатор и кипятите не менее пяти минут. Дезинфицируйте шприц после использования аналогичным образом. Иглы, которые очень склонны к ржавлению после кипячения, следует хранить в банке с абсолютным спиртом, когда они не используются.

3. Операционный стол.

4. Хирургические инструменты. Стерилизуйте их перед использованием путем кипячения и дезинфицируйте после использования тем же способом. Насухо вытрите сразу после завершения дезинфекции.

Ножницы, зонд и остроконечные инструменты.

Анатомические пинцеты различных моделей.

Зажимные пинцеты.

Ранорасширители (малые самофиксирующиеся, рис. 172).

Аневризматические иглы, острые и тупые.

Скальпели, кератомы с металлическими ручками. Трепаны.

Стальные зажимы Мишеля и специальные щипцы для их наложения. Эти небольшие стальные зажимы позволяют оператору легко и быстро закрывать разрезы кожи и наиболее удобны для операций на животных.

Хирургические иглы.

Иглодержатель.

Мягкие резиновые катетеры различных размеров.

Эластичные гуммированные пищеводные бужи с соединением для шприца.

Fig. 172. Small self retaining retractors.

5. Анестетик.

(а) Общий: Самым безопасным общим анестетиком для животных является свежеприготовленная смесь А. С. Э., содержащая по объему 1 часть спирта, 2 части хлороформа, 6 частей эфира, и ее следует вводить с помощью «конуса», образованного скручиванием одного угла полотенца и помещением внутрь ватного тампона, или с помощью пропитанного ватного тампона, уложенного на дно небольшого стакана.

(б) Местный:

1. Cocaine hydrochloride, 2 per cent. in adrenalin 1 per mille solution.

2. Beta-eucaine, 2 per cent. in adrenalin, 1 per mille solution.

3. Ethyl chloride jet.

6. Стерильные стеклянные капсулы различных размеров.

7. Футляры со стерильными пипетками { 10 куб. см (с делениями по одной десятой кубического сантиметра). { 1 куб. см (с делениями по одной сотой кубического сантиметра).

8. Колбы (75 куб. см), содержащие стерилизованный физиологический раствор (или стерильный бульон).

9. Стерилизованная вата. Вата (гигроскопическая) неплотно упаковывается в медный цилиндр, аналогичный тому, что используется для хранения капсул, и стерилизуется в сушильном шкафу.

10. Стерилизованная марля. Марля стерилизуется так же, как и вата.

11. Стерилизованный шелк и кетгут для швов. Их стерилизуют по мере необходимости путем кипячения в течение десяти минут в стерилизаторе для воды.

12. Гибкий коллодий (или сложная настойка бензоина).

13. Карандаш для маркировки стекла.

14. Привязываемые целлулоидные этикетки для крепления к клеткам.

15. Бритва.

16. Небольшая емкость с теплой водой.

17. Жидкое мыло. Жидкое мыло готовится следующим образом: отмерьте 100 граммов мягкого мыла и добавьте к 500 куб. см 2-процентного раствора лизола в большом стеклянном стакане; растворите путем нагревания на водяной бане при температуре около 90° C. Разлейте по бутылкам и наклейте этикетку «Жидкое мыло».

18. Вместо жидкого мыла и бритвы иногда удобно использовать депиляторный порошок.

Barium sulphide 1 part

Rice starch 3 parts

Густо посыпьте порошком участок, с которого нужно удалить волосы, сбрызните водой и смешайте в тонкую пасту прямо на месте; дайте пасте подействовать в течение трех минут, затем соскребите костяным шпателем — волосы удаляются вместе с пастой, оставляя идеально чистый участок. Этот процесс предпочтительно проводить за день до операции.

Материал, используемый для инокуляции. — Инокулируемый материал может быть либо —

1. Культуры бактерий — выращенные в жидких средах или на твердых средах.

2. Продукты метаболизма бактериальной активности — например, токсины в растворе.

3. Патологические продукты (жидкие секреты и экскреты, плотные ткани).

Подготовка инокулята. —

(а) Культивирование в жидких средах. —

1. Прокалите пробку пробирки с культурой.

2. Удалите пробку и прокалите горлышко пробирки.

3. Слегка приподнимите крышку стерильной капсулы, вставьте горлышко пробирки с культурой в отверстие и перелейте часть культуры в капсулу.

4. Извлеките горлышко пробирки с культурой из капсулы, закройте крышку последней, прокалите горлышко пробирки и снова закройте пробкой.

5. Извлеките шприц из стерилизатора, вытесните из него воду и дайте остыть.

6. Приподнимите крышку капсулы настолько, чтобы ввести иглу шприца, и наберите необходимое количество культуры в цилиндр шприца.

(Или удалите определенное измеренное количество культуры непосредственно из пробирки или колбы с помощью стерильной градуированной пипетки, вылейте измеренное количество в стерильную капсулу и наберите в шприц; или наберите необходимое количество культуры непосредственно в градуированный шприц из пробирки или колбы.)

Fig. 173.—Conical separatory funnel, fitted for
injection of fluid cultivations.

Если необходимо ввести большой объем жидкости животному, культуру следует перенести с соблюдением асептических мер предосторожности в стерильную делительную воронку, предпочтительно формы, показанной на рисунке 173, и при необходимости градуированную. Она устанавливается на штативе и поднимается достаточно высоко над уровнем животного, которому делается инъекция, чтобы обеспечить хороший «напор». Кусок стерилизованной резиновой трубки подходящей длины, оснащенный инъекционной иглой и снабженный винтовым зажимом, теперь присоединяется к носику воронки, и операция завершается в соответствии с требованиями конкретного случая.

Этот метод вполне удовлетворителен, когда инъекция делается в плевральную или брюшную полости или непосредственно в вену, но если инъекцию необходимо сделать в подкожную клетчатку, «напора» может быть недостаточно, чтобы протолкнуть жидкость. В этом случае необходимо перенести культуру в стерильную промывалку, прикрепить ручные резиновые мехи к трубке для впуска воздуха (установив воздушный фильтр) и присоединить трубку с инъекционной иглой к выпускной трубке (рис. 174). При осторожном использовании можно получить достаточное усилие для выполнения инъекции.

(б) Культивирование на твердых средах (например, скошенный агар). —

1. С помощью стерильной градуированной пипетки введите подходящее небольшое количество стерильного бульона (или стерильного физиологического раствора) в пробирку с культурой.

Fig. 174.—Arrangement of pressure injection apparatus.

2. Стерильной платиновой петлей или шпателем соскоблите бактериальный рост с поверхности среды и эмульгируйте его с бульоном. После этого он фактически становится жидким инокулятом.

3. Перелейте эмульсию в стерильную капсулу и наполните ею шприц.

(в) Токсины. — Подготовленные ранее описанными методами (см. стр. 318), с ними обращаются аналогично культурам в жидких средах.

(г) Патологические продукты. — Жидкие секреты, экскреты и т. д., такие как серозный экссудат, гной, кровь и т. д., обрабатываются как жидкие культуры; но если материал очень густой или вязкий, для его разбавления можно использовать небольшое количество стерильного бульона или физиологического раствора, а тщательное перемешивание осуществляется с помощью стерильной платиновой палочки.

Плотные ткани, такие как селезенка, лимфатические узлы и т. д., можно разделить на мелкие кусочки стерильными инструментами и растереть в стерилизованной агатовой ступке (используя агатовый пестик) с небольшим количеством стерильного бульона, после чего наполнить шприц полученной эмульсией.

Fig. 175.—Holding rabbit for shaving.

Если желательно инокулировать ткань en masse, удалите из материала небольшой кубик размером 1 или 2 мм и введите его в рану, сделанную стерильными инструментами в подходящем месте, и закройте рану с помощью стальных зажимов Мишеля и герметичной повязки.

Метод фиксации животных во время инокуляции. —

Для большинства инокуляций, особенно когда анестетик не вводится, принято привлекать помощника для удержания животного (см. рис. 175).

При работе в одиночку полезным приспособлением является держатель Воге для морских свинок, метод использования которого легко понятен из прилагаемых рисунков (рис. 176, 177).

Сам инструмент состоит из полого медного цилиндра, один конец которого загнут вокруг кольца из толстой медной проволоки, и с этого открытого конца прорезана щель, проходящая примерно до середины одной стороны цилиндра. Противоположный конец закрыт «съемной» крышкой и перфорирован по краю рядом вентиляционных отверстий, которые совпадают с отверстиями, прорезанными в ободке крышки. В случае, если животное сопротивляется попыткам извлечь его из держателя задним ходом, эту крышку снимают, держатель кладут на стол, и морской свинке позволяют выйти самостоятельно.

Fig. 176.—Taking guinea-pig's temperature.

Для животных разного размера будут полезны два размера этого держателя:

1. Length, 16 cm.; breadth, 6 cm.; size of slot, 8 cm. by 2.5 cm.

2. Length, 20 cm.; breadth, 8 cm.; size of slot, 10 cm. by 2.5 cm.

Удобный держатель для мышей и даже небольших крыс показан на рисунке 178, хвост надежно удерживается пружинным зажимом. Излишне говорить, что держатель должен быть полностью металлическим, а проволочная клетка — съемной и легко заменяемой.

Fig. 177.—Voge's holder.

Когда животное находится под анестезией, удобнее надежно зафиксировать его на простой форме операционного стола, такой как стол Татена (рис. 179), который подходит для кроликов, морских свинок и крыс, или на более сложном столе, разработанном автором (рис. 180).

Fig. 178.—Mouse holder.

Fig. 179.—Tatin's operation table.

Операционный стол. — Это стол «асептического» типа, состоящий из стальных трубок, никелированных или эмалированных. Рама столешницы достаточно велика, чтобы вместить кроликов, собак и обезьян; она поддерживается телескопическими стойками, поэтому регулируется по высоте; в своей длинной оси она может наклоняться (с любого конца) на 45° от горизонтали. Кроме того, она может полностью вращаться вокруг своей длинной оси. Сама столешница состоит из листа медной проволочной сетки, свободно подвешенной к длинным сторонам трубчатой рамы. Слабина сетчатого ложа позволяет поместить под животное резиновую грелку или электротерм, и если в ходе эксперимента необходимо перевернуть животное, рама столешницы полностью поворачивается, устройство, принятое для подвешивания сетки, отсоединяется, и сетка также переворачивается, так что она снова поддерживает животное снизу.

Fig. 180.—Author's operating table[12]

МЕТОДЫ ИНОКУЛЯЦИИ.

Следующие методы инокуляции применяются более конкретно к кролику, но из них легко будет увидеть, какие модификации в технике, если таковые имеются, необходимы в случае других подопытных животных.

1. Кожная инокуляция. — (Анестезия не требуется.)

1. Попросите помощника крепко держать животное (или зафиксируйте его на операционном столе).

2. Нанесите жидкое мыло на мех над участком, выбранным для инокуляции, с помощью ватного тампона и обильно вспеньте с помощью теплой воды; тщательно и аккуратно побрейте; или нанесите депиляторный порошок.

3. Тщательно промойте оголенный участок кожи 2-процентным раствором лизола.

4. Смойте лизол эфиром и дайте последнему испариться.

5. Сделайте многочисленные короткие, параллельные, поверхностные разрезы кончиком стерильного скальпеля.

6. Когда выделение из разрезов прекратится, вотрите инокулят в скарификации с помощью плоской стороны лезвия скальпеля или стерильного платинового шпателя.

7. Накройте инокулированный участок прокладкой из стерильной марли, закрепленной на месте полосками лейкопластыря или путем запечатывания краев марли коллодием.

8. Освободите животное, поместите его в клетку и прикрепите этикетку, на которой написано:

(a) Distinctive name or number of the animal.

(b) Its weight.

(c) Particulars as to source and dose of inoculum.

(d) Date of inoculation.

2. Подкожная инокуляция. —

(а) Жидкий инокулят. — (Анестезия не требуется.)

Шаги 1-4. Как при кожной инокуляции.

5. Зажмите складку кожи между указательным и большим пальцами левой руки; возьмите заряженный подкожный шприц в правую руку, введите иглу в гребень кожи, поднятый левыми пальцами, и плавно продвигайте ее вперед, пока около 2 см иглы не окажутся в подкожной клетчатке. Теперь отпустите захват левой руки и медленно введите жидкость, содержащуюся в шприце.

6. Извлеките иглу и в тот же момент закройте место прокола ватным тампоном, чтобы предотвратить вытекание инокулята. Введенная жидкость, если ее объем невелик, впитается в течение очень короткого времени.

7. Этикетка и т. д.

(б) Твердый инокулят. — (Анестезия не требуется; или спрей хлорэтила.)

Шаги 1-4. Как при кожной инокуляции.

5. Поднимите небольшую складку кожи пинцетом и сделайте небольшой разрез через кожу парой остроконечных ножниц или кончиком скальпеля.

6. Вставьте зонд через отверстие и плавно продвигайте его вперед в подкожной клетчатке, а боковыми движениями отделите кожу от подлежащих мышц, чтобы сформировать воронкообразный карман с вершиной в сторону точки входа.

7. С помощью пары остроконечных пинцетов введите небольшой кусочек инокулята в этот карман и поместите его как можно дальше от точки входа.

Fig. 181.—Glass tube syringe for subcutaneous "solid"
inoculation.

Или импровизируйте шприц, вставив кусок стеклянной палочки (в качестве поршня) в просвет чуть более короткого отрезка стеклянной трубки и закрепив его на месте полоской резиновой трубки. Стерилизуйте кипячением. Оттяните стержень на несколько миллиметров и поместите кусочек ткани внутрь отверстия трубки с помощью стерильных пинцетов. Теперь пропустите трубку в глубину «кармана», протолкните стеклянный стержень, пока он не выйдет за конец трубки, и извлеките аппарат, оставив ткань в ране.

8. Закройте рану на коже зажимами Мишеля и повязкой из марли, запечатанной коллодием (или настойкой бензоина).

9. Этикетка и т. д.

3. Внутримышечная. —

(а) Жидкий инокулят. — (Анестезия не требуется.)

Шаги 1-4. Как при кожной инокуляции.

5. Зафиксируйте кожу над выбранной мышцей или мышцами слегка разведенными указательным и большим пальцами левой руки.

6. Смело введите иглу инъекционного шприца в мышечную ткань и медленно введите инокулят.

7. Этикетка и т. д.

(б) Твердый инокулят. — (Анестезия, А. С. Э.)

1. Зафиксируйте животное на операционном столе и дайте анестезию.

2. Побрейте и продезинфицируйте кожу в месте операции.

3. Окружите поле операции полосками марли, отжатыми в 2-процентном растворе лизола.

4. Поочередно рассеките кожу, апоневроз и мышцу.

5. Поместите инокулят в глубину разреза.

6. Закройте рану в мышце погружными швами, а кожную рану — непрерывными или узловыми швами, либо стальными зажимами Мишеля.

7. Наложите герметичную повязку из марли и коллодия.

8. Снимите животное с операционного стола.

9. Этикетка и т. д.

4. Внутрибрюшинная. —

(а) Жидкий инокулят. — (Анестезия не требуется.)

Шаги 1-4. Как при кожной инокуляции. Побрейте довольно широкий поперечный участок, простирающийся от бока до бока.

5. Поместите указательный палец левой руки на один бок, а большой палец — на противоположный, и зажмите всю толщу брюшной стенки в треугольную складку. Теперь, сдвигая брюшинные поверхности (которые находятся в соприкосновении) одну относительно другой, убедитесь, что петли кишечника не попали в складку.

6. Возьмите шприц в правую руку и иглой проткните складку у ее основания (рис. 182).

7. Теперь отпустите складку, но удерживайте шприц неподвижно; по мере расправления брюшной стенки кончик иглы оказывается свободным в брюшной полости (см. рис. 183).

Fig. 182.—Intraperitoneal inoculation—fluid.

8. Введите жидкость из шприца.

9. Этикетка и т. д.

Fig. 183.—Section of abdominal wall, etc., showing point
of needle lying free in the peritoneal cavity above the coils of
intestine.

Второй метод:

Шаги 1-4. Как в первом методе.

5. Анестезируйте небольшой выбранный участок кожи, опрыскав его хлорэтилом.

6. Нагрейте платиновую проволоку для прижигания (проволока 0,5 мм, скрученная в форму, указанную на рисунке 184, закрепленная в алюминиевой ручке) докрасна и ею прожгите отверстие через анестезированный участок кожи и брюшной мышцы до висцеральной брюшины, но не протыкая ее.

7. Закрепите иглу с тупым концом на заряженном шприце и, плотно прижав закругленный конец к брюшине, ее можно легко протолкнуть в брюшную полость.

8. Введите жидкость из шприца.

9. Этикетка и т. д.

Этот метод особенно полезен, когда желательно собирать образцы перитонеальной жидкости время от времени в течение периода наблюдения, так как жидкость можно удалять из брюшной полости через интервалы времени через это отверстие в брюшной стенке с помощью стерильной капиллярной пипетки.

Fig. 184.—Platinum wire for burning hole through
parietes.

(б) Твердый инокулят (или имплантация капсул, содержащих жидкие культуры). — (Анестезия, А. С. Э.)

1. Анестезируйте животное и зафиксируйте его на операционном столе.

2. Побрейте большой участок брюшной стенки.

3. Сделайте разрез через кожу по средней линии длиной около 2 см, на полпути между нижним концом грудины и лобком.

4. Разделите апоневрозы между прямыми мышцами живота на желобоватом зонде.

5. Разделите брюшину на желобоватом зонде.

6. Введите инокулят в брюшную полость.

7. Закройте брюшную полость швами Ламбера.

8. Закройте разрезы кожи и апоневроза вместе узловыми швами или стальными зажимами Мишеля и наложите герметичную повязку.

9. Освободите животное от операционного стола.

10. Этикетка и т. д.

Подходящие мешочки можно легко подготовить одним из следующих методов:

А. Коллодиевые мешочки.

1. Окуните небольшую пробирку (5 на 0,5 см), дном вниз, в стакан с коллодием и высушите на воздухе; повторите этот процесс три или четыре раза.

2. Окуните пробирку с покрытием из коллодия попеременно в стакан со спиртом и стакан с водой. Это разрыхляет коллодий и позволяет снять его в форме небольшой пробирки.

3. Возьмите отрезок стеклянной трубки длиной 20 см, примерно диаметра пробирки, использованной для формирования мешочка, и вставьте один конец в открытое горлышко мешочка.

4. Подвесьте стеклянную трубку с прикрепленным мешочком внутри большей пробирки, уплотнив вату в горлышке пробирки вокруг стеклянной трубки, и поместите в инкубатор при 37° C на двадцать четыре часа. После извлечения из инкубатора мешочек будет прочно прикреплен к концу стеклянной трубки.

5. Закройте открытый конец стеклянной трубки ватой и стерилизуйте пробирку и ее содержимое в сушильном шкафу.

Чтобы использовать мешочек, удалите пробку из стеклянной трубки, частично наполните мешочек культурой для инокуляции с помощью стерильной капиллярной пипетки и снова закройте трубку пробкой. Когда брюшная полость будет вскрыта, извлеките трубку с прикрепленным мешочком из защитной пробирки, закройте мешочек, плотно завязав стерилизованную шелковую нить вокруг него чуть ниже конца стеклянной трубки, и отделите его от трубки, разрезав коллодий над лигатурой, после чего мешочек готов к введению в брюшную полость.

Б. Целлоидиновые мешочки (Харрис).

Необходимые материалы.

Стеклянная трубка типа «гусиное перо».

Желатиновые капсулы, такие как фармацевты готовят для выдачи объемных порошков.

Различные сорта целлоидина, густой и жидкий, в бутылках с широким горлышком.

1. Возьмите кусок стеклянной трубки длиной около 4 см и диаметром 5 мм; нагрейте один конец в пламени горелки Бунзена.

2. Проткните нагретым концом трубки один конец желатиновой капсулы и дайте остыть (рис. 185).

3. Удалите остатки желатина из просвета трубки нагретой платиновой иглой; смажьте соединение между капсулой и трубкой умеренно густым целлоидином и дайте высохнуть.

Fig. 185.—Making celloidin capsules.

4. Окуните капсулу в стакан с жидким целлоидином за пределы соединения со стеклом и после извлечения вращайте ее перед воздушной струей горелки, чтобы высушить равномерно. Повторяйте эти манипуляции до получения достаточно толстого покрытия.

5. Нанесите густой целлоидин на соединение трубки с капсулой, противоположный конец капсулы и линию соединения капсулы с ее крышкой; тщательно высушите.

6. С помощью пипетки с грушей наполните капсулу (через прикрепленную трубку) горячей водой и поставьте капсулу в стакан с кипящей водой на несколько минут, чтобы расплавить желатин.

7. Удалите раствор желатина изнутри целлоидинового футляра с помощью пипетки.

8. Наполните мешочек питательным бульоном и поместите его стеклянной трубкой вниз в пробирку, содержащую достаточно стерильного питательного бульона, чтобы покрыть мешочек на глубину 1 см. Закройте пробирку пробкой и стерилизуйте в паровом стерилизаторе обычным способом.

9. Чтобы подготовить мешочек к использованию, выньте его из пробирки с бульоном в стерильную стеклянную чашку.

10. Захватите трубку рядом с ее соединением с мешочком губками стерильного пинцета и с помощью пипетки с грушей удалите достаточное количество содержащегося бульона, чтобы оставить небольшое пространство в мешочке. Введите инокулят в виде эмульсии с помощью другой пипетки.

11. Продолжая удерживать трубку пинцетом, вытяните ее и запаяйте рядом с мешочком в пламени горелки.

12. После остывания промойте мешочек в стерильной воде, затем перенесите в пробирку с питательным бульоном и инкубируйте в течение ночи, чтобы определить его непроницаемость для бактерий.

13. Если бульон снаружи мешочка остается стерильным, введите мешочек в брюшную полость подопытного животного.

5. Внутричерепная. — (Анестезия, А. С. Э.)

Fig. 186.—Guarded trephine.

Трепаны и хирургический двигатель. — Самым полезным инструментом для внутричерепных операций на животных является малый носовой трепан (Кертиса), имеющий зубчатый режущий круг диаметром 7 мм. Добавление регулируемого защитного кольца, закрепляемого винтом, предотвращает случайное повреждение твердой мозговой оболочки или вещества мозга [13] (рис. 186). Этот размер подходит для обезьян, собак, кошек и крупных кроликов. Другие меньшие размеры, которые окажутся полезными для морских свинок и других мелких животных, режут круги диаметром 6 и 4 мм; для очень мелких животных — молодых морских свинок и крыс — небольшое стоматологическое сверло или винт сделают достаточно большое отверстие, чтобы ввести иглу шприца. Трепан можно установить в обычные металлические ручки и вращать вручную, но хирургический двигатель любого типа гораздо предпочтительнее с точки зрения быстроты и безопасности для животного. Электрический стоматологический двигатель Гая [14] (рис. 187), который можно подключить к патрону лампы или настенной розетке и который управляется ножным выключателем, хотя и недорогой, является чрезвычайно удовлетворительным.

Примечание. — Тонкое стоматологическое сверло, прикрепленное к стоматологическому двигателю, делает изготовление алюминиевых ручек для игл (см. стр. 71) довольно простым делом.

(а) Субдуральная.

1. Анестезируйте животное и зафиксируйте его на операционном столе, спиной вверх.

2. Побрейте часть кожи головы непосредственно перед ушами.

Fig. 187.—Guy's electrical dental engine.

3. Очертите острым скальпелем полулунный лоскут кожи, мышц и т. д., выпуклостью вперед, начиная в 0,5 см перед основанием одного уха и заканчивая в аналогичной точке перед другим ухом. Откиньте намеченный лоскут.

4. Сделайте соответствующий разрез через надкостницу и приподнимите ее тупым диссектором.

5. Малым трепаном (диаметром 6 мм) удалите круговой кусочек кости из теменного сегмента. Центр отверстия трепана должен находиться на пересечении срединной линии и линии, соединяющей задние углы глаз (рис. 188).

6. Введите инокулят с помощью подкожного шприца, проткнув иглой твердую мозговую оболочку и поместив материал непосредственно под эту оболочку, при этом стараясь не повредить синусы.

7. Откиньте лоскут кожи обратно и закрепите его на месте стальными зажимами Мишеля.

8. Наложите повязку из стерильной марли и ваты и запечатайте повязку коллодием.

9. Этикетка и т. д.

(б) Внутримозговая. — Эта инокуляция выполняется точно так же, как субдуральная, за исключением того, что в шаге 6 игла после протыкания твердой мозговой оболочки продвигается дальше в вещество того или иного полушария мозга перед тем, как содержимое будет введено.

Fig. 188.—Intracranial inoculation of rabbit. The circle
indicates the situation of the trephine hole.

6. Внутриглазная. —

(а) Жидкий инокулят. — (Анестезия, кокаин.)

1. Закапайте несколько капель стерильного раствора кокаина и повторите закапывание через две минуты.

2. Через пять минут попросите помощника крепко держать животное, как при внутривенной инъекции (см. рис. 189), при этом голова должна фиксироваться руками помощника.

3. Выберите две иглы, точно подходящие к одному и тому же шприцу, и стерилизуйте.

4. Присоедините одну иглу к шприцу, наберите необходимую дозу инокулята и снимите иглу.

5. Зафиксируйте глаз фиксационным пинцетом; затем проткните роговицу другой иглой шприца и дайте водянистой влаге вытечь через иглу.

6. Не вынимая иглу из роговицы, присоедините шприц и сделайте инъекцию в переднюю камеру.

7. Промойте конъюнктивальный мешок стерильным физиологическим раствором.

8. Этикетка и т. д.

(б) Твердый инокулят. — (Анестезия, А. С. Э.)

1. Анестезируйте животное и надежно зафиксируйте его на операционном столе.

2. Тщательно промойте конъюнктивальный мешок стерильным физиологическим раствором.

3. Сделайте разрез через верхний квадрант роговицы в переднюю камеру с помощью треугольного кератома.

4. Раздвиньте края раны роговицы гибким серебряным шпателем; захватите твердый инокулят пинцетом для радужки, введите его через рану роговицы и поместите на переднюю поверхность радужки; извлеките пинцет.

5. Снова промойте мешок и поверхность роговицы.

6. Снимите животное с операционного стола.

7. Этикетка и т. д.

7. Внутрилегочная. —

Жидкий инокулят. — (Анестезия не требуется.)

1. Попросите помощника крепко держать животное. (В этом случае передняя лапа выбранной стороны оттягивается помощником и удерживается вместе с ухом той же стороны.)

2. Тщательно побрейте в подмышечной линии и продезинфицируйте оголенную кожу.

3. Смело введите иглу шприца через пятое или шестое межреберье в ткань легкого.

4. Медленно введите содержимое шприца.

5. Этикетка и т. д.

8. Внутривенная. —

Жидкий инокулят. — (Анестезия не требуется.)

Местом, выбранным для инъекции у кролика, является задняя ушная вена (см. рис. 192). Хотя она меньше срединной вены, она плотно прикреплена к хрящу уха плотной соединительной тканью и поэтому более доступна. (У морской свинки необходимо использовать яремную вену, и для успешного выполнения инокуляции животному необходимо дать общую анестезию. У обезьяны или собаки наиболее удобной является большая подкожная вена ноги, и перед проколом ее следует раздуть или сделать заметной, сжав вену выше выбранного места.)

Подготовка инокулята. — При подготовке инокулята необходимо соблюдать осторожность, так как инъекция даже небольших фрагментов может вызвать смертельную эмболию. Чтобы избежать этого риска, жидкость следует, по возможности, отфильтровать через стерильную фильтровальную бумагу перед наполнением шприца.

Пузырьки воздуха при введении в вену часто вызывают немедленную смерть. Чтобы предотвратить это, шприц после наполнения следует держать в вертикальном положении, иглой вверх. Затем на иглу надевается кусочек стерильной фильтровальной бумаги, и поршень шприца нажимается вверх, пока весь воздух не будет вытеснен из цилиндра и иглы. Если при этом выдавятся капли инокулята, они попадут на фильтровальную бумагу, которую следует немедленно сжечь.

1. Попросите помощника крепко держать животное. Выбранное ухо захватывается за основание и вытягивается вперед к оператору.

2. Побрейте задний край тыльной стороны уха.

3. Продезинфицируйте кожу над веной, энергично протирая ее ватным тампоном, смоченным в лизоле. Трение сделает вену более заметной. Смойте лизол эфиром и дайте последнему испариться.

4. Попросите помощника сжать вену у основания уха. Это заставит ее периферическую часть набухнуть и увеличиться в калибре.

5. Держите шприц, как ручку, и проткните кончиком иглы кожу и стенку вены, пока она не войдет в просвет вены (рис. 189). Теперь продвигайте ее вперед в направлении кровотока — т. е. к телу животного.

6. Попросите помощника прекратить сжатие основания уха и медленно введите инокулят. (Если жидкость нагнетается в подкожную клетчатку, что сразу же проявляется припухлостью, инъекцию необходимо прекратить и сделать еще одну попытку в месте ближе к основанию уха или в какой-либо точке на соответствующей вене на противоположном ухе.)

7. Извлеките иглу и прижмите ватный тампон к месту прокола, чтобы обеспечить закрытие отверстия в стенке вены.

8. Этикетка и т. д.

Fig. 189.—Intravenous inoculation.

9. Ингаляционная. —

(а) Жидкий инокулят. — (Анестезия не требуется.)

1. Поместите животное в закрытый металлический ящик.

2. Через отверстие в одной из сторон введите сопло простого распылительного аппарата, такого как используется для назальных лекарственных средств.

3. Наполните резервуар инструмента (предварительно стерилизованного) жидким инокулятом и, присоединив мехи, распылите инокулят внутрь ящика.

4. По завершении распыления откройте ящик, тщательно опрыскайте животное 10-процентным раствором формальдегида (чтобы уничтожить любой вирус, который может прилипнуть к меху или перьям).

5. Перенесите животное в клетку.

6. Этикетка и т. д.

7. Тщательно продезинфицируйте ингаляционную камеру.

(б) Жидкий или порошкообразный инокулят. — Анестезия, А. С. Э.

1. Дайте животному наркоз и надежно зафиксируйте его на операционном столе.

Fig. 190.—Gag for rabbits.

2. Раскройте рот с помощью какого-либо роторасширителя; захватите язык пинцетом и вытяните его вперед.

Наиболее удобная форма роторасширителя для кролика или кошки показана на рис. 190. Это просто полоска твердого дерева, имеющая форму в средней части и снабженная квадратным отверстием, через которое можно провести трахеальную или пищеводную трубку.

3. Введите предварительно стерилизованную стеклянную трубку (длиной 17 см, диаметром 0,5 см, с слегка изогнутым на 2 см концом) через гортань в трахею.

4. Соедините прямую часть Y-образной трубки с верхним концом стерилизованной трубки, а один из отводов Y-образной трубки подсоедините к делительной воронке, содержащей жидкий инокулят, или к инсуффлятору, содержащему порошкообразный инокулят, а другой — к ручным мехам.

5. Дайте жидкому инокуляту стечь в легкие под действием силы тяжести или вдуйте порошкообразный инокулят с помощью резиновой груши-мехов.

6. Извлеките интратрахеальную трубку; освободите животное от фиксации на столе.

7. Наклейте этикетку и т. д.

В качестве альтернативного метода для довольно крупных животных, таких как кролики и т. д., можно использовать стерильную стеклянную трубку подходящего диаметра, которую проводят через гортань вниз по трахее почти до ее бифуркации. Жидкие культуры можно затем буквально вливать в легкие, или же высушенные и измельченные в порошок культуры можно вдувать в легкие с помощью небольших ручных мехов или даже пипетки с резиновым баллоном.

10. Интрагастральная инокуляция. — Жидкий или полужидкий инокулят. (Наркоз не требуется.)

Метод выполнения операции несколько варьируется в зависимости от размера подопытного животного.

А. Обезьяна, кролик, морская свинка.

1. Зафиксируйте животное на операционном столе брюшной поверхностью вверх.

2. Раскройте рот с помощью роторасширителя; вытяните язык вперед с помощью пинцета.

3. Стерилизуйте мягкий резиновый катетер (№ 10 или 8 по английской шкале, или № 18 или 15 по французской) и смажьте его стерильным глицерином.

4. Проведите его к задней стенке глотки, удерживая конец по средней линии.

5. Осторожно продвигайте катетер по пищеводу, пока он не пройдет через кардиальное отверстие желудка. Не применяйте никакой силы.

6. Наберите необходимую дозу инокулята в стерилизованную пипетку. Вставьте кончик пипетки в открытый конец катетера и дайте жидкости стечь в желудок. Извлеките пипетку и опустите ее в сосуд с лизолом.

7. С помощью другой стерильной пипетки пропустите один кубический сантиметр стерильного физиологического раствора через катетер, чтобы вымыть последние следы инокулята.

8. Извлеките катетер.

9. Наклейте этикетку и т. д.

B. Крысы и мыши (метод Марка).

1. Зафиксируйте животное в вертикальном положении.

(а) Крыса. — Возьмите пару зажимных пинцетов длиной около 22 см и захватите животное за свободную кожу головы как можно дальше вперед — зафиксируйте пинцет и, удерживая инструмент вертикально вверх, передайте его в левую руку ассистента, который фиксирует хвост животного между пальцами, сжимающими рукоятку пинцета. (См. рис. 191.)

Fig. 191.—Intragastric inoculation of rat.

(б) Мышь. — Ассистент захватывает свободную кожу между ушами как можно дальше вперед между указательным и большим пальцами левой руки. Затем он берет хвост правой рукой, выпрямляет мышь, пропускает хвост между безымянным пальцем и мизинцем левой руки и фиксирует его там.

2. Ассистент берет закрытый пинцет с тонкими браншами в правую руку, вводит концы в рот животного, а затем позволяет браншам разойтись. Это открывает челюсть животного и служит роторасширителем.

3. Смочите стерилизованную пищеводную трубку стерильной водой. (Эта трубка изготовлена из шелковой резины, длиной 6,5 см, с закругленным дистальным концом; проксимальный конец закреплен в головке иглы для шприца, которая подходит к наконечникам двух используемых стерильных шприцев.)

4. Возьмите трубку примерно за середину и введите ее в рот животного, направляя вниз и немного в одну или другую сторону, пока вся ее длина не окажется в пищеварительном тракте и во рту. Достаточно лишь легкого направления. Не применяйте никакой силы.

5. Наберите необходимую дозу инокулята в шприц; вставьте наконечник шприца в иглодержатель и надавите на поршень.

6. Удерживая иглодержатель левой рукой, отсоедините шприц.

7. Наберите немного стерильной воды во второй (стерильный) шприц и, вставив его наконечник в иглодержатель, введите несколько капель воды через трубку, чтобы промыть ее.

8. Одним быстрым движением вверх извлеките трубку изо рта животного.

9. Наклейте этикетку и т. д.

Остается описать еще один метод инокуляции, который не требует оперативного вмешательства.

11. Кормление. —

1. Жидкий инокулят. — Небольшие кусочки стерилизованного хлеба или размоченного хлеба (стерилизованного в паровом стерилизаторе при 100° C) пропитывают жидким инокулятом и предлагают животным в стерильной чашке Петри или капсуле.

2. Твердый инокулят. — Небольшие кусочки ткани помещают в стерильные сосуды и предлагают животным.

СНОСКИ:

[12] Этот стол изготовлен фирмой Down Bros., Сент-Томас-стрит, Лондон, S. E.

[13] Эта модификация изготовлена для автора фирмой Down Bros., Сент-Томас-стрит, Лондон, S. E.

[14] Произведено фирмой Francis Lepper, 56, Грейт-Мальборо-стрит, Лондон, W.

XVIII. ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ ПРИ ЖИЗНИ.

Наличие патогенных свойств у изучаемого организма проявляется «инфекцией» подопытного животного — термин, используемый для обобщения состояния, возникающего в результате успешного проникновения инокулированных микроорганизмов в ткани подопытного животного и их размножения в них. Считается, что инфекция произошла:

1. Когда смерть животного наступает как прямое следствие инокуляции.

2. Когда инокуляция, не обязательно приводя к смерти, вызывает местные или общие изменения патологического характера.

3. Когда, независимо от того, наступила смерть или произошли местные или общие изменения, в жидкостях организма появляются определенные вещества, которые, как можно доказать (in vitro или in vivo), оказывают глубокое и специфическое воздействие при контакте с субкультурами первоначально инокулированного организма.

Важными факторами в развитии инфекции являются:

А. Семена. Вирулентность организма. Доза организма. B. Почва. Устойчивость, оказываемая клетками подопытного животного.

Первые два фактора, хотя и являются переменными, в определенной степени находятся под контролем экспериментатора. Таким образом, с помощью соответствующих средств вирулентность организма может быть усилена или ослаблена, в то время как размер дозы может быть увеличен или уменьшен. Третий фактор также варьируется не только у разных видов животных, но и у разных особей одного и того же вида. Основные причины этого различия не столь очевидны, поэтому, помимо отбора животных, предназначенных для аналогичных экспериментов, с учетом таких моментов, как возраст, размер или пол, мало что можно сделать для стандартизации клеточной резистентности.

Сразу после инокуляции животного должен начаться период клинического наблюдения, который должен заканчиваться только смертью животного. Общие наблюдения сначала, если инфекция острая, следует проводить ежедневно — позже, если животное кажется незатронутым или если инфекция хроническая, как общие, так и специальные наблюдения следует проводить с недельными интервалами. Если животное по-прежнему кажется незатронутым, его следует умертвить парами хлороформа по истечении двух или трех месяцев и провести полное вскрытие.

А. Общие наблюдения должны учитывать:

1. Общий вид. Подопытное животное следует осматривать ежедневно не только с целью выявления симптомов, вызванных экспериментальной инфекцией, но и для того, чтобы предотвратить пропуск любой интеркуррентной инфекции, приобретенной естественным путем (см. стр. 337).

2. Вес инокулированного животного следует наблюдать и записывать каждый день в течение курса экспериментальной инфекции в точно одно и то же время, предпочтительно непосредственно перед утренним кормлением.

3. Температуру следует аналогичным образом записывать ежедневно, если не чаще, в течение всего периода наблюдения за животным и тщательно наносить на график — индивидуальные вариации сразу станут очевидными. Следует иметь в виду, что температура, считающаяся нормальной для человека (37,5° C), не является нормальной средней температурой ни для одного из низших животных, кроме крысы и мыши. Прилагаемая таблица нормальных средних значений для животных, обычно используемых в бактериологических исследованиях, может быть полезна для предотвращения ошибочного предположения о наличии пирексии у животного, которое просто демонстрирует свою собственную нормальную температуру.

 NORMAL AVERAGES.
  Rectal Temp. °C. Pulse. Respirations.
 Animal.  Rate per minute.
Frog 8.9-17.2 80 12
Mouse 37.4 120 ...
Rat 37.5 ... 210
Guinea pig 38.6 150 80
Rabbit 38.7 135 55
Cat 38.7 130 24
Dog 38.6 95 15
Goat 40.0 75 16
Ox 38.8 45 ..
Horse 37.9 38 11
Monkey (Rhesus) 38.4 100 19
Pigeon 40.9 136 30
Fowl 41.6 140 12

B. Специальные наблюдения включают некоторые или все из нижеперечисленных, в зависимости от метода инокуляции и характера вируса.

1. Место инокуляции следует тщательно осматривать не реже одного раза в неделю, а соседние лимфатические узлы пальпировать.

2. Любая местная реакция в месте инокуляции и любое другое легкодоступное поражение должны быть тщательно исследованы. Любой гнойный процесс, который может возникнуть, будь то в подкожных тканях или в суставах, должен быть исследован, а гной тщательно изучен как микроскопически, так и культурально.

Жидкие секреты и экскреты, такие как гной или серозные экссудаты, когда они доступны, собирают непосредственно из организма в стерильные капиллярные пипетки (см. рис. 13 а) следующим образом:

1. Откройте футляр с пипетками, возьмите одну за конец с ватной пробкой, извлеките ее из футляра и закройте футляр крышкой.

2. Прикрепите резиновый баллон (см. стр. 10) к концу пипетки с ватной пробкой и используйте баллон в качестве ручки пипетки.

3. Проведите пипетку по всей длине два или три раза через пламя горелки Бунзена.

4. Отломите запаянный конец пипетки стерильным пинцетом.

5. Сожмите резиновый баллон, введите кончик пипетки в секрет; затем ослабьте давление на баллон и дайте пипетке наполниться.

6. Извлеките кончик пипетки из секрета, дайте жидкости немного подняться по капиллярному стеблю и запаяйте кончик пипетки в пламени. (Если используется пипетка с сужением ниже конца с ватной пробкой (рис. 13 b), эту часть пипетки также можно запаять в пламени.)

Когда все будет готово к исследованию патологического материала, отломите запаянный конец пипетки стерильным пинцетом и вылейте содержимое пипетки в стерильную капсулу. Материал теперь можно использовать для приготовления мазков, посевов и экспериментов по инокуляции.

3. Периферическую кровь следует время от времени исследовать, так как именно из этой ткани часто получают наиболее полную информацию о течении и прогрессировании инфекции.

а. Гистологическое исследование крови должно быть направлено главным образом на наблюдения за количеством и типом белых кровяных телец; и поскольку лишь немногие бактериологи являются одновременно экспертами в сравнительной гематологии, для справки приведены некоторые заметки о нормальных характеристиках крови обычных лабораторных животных в сравнении с кровью человека. Они были любезно составлены для меня моим другом и бывшим коллегой д-ром Сесилом Прайсом Джонсом.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ГЕМОЦИТОЛОГИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ.

  Totals Percentages
AnimalRed cellsWhite cells Hb, per cent.Lymphocytes, per cent.Large monos, per cent.Polymorph, per cent.Eosinoph, per cent. Mast cells, per cent.
Frog 490,000 8,000 58 40 10.0 22.015 13
Mouse 8,700,000 8,000 78 60 21.5 17.0 1.4 0.1
Rat 9,000,000 9,000 85 54 7.0 37.5 1.3 0.2
Guinea-pig 5,700,00010,000 99 55 9.0 32.8 3.0 0.2
Rabbit 6,000,000 7,000 70 50 2.0 46.0 0.6 1.4
Rhesus 4,500,00013,000 77 43 5.0 50.0 1.3 0.7
Goat14,600,00015,000 58 35 6.3 56.7 1.25 0.75
Fowl 3,500,00030,000 100 49 3.0 42.0 1.0 5.0
Pigeon 3,500,00020,000 101 43 9.0 43.0 3.0 2.0
Man(adult) Normal limits. 5,000,000 (4.5-5) millions. 7,500 (7-9) thousands. 100 (95-101) 25 (20-30) 5.5 (4-8) 65 (55-68) 4.0 (3-5) 0.5 (0.5-2)

Приведенная выше таблица представляет в каждом случае среднее значение большого количества подсчетов.

Примечания.

Лягушка. — Красные кровяные тельца представляют собой крупные овальные ядерные диски (20-25 мкм на 12-15 мкм), ядро относительно небольшое и неправильно удлиненное или овальное, около 10 мкм в длину. Обычно наблюдается много примитивных и развивающихся форм, а также свободные ядра и много клеток на различных стадиях дегенерации. Оценка гемоглобина затруднена из-за мутности крови после разбавления водой. Полиморфноядерные лейкоциты — это крупные клетки, около 20 мкм; никаких определенных гранул не наблюдается. Эозинофильные клетки содержат крупные, глубоко окрашивающиеся гранулы кокковидной формы.

Мышь. — Гранулы полиморфноядерных лейкоцитов обычно не окрашиваются или окрашиваются очень слабо. Ядро эозинофильной клетки имеет кольцевидную форму или сильно разделено, а гранулы кокковидные и окрашиваются оксифильно. Примечательной особенностью крови является высокий процент крупных мононуклеарных клеток.

Крыса. — Мелкие палочковидные гранулы полиморфноядерных лейкоцитов обычно окрашиваются очень слабо. Гранулы эозинофильных клеток хорошо окрашиваются и имеют кокковидную форму, ядро часто кольцевидное. Базофильных зернистых клеток немного, но гранулы крупные и глубоко окрашиваются базофильно.

Морская свинка. — Очень часто наблюдаются полихромазия и точечная базофилия красных кровяных телец; также часто встречаются ядерные красные кровяные тельца. Крупные мононуклеарные клетки часто содержат вакуоли — «клетки Курлова» — возможно, паразитарной природы.

Кролик. — Нередко можно обнаружить ядерные красные кровяные тельца в мазках от совершенно здоровых животных. Гранулы полиморфноядерных лейкоцитов окрашиваются оксифильно. Крупные гранулы эозинофильных клеток, по-видимому, окрашиваются менее интенсивно оксифильно, вероятно, из-за базофильного окрашивания цитоплазмы.

Макака-резус. — Клетки крови напоминают те, что встречаются в крови человека. Мелкие нейтрофильные гранулы полиморфноядерных лейкоцитов часто очень скудны, а иногда, по-видимому, отсутствуют. Эозинофильные клетки не так плотно заполнены крупными оксифильными гранулами, как у человека, и ядра этих клеток обычно сильно разделены или полиморфны.

Коза. — Красные кровяные тельца представляют собой мелкие безъядерные диски диаметром всего около 4,5 мкм, что составляет не более половины диаметра красного кровяного тельца человека. Полиморфноядерные лейкоциты имеют лишь несколько очень мелких кокковидных оксифильных гранул, ядро полиморфное. Эозинофильные клетки — это крупные клетки до 20 мкм, цитоплазма базофильна и содержит крупные кокковидные оксифильные гранулы, а ядро часто сильно разделено.

Домашняя птица. — Красные кровяные тельца представляют собой овальные ядерные диски размером около 12 мкм на 6 мкм, ядро относительно небольшое (около 4 мкм в длину), неправильно удлиненное или овальное; часто присутствуют круглые, более глубоко окрашенные клетки с круглыми или диффузными ядрами, а также свободные ядра и дегенерировавшие формы красных кровяных телец. Гранулы клеток, соответствующих полиморфноядерным лейкоцитам, палочковидные, часто четкообразные или с булавовидными концами. Ядро не полиморфное, а обычно разделено на две части, хотя может быть и одиночным. Клетки, вероятно, соответствующие эозинофильным лейкоцитам, имеют мелкие кокковидные гранулы, слабо окрашивающиеся эозинофильно или нейтрофильно. Базофильные гранулы «тучных» клеток кокковидные, различного размера — часто совсем порошкообразные.

Голубь. — Красные кровяные тельца напоминают таковые у домашней птицы, и можно отметить аналогичные разновидности внешнего вида. Гранулы тех клеток, которые соответствуют полиморфноядерным лейкоцитам, палочковидные, но меньше и тоньше, чем у домашней птицы, и не имеют булавовидного вида. Ядро не полиморфное и лишь изредка разделено. Кокковидные гранулы эозинофильных клеток окрашиваются более глубоко оксифильно, чем таковые у соответствующих клеток домашней птицы.

Приготовление сухих мазков для этого гистологического исследования крови проводится следующим образом:

1. Небольшие образцы крови для приготовления мазков крови наиболее удобно получать из вен уха у большинства обычных лабораторных животных, а именно: обезьяны, козы, собаки, кошки, кролика, морской свинки; у голубя и домашней птицы следует пунктировать подмышечную вену; у крысы и мыши — либо вену в ухе, либо, предпочтительно, путем ранения кончика хвоста; у лягушки следует выбирать перепонку стопы.

2. Пунктируйте выбранную вену острой иглой. Для этой цели наиболее полезна плоская игла Хагедорна (размер № 8) с режущим краем. Если вену не удается расширить путем проксимального сдавления, желаемый эффект может дать энергичное трение кусочком сухой ветоши — или можно приложить к вене пробирку с водой при температуре около 40°C. Если эти методы не помогают, можно капнуть каплю или две ксилола на кожу прямо над веной, оставить на несколько секунд, а затем вытереть кусочком сухой ветоши.

3. Один из коротких концов предметного стекла 3 на 1 дюйм приводится в контакт с выступающей каплей крови, так чтобы он набрал небольшую каплю.

4. Затем предметное стекло опускают поперечно на поверхность второго стекла 3 на 1 дюйм, которое лежит на столе около одного конца под углом около 45°, и удерживают в этом положении в течение нескольких секунд, пока капля крови распределяется по всей линии контакта (см. также рис. 69).

5. Проведите первое стекло твердо и равномерно по всей длине нижнего стекла, оставляя тонкий регулярный мазок, который, вероятно, покажет клетки крови толщиной только в один слой.

6. Дайте мазку высохнуть на воздухе.

7. Окрасьте одним из полихромных красителей для крови (см. стр. 97).

8. Исследуйте под микроскопом.

b. Бактериологическое исследование крови направлено исключительно на демонстрацию присутствия в циркулирующей крови организмов, ранее введенных животному. Для этой цели следует взять несколько кубических сантиметров крови цельностеклянным шприцем из доступной вены, соответствующей одной из тех, что предложены в качестве места внутривенной инокуляции, — и при соблюдении аналогичных асептических мер предосторожности.

1. Стерилизуйте цельностеклянный шприц подходящего размера, и когда он остынет, наберите в шприц немного стерильного раствора цитрата натрия и смочите всю внутреннюю поверхность цилиндра; затем удалите весь раствор цитрата, если необходимо взять менее 5 куб. см крови; если требуется более 5 куб. см, оставьте около половины кубического сантиметра жидкости в шприце. Это предотвращает свертывание крови.

Раствор цитрата натрия готовят путем растворения:

Sodium citrate10 gramme.
Sodium chloride0.75 grammes.
In distilled water100 c.c.

Стерилизуйте кипячением.

2. Подготовьте животное, как для внутривенной инокуляции (см. стр. 363), и введите иглу шприца в просвет выбранной вены.

3. Медленно оттяните поршень шприца. Когда будет собрано достаточное количество крови, дайте ассистенту команду ослабить проксимальное сдавление вены; и извлеките иглу.

4. Снимите иглу с наконечника шприца и перенесите цитратную кровь в небольшую колбу Эрленмейера, содержащую около 250 куб. см питательного бульона.

5. Наклейте этикетку, инкубируйте и исследуйте ежедневно до появления роста или до истечения десяти дней.

c. Серологическое исследование крови направлено на демонстрацию присутствия определенных специфических антител в сыворотках экспериментально инфицированных животных и, в определенных пределах, на оценку их количества.

Основными из этих тел являются:

Antitoxin.

Agglutinin.

Precipitin.

Opsonin.

Immune body or Bacteriolysin.

Ни одно из этих веществ не может быть выделено в чистом виде отдельно от сыворотки крови, следовательно, были разработаны специальные методы, позволяющие их распознать. В каждом случае поведение сыворотки подопытного животного, которую можно назвать «специфической» сывороткой, изучается в сравнении с поведением сыворотки от неинокулированного животного того же вида, которая называется «нормальной» сывороткой. Ввиду незначительных различий в составе, проявляемых сывороткой различных особей одной и той же серии, обычно используют смесь сывороток, полученных от нескольких разных нормальных животных того же вида, что и инокулированное животное, под термином «пулированная сыворотка». Метод сбора крови (например, у кролика) для серологических тестов следующий:

Сбор сыворотки.

Необходимая аппаратура:

Razor.

Liquid soap.

Cotton-wool.

Lysol 2 per cent. solution, in drop bottle.

Ether in drop bottle.

Flat Hagedorn needles.

Blood pipettes (Fig. 16, page 12).

Centrifugal machine.

Centrifuge tubes.

Glass cutting knife.

Bunsen flame.

Writing diamond or grease pencil.

Метод.

1. Сбрейте шерсть на дорсальной поверхности уха по ходу задней ушной вены (см. рис. 192).

2. Стерилизуйте кожу, промыв ее лизолом.

Лизол следует наносить стерильной ватой, а ухо энергично растирать, не только чтобы удалить поверхностные чешуйки эпителия, но и чтобы вызвать гиперемию уха и сделать вену заметной.

3. Удалите лизол эфиром, капнутым из капельницы, и дайте эфиру испариться.

4. Пунктируйте вену стерильной иглой Хагедорна.

5. Возьмите небольшую пипетку для сбора крови (рис. 161) и держите ее под углом к уху, одним концом касаясь выступающей капли крови, а другой конец опустив вниз.

Кровь теперь будет поступать в пипетку сначала за счет капиллярности; позже в игру вступит и сила тяжести, и пипетку можно будет без труда заполнить на две трети.

6. Держите трубку за конец, содержащий кровь, чистым концом, направленным косо вверх — прогрейте этот конец в пламени горелки Бунзена, чтобы вытеснить часть содержащегося воздуха; затем запаяйте чистый кончик в пламени.

Fig. 192.—Collecting blood from rabbit.

7. Положите пипетку на холодную поверхность (например, предметное стекло). Быстрое охлаждение воздуха в чистом конце пипетки создает отрицательное давление, и кровь засасывается обратно в пипетку, оставляя загрязненный конец свободным от крови. Запаяйте этот конец в пламени горелки Бунзена.

8. Отметьте отличительное название образца (например, номер животного) на пипетке с помощью алмазного карандаша или воскового карандаша.

9. Когда запаянные концы остынут и кровь свернется, поместите пипетку в центрифугу чистым концом вниз; уравновесьте и тщательно отцентрифугируйте. При извлечении пипетки из центрифуги красные кровяные тельца будут собраны в плотную массу на одном конце, а над ними появится прозрачная сыворотка.

10. Отметив пипетку для крови выше уровня сыворотки ножом для резки стекла и отломив трубку в этой точке, сыворотка крови становится легкодоступной для целей тестирования.

Если требуется большее количество крови, животное после пункции вены следует перевернуть, ассистент должен держать его за ноги. Кровь объемом в несколько кубических сантиметров теперь будет капать из пунктированной вены, и ее следует собирать в сужающуюся центрифужную пробирку, пробирку перенести в инкубатор при 37° C на два часа, затем поместить в центробежную машину, уравновесить и тщательно отцентрифугировать. Три наиболее важных из упомянутых антител, которые можно продемонстрировать с определенной легкостью, — это агглютинин, опсонин и бактериолизин; и методы тестирования на эти тела будут рассмотрены далее.

АГГЛЮТИНИН.

Агглютинин — это название, данное веществу, присутствующему в сыворотке крови животного, которое успешно сопротивлялось инокуляции определенным микроорганизмом. Это вещество обладает способностью собирать вместе в комки и массы, или агглютинировать, водные суспензии этого конкретного микроба.

Разведение специфической сыворотки:

Необходимая аппаратура:

Sterile graduated capillary pipettes to contain 10 c. mm. (Fig. 17).
Sterile graduated capillary pipettes to contain 90 c. mm. (Fig. 17).
Small sterile test-tubes 5 × 0.5 cm.
Normal saline solution in flask or test-tube.
Pipette of specific serum.
Glass cutting knife, or three-square file.
Glass capsule, nearly full of dry silver sand, or roll of plasticine.
Grease pencil.

Метод. —

1. Take three sterile test-tubes and number them 1, 2 and 3.

2. Пипеткой внесите 0,9 куб. см стерильного нормального физиологического раствора в каждую пробирку и поставьте пробирки вертикально в песок в капсуле или в пластилиновый блок.

3. Сделайте царапину ножом для резки стекла на пипетке для крови выше верхнего уровня прозрачной сыворотки, отломите и выбросьте пустую часть трубки.

4. Возьмите 0,1 куб. см сыворотки из трубки пипетки для крови и тщательно смешайте ее с жидкостью в пробирке № 1; и наклейте этикетку s.s. (специфическая сыворотка), 10 процентов.

5. Возьмите 0,1 куб. см раствора из пробирки № 1 с помощью свежей пипетки и смешайте его с содержимым пробирки № 2; и наклейте этикетку s.s., 1 процент.

6. Возьмите 0,1 куб. см раствора из пробирки № 2 с помощью свежей пипетки и смешайте его с содержимым пробирки № 3; и наклейте этикетку s.s., 0,1 процента.

Когда выход сыворотки из собранного или имеющегося образца крови невелик, вышеуказанный метод разведения непрактичен, и разведение следует проводить по методу Райта в капиллярной пипетке с резиновым баллоном.

Разведение сыворотки с помощью пипетки с резиновым баллоном.

Необходимые материалы:

Blood pipette containing sample of specific serum after centrifugalisation.

Capsule of diluting fluid—normal saline solution.

Supply of Pasteur pipettes (Fig. 13a).

India-rubber teats.

Small test-tubes.

A block of plasticine to act as a test-tube stand.

Grease pencil.

Метод:

1. Отметьте три небольшие пробирки как 10 процентов, 1 процент и 0,1 процента соответственно и поставьте их вертикально в пластилиновый блок.

2. Возьмите пипетку Пастера, надпилите капиллярный стебель чуть выше запаянного конца ножом для резки стекла и отломите запаянный конец быстрым движением так, чтобы излом был чистым и под прямым углом к длинной оси капиллярного стебля — фактически «квадратным» срезом. Подготовьте несколько, скажем, дюжину, таким образом.

3. Наденьте резиновый баллон на цилиндр каждой из пипеток.

4. Сделайте отметку восковым карандашом на стебле одной из пипеток на расстоянии около 2 или 3 см от открытого конца.

Fig. 193.—Filling the capillary teat pipette.

5. Сожмите баллон между пальцами (рис. 193) настолько, чтобы вытеснить большую часть содержащегося воздуха.

6. Поддерживая давление на баллон, пропустите стебель пипетки в капсулу с физиологическим раствором, пока открытый конец пипетки не окажется ниже уровня жидкости.

7. Теперь осторожно ослабьте давление на баллон и дайте жидкости войти в пипетку и подняться по стеблю до уровня отметки восковым карандашом. Как только эта точка будет достигнута, зафиксируйте движение столбика жидкости, поддерживая давление на баллон, не ослабляя и не увеличивая его.

8. Извлеките кончик пипетки из жидкости и снова очень слегка ослабьте давление на баллон. Столбик физиологического раствора поднимется выше по стеблю, и теперь в пипетку войдет столбик воздуха, который послужит индексом для отделения первого объема жидкости, набранного в стебель, от следующего за ним.

9. Снова введите конец пипетки в жидкость и наберите второй объем физиологического раствора до уровня отметки восковым карандашом, и следуйте за этим вторым воздушным индексом.

10. Таким же образом наберите еще семь равных объемов физиологического раствора и следующие за ними пузырьки воздуха. Теперь в пипетке девять равных объемов нормального физиологического раствора.

11. Теперь пропустите кончик пипетки в пробирку с кровью и окуните открытый конец ниже поверхности сыворотки. Действуя как прежде, аспирируйте объем сыворотки в капиллярный стебель до уровня отметки карандашом.

12. Вылейте содержимое пипетки в небольшую пробирку, отмеченную как 10 процентов, сжимая резиновый баллон между большим и указательным пальцами.

13. Очень тщательно смешайте один объем сыворотки с девятью объемами физиологического раствора, многократно набирая всю жидкость в пипетку и снова выливая ее в пробирку.

14. Now take a clean pipette and proceed precisely as before, 4 to 10.

15. Набрав девять равных объемов физиологического раствора во вторую пипетку, теперь наберите один аналогичный объем жидкости из «10-процентной пробирки».

16. Вылейте содержимое этой пипетки во вторую пробирку, отмеченную как 1 процент, и тщательно перемешайте, как прежде.

17. Аналогичным образом приготовьте 0,1-процентный раствор и перенесите в третью пробирку.

18. Дальнейшие разведения в кратных десяти можно приготовить таким же образом, и, варьируя количество объемов разбавляющей жидкости или сыворотки, можно сделать любое необходимое разведение (см. Приложение, Таблицы разведений).

Примечание. — Разбавляющую физиологическую жидкость всегда следует набирать в пипетку первой, иначе, если сыворотка содержит очень большое количество агглютинина, следы этой сыворотки, добавленные к физиологическому раствору, могут быть достаточными, чтобы полностью исказить последующие наблюдения — в то время как если из одного и того же физиологического раствора разбавляется более одного образца сыворотки, в эксперименты могут быть внесены серьезные ошибки.

Микроскопическая реакция:

Необходимая аппаратура:

Пять предметных стекол для висячей капли (или, предпочтительно, два стекла), с двумя ячейками, установленными бок о бок на каждом (рис. 62, a), и одно стекло только с одной ячейкой.

Вазелин.

Покровные стекла.

Платиновая петля.

Восковой карандаш.

Восемнадцати-двадцатичетырехчасовая бульонная культура тестируемого организма (например, Bacillus typhi abdominalis).

Конец пипетки с остатком специфической сыворотки, отмеченный s.s.

Пробирки, содержащие три раствора специфической сыворотки, 10, 1 и 0,1 процента соответственно.

Конец пипетки с пулированной нормальной сывороткой, отмеченный p.s.

Метод. —

1. Приготовьте пять препаратов висячей капли, таким образом:

(a) Одна петля бульонной культуры + одна петля пулированной сыворотки; наклейте этикетку «Контроль».

(b) Одна петля культуры + одна петля неразведенной специфической сыворотки; наклейте этикетку 50 процентов.

Установите эти два покровных стекла на двухъячеечное предметное стекло.

(c) Одна петля бульонной культуры + одна петля 10-процентной сыворотки; наклейте этикетку 5 процентов.

Установите это на одноячеечное предметное стекло.

(d) Одна петля бульонной культуры + одна петля 1-процентной сыворотки; наклейте этикетку 0,5 процента.

(e) Одна петля бульонной культуры + одна петля 0,1-процентной сыворотки; наклейте этикетку 0,05 процента.

Установите эти два покровных стекла на двухъячеечное предметное стекло.

2. Запишите время: Исследуйте контроль, чтобы убедиться, что бациллы подвижны и равномерно распределены по полю — не собраны в массы.

3. Затем исследуйте препарат с 50-процентной сывороткой.

Если агглютинин присутствует и тест дает положительную реакцию, бациллы будут собраны в крупные комки.

Если тест дает отрицательную реакцию, бациллы могут быть собраны в крупные комки из-за вязкости концентрированной сыворотки.

4. Исследуйте 5-процентный препарат микроскопически.

Если бациллы агрегированы в комки, положительная реакция.

Если бациллы не агрегированы в комки, наблюдайте до тридцати минут с момента приготовления, прежде чем записывать отрицательную реакцию.

5. Исследуйте препараты 0,5 и 0,05 процента.

Они могут показывать или не показывать агглютинацию, когда результат исследования 5-процентного препарата положителен, в зависимости от активности специфической сыворотки; и путем исследования серии разведений можно получить количественное сравнение валентности специфических сывороток из разных источников или сыворотки от одного и того же животного в разные периоды в течение курса активной иммунизации.

Примечание. — Градуированные пипетки, поставляемые с гематоцитометром Тома (предназначенные для сбора образца крови, необходимого для подсчета лейкоцитов), дающие разведение 1 к 10 — т. е. 10 процентов — могут быть заменены на вышеупомянутые градуированные капиллярные пипетки, если сосуд, в котором была отделена сыворотка, имеет достаточно большой диаметр, чтобы позволить их использование.

Макроскопическая реакция:

Стерильные градуированные капиллярные пипетки вместимостью 90 куб. мм.

Восемнадцати-двадцатичетырехчасовая бульонная культура тестируемого организма.

Три пробирки, содержащие 10-, 1- и 0,1-процентные растворы специфической сыворотки (остается около 90 куб. мм в каждой).

Пробирка, содержащая 50-процентный раствор пулированной сыворотки.

Пипетки для седиментации (см. стр. 17) или пипетки с резиновым баллоном.

Метод.

1. Внесите пипеткой 90 куб. мм бульонной культуры в каждую из пробирок, содержащих разведенную сыворотку; и такое же количество в пробирку, содержащую пулированную сыворотку.

2. Заполните седиментационную трубку (путем аспирации) или пипетку с баллоном содержимым каждой пробирки. Запаяйте нижние концы седиментационных трубок в пламени горелки Бунзена.

3. Наклейте на каждую трубку этикетку с указанием разведения сыворотки, которое она содержит — а именно: 5, 0,5 и 0,05 процента.

4. Поместите пипетки в вертикальном положении в стакан в инкубатор при 37°C на один или два часа.

5. Наблюдайте зернистый осадок, который выпадает при положительной реакции, и равномерную мутность при отрицательной реакции по сравнению с внешним видом в контрольной пулированной сыворотке.

ОПСОНИН.

Опсонин — это термин, примененный Райтом к веществу, присутствующему в сыворотке инокулированного животного, которое способно воздействовать на бактерии первоначально введенного вида или сенсибилизировать их, чтобы сделать их легкой добычей для фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов. В методе демонстрации опсонина, который будет описан далее, проводится сравнение между опсонической «силой» пулированной сыворотки и специфической сыворотки.

Аппаратура:

Небольшая центрифуга и пробирки для нее (изготовленные из цилиндров разбитых капиллярных пипеток путем запаивания конических концов в пламени горелки Бунзена).

Капиллярные пипетки Пастера.

Резиновые баллоны.

Восковой карандаш.

Горелка Бунзена с малым пламенем.

Электрические сигнальные часы (см. стр. 39), секундомер или часы.

Прямоугольный стеклянный ящик или лоток для хранения пипеток.

Инкубатор, отрегулированный на 37°C.

Предметные стекла 3 × 1 дюйм.

Кусочек легкой резиновой трубки.

Прямоугольный блок пластилина.

Колба с нормальным физиологическим раствором.

Колба с цитратом натрия (1,5 процента) в нормальном физиологическом растворе.

Необходимые материалы и их подготовка:

Небольшая пробирка с «отмытыми клетками» (красные кровяные диски и лейкоциты); человеческие клетки используются при оценке опсонизирующей силы сыворотки подопытных животных.

Небольшая пробирка с эмульсией бактерий того вида, который вызвал инфекцию у подопытного животного.

Пипетка для крови, содержащая специфическую сыворотку.

Пипетка для крови, содержащая «пулированную» сыворотку.

Отмытые клетки. —

1. Возьмите небольшую центрифужную пробирку и наполовину заполните ее раствором цитрата натрия. Отметьте восковым карандашом верхний предел жидкости.

2. Очистите кожу дистальной фаланги второго пальца левой руки над корнем ногтя ветошью и эфиром. Туго обмотайте резиновую трубку вокруг второй фаланги; пунктируйте стерильной иглой Хагедорна через очищенный участок кожи.

3. Наберите достаточное количество выступающей крови (больше или меньше в зависимости от количества проводимых тестов) пипеткой с баллоном, перенесите ее в пробирку с раствором цитрата и тщательно перемешайте. Сделайте вторую отметку на пробирке на верхнем уровне смешанного раствора цитрата и крови.

4. Поместите пробирку в центрифугу, точно уравновесьте и центрифугируйте, пока клетки крови не будут сброшены в компактную массу, занимающую примерно тот же объем, который заключен между двумя отметками карандашом.

Столбик жидкости в пробирке теперь показывает прозрачную надосадочную жидкость (раствор цитрата и плазма крови), отделенную от четко очерченной верхней поверхности красного осадка корпускул узким сероватым слоем лейкоцитов.

5. Удалите надосадочный столбик раствора цитрата с помощью пипетки с баллоном, наполните пробирку нормальным физиологическим раствором до верхней отметки карандашом и распределите клетки крови по всему физиологическому раствору с помощью пипетки с баллоном. Центрифугируйте, как прежде.

6. Снова удалите надосадочную жидкость, залейте свежую порцию физиологического раствора и центрифугируйте еще раз.

7. Удалите надосадочную физиологическую жидкость как можно ближе к уровню лейкоцитов, насколько это можно сделать безопасно, не удаляя при этом сами лейкоциты.

8. Затем равномерно распределите лейкоциты по всей массе эритроцитов, вращая пробирку между ладонями — точно так же, как это делается с пробиркой с разжиженной средой перед заливкой чашки.

9. Установите пробирку вертикально в пластилиновый блок ближе к одному из его краев.

Бактериальная эмульсия.

1. Возьмите 18–24-часовую культуру необходимой бактерии (например, Diplococcus pneumoniæ), выращенную на скошенном кровяном агаре при 37° C. Налейте на поверхность среды около 5 см³ нормального физиологического раствора.

2. Платиновой петлей эмульгируйте рост с поверхности среды в физиологическом растворе как можно более равномерно.

3. Дайте пробирке постоять несколько минут, чтобы крупные массы роста могли осесть; перенесите верхнюю часть физиологической суспензии в центрифужную пробирку и тщательно отцентрифугируйте.

4. Микроскопически исследуйте каплю надосадочной опалесцирующей эмульсии, чтобы убедиться в отсутствии комков и масс. Если результат неудовлетворительный, приготовьте другую эмульсию, на этот раз соскабливая поверхностный рост платиновым шпателем, перенося его в агатовой ступке и растирая с последовательными небольшими количествами нормального физиологического раствора. Если результат удовлетворительный, вставьте пробирку в пластилиновый блок рядом с той, которая содержит отмытые клетки.

Специфическая сыворотка.

Смешанная сыворотка.

Эти сыворотки собирают и обрабатывают, как описано ранее (см. стр. 379), а части кровяных пипеток, содержащие их, размещают в оставшемся пространстве пластилинового блока.

Fig. 194.—Plasticine block with materials arranged for
opsonin estimations.

Теперь пластилиновый блок имеет вид, показанный на рис. 194.

Метод определения опсонического индекса.

1. Возьмите капиллярную пипетку с резиновым баллоном, обрежьте дистальный конец под прямым углом и сделайте карандашную отметку примерно в 2 см от конца.

2. Наберите в пипетку один объем отмытых клеток, воздушный индекс, один объем бактериальной эмульсии, воздушный индекс и один объем специфической сыворотки (см. рис. 195).

Fig. 195. Opsonin pipette.

3. Тщательно перемешайте на предметном стекле 3 на 1 дюйм, сжимая баллон и выталкивая содержимое пипетки на поверхность стекла, затем ослабляя давление и снова втягивая жидкость в пипетку. Эти два процесса следует повторить несколько раз; наконец, наберите смесь в виде непрерывного столбика в центральную часть капиллярного стебля.

4. Запаяйте кончик пипетки в пламени горелки Бунзена и снимите баллон.

5. Отметьте пипетку (восковым карандашом) отличительным номером сыворотки и поместите ее в стеклянную коробку или лоток.

6. Возьмите другую аналогично подготовленную пипетку и наберите в нее равные объемы отмытых клеток, бактериальной эмульсии и смешанной сыворотки. Обработайте точно так же, как в пунктах 3 и 4, пометьте ее как «контроль» или «N.S.» (нормальная сыворотка) и поместите в коробку рядом с препаратом специфической сыворотки.

7. Поместите коробку с пипетками в инкубатор и установите сигнальные часы на 15 минут (или запустите секундомер).

8. По истечении времени инкубации извлеките пипетки из инкубатора.

9. Отрежьте запаянный конец препарата специфической сыворотки. Тщательно перемешайте его содержимое, как в пункте 3, а затем разделите смесь между двумя предметными стеклами 3 на 1 дюйм и аккуратно сделайте мазок крови (см. стр. 376) на каждом из них таким образом, чтобы только половина поверхности каждого стекла была покрыта кровью — свободный край мазка крови должен приближаться к продольной оси стекла.

Дайте мазкам высохнуть и подпишите стекла алмазным карандашом.

10. Аналогичным образом обработайте содержимое контрольной пипетки.

11. Выберите лучший мазок из каждой пары для фиксации и окрашивания.

12. Фиксация и окрашивание должны проводиться в строго сопоставимых условиях, и для этой цели стекла лучше всего обрабатывать, помещая их в стеклянную подставку для окрашивания, которую можно поочередно опускать в каждый из серии стеклянных кювет, содержащих различные реагенты (рис. 196). Поместите подставку в первую кювету, содержащую спиртовой раствор красителя Лейшмана, на две минуты для фиксации.

Перенесите во вторую кювету, содержащую разбавленный краситель, на десять минут.

Перенесите в третью кювету, содержащую дистиллированную воду, и, держа кювету над раковиной, пустите струю дистиллированной воды до завершения промывки. Извлеките стекла из подставки и высушите.

Краситель Лейшмана лучше всего подходит для рутинной работы со всеми бактериями, кроме B. tuberculosis. Мазки, содержащие туберкулезные палочки, конечно, должны быть окрашены по методу Циль-Нильсена.

Fig. 196. Glass staining trough for blood films.

13. Исследуйте стекло со специфической сывороткой микроскопически с масляной иммерсией 1/12 дюйма. Найдите край мазка крови — вдоль него будет собрана основная масса лейкоцитов. Начиная с одного конца мазка, медленно перемещайте стекло по предметному столику микроскопа и по мере появления каждого лейкоцита подсчитывайте и записывайте количество поглощенных бактерий. Сумма содержимого первых 50 встреченных полиморфноядерных лейкоцитов записывается. (Среднее число бацилл, поглощенных одним лейкоцитом = «фагоцитарный индекс».)

14. Точно таким же образом подсчитайте бактерии, присутствующие в первых 50 клетках контрольного препарата. Это число записывается как знаменатель простой дроби, числителем которой является число, записанное для специфической сыворотки. Эта дробь, выраженная в процентах от единицы = опсонический индекс.

ИММУННОЕ ТЕЛО.

Иммунное тело, или амбоцептор, — это название, данное веществу, присутствующему в сыворотке инфицированного животного, которое успешно противостояло инокуляции каким-либо конкретным микроорганизмом и которое обладает способностью связывать комплемент, обычно присутствующий в сыворотке, с бактериями вида, использованного в качестве антигена, таким образом, что микроорганизмы становятся безвредными и в конечном итоге уничтожаются. Присутствие иммунного тела в сыворотке может быть продемонстрировано in vitro с помощью реакции, разработанной Борде и Жангу, известной как реакция связывания комплемента, причем существование или отсутствие феномена связывания комплемента становится очевидным макроскопически по отсутствию или наличию гемолиза при последующем добавлении «сенсибилизированных» эритроцитов (например, смеси эритроцитарного раствора и соответствующего гемолизина — двух из трех основных компонентов гемолитической системы, см. стр. 326).

Необходимая аппаратура:

Стерильные пипетки 1 см³ (градуированные в десятых долях).

Пробирки 16 × 2 см.

Пробирки 9 × 1 см.

Штативы для пробирок каждого размера.

Необходимые реагенты:

Нормальный физиологический раствор.

Эритроцитарный раствор (эритроциты человека, стр. 329) = E.

Гемолитическая сыворотка (для клеток человека) = H.S.

Комплемент (свежая сыворотка морской свинки) = C.

Специфическая сыворотка от инокулированного животного, инактивированная = S.S.

Контрольная смешанная сыворотка от нормальных животных того же вида, инактивированная = P.S.

Антиген (культура на твердой среде организма (например, B. typhosus), который уже служил антигеном при инокуляции экспериментального животного) = A.

Для подготовки антигена к использованию эмульгируйте весь бактериальный рост в 5 см³ нормального физиологического раствора.

Встряхните эмульсию в пробирке со стерилизованными стеклянными бусинами для обеспечения гомогенности эмульсии и стерилизуйте нагреванием до 60° C на водяной бане в течение одного часа.

Метод.

1. Возьмите пять маленьких пробирок и пронумеруйте их от 1 до 5 восковым карандашом.

2. Into tubes Nos. 1, 3, 4 and 5 pipette 0.1 c.c. of complement.

3. В пробирки № 1 и № 2 отпипетируйте 0,2 см³ исследуемой сыворотки.

4. В пробирку № 4 отпипетируйте 0,2 см³ контрольной сыворотки.

5. Into tubes Nos. 1, 2, 3 and 4 pipette 1 c.c. of the bacterial
emulsion which forms the antigen.

6. Поместите весь набор пробирок в инкубатор при 37° C на один час.

7. Извлеките пробирки из инкубатора и отпипетируйте 1 см³ эритроцитарного раствора и 4 минимальные гемолитические дозы соответствующего гемолизина в каждую пробирку.

8. Тщательно перемешайте и верните пробирки в инкубатор при 37° C еще на один час.

9. По истечении этого времени перенесите пробирки в ледяной шкаф и дайте им постоять три часа.

10. Исследуйте пробирки.

Tubes 3, 4 and 5 should show complete hæmolysis; tube 2 should give no
evidence whatever of hæmolysis.

Эти пробирки являются контрольными для первой пробирки, содержащей исследуемую сыворотку.

В пробирке № 1 отсутствие гемолиза указывает на наличие в сыворотке инокулированного животного специфического антитела к микроорганизму, использованному при инокуляциях; поскольку это показывает, что комплемент был связан иммунным телом с бактериальным антигеном и ни один из них не остался свободным для вступления в гемолитическую систему; с другой стороны, наличие гемолиза показало бы, что значительное количество антител еще не образовалось в ответ на инокуляции. Другими словами, инфекция отсутствует, так как комплемент остался несвязанным во время добавления эритроцитарного раствора и гемолитической сыворотки и был готов соединиться с этими реагентами для завершения гемолитической системы.

Метод может быть представлен схематически, как показано ниже, с использованием уже указанных символов.

Примечание. — Иногда удобнее сенсибилизировать эритроциты непосредственно перед их использованием. Это делается через сорок пять минут после начала эксперимента (стр. 394, шаг 6), то есть до завершения первого периода инкубации, следующим образом:

1. Отмерьте в стерильную пробирку (или колбу) пять см³ эритроцитарного раствора.

2. Отмерьте двадцать минимальных гемолитических доз гемолизина, добавьте к эритроцитарному раствору в пробирке.

3. Дайте эритроцитам и гемолизину оставаться в контакте в течение пятнадцати минут при комнатной температуре. Эритроциты затем сенсибилизированы и готовы к использованию.

4. Когда пробирки извлекаются из инкубатора в конце первого часа (т. е. шаг 7), добавьте 1 см³ сенсибилизированных эритроцитов в каждую пробирку с помощью градуированной пипетки.

5. Тщательно перемешайте, верните пробирки в инкубатор при 37° C и завершите эксперимент, как описано ранее (шаги 8 и далее).

XIX. ПОСМЕРТНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ.

Посмертное исследование следует проводить как можно скорее после смерти животного, так как необходимо помнить, что даже в холодную погоду ткани быстро заселяются многочисленными бактериями, происходящими из пищеварительного тракта или полостей тела, а также из внешних источников.

Следующие пункты относятся к полному и исчерпывающему вскрытию, и при рутинной работе исследование редко требует проведения в полном объеме.

Примечание. — На протяжении всего вскрытия необходимо широко использовать прижигающие инструменты, и следует помнить, что один инструмент должен использоваться только для захвата или разрезания одной структуры. После этого он должен считаться загрязненным, и для следующего шага следует взять свежий инструмент.

Необходимая аппаратура:

Водяной стерилизатор.

{ Scalpels.
Surgical instruments:{ Scissors.
{ Forceps.
{ Bone forceps.

Копьевидный платиновый шпатель (рис. 199).

Прижигающие инструменты (рис. 198).

Пробирки со средами — бульон и скошенный агар.

Поверхностные чашки в чашках Петри (с агаром или одним из его производных).

Платиновая петля.

Алюминиевый «распределитель».

Восковой карандаш.

Стерильные капиллярные пипетки (рис. 13, а).

Стерильные стеклянные капсулы, большие и маленькие.

Покровные стекла или предметные стекла.

Флаконы с фиксирующей жидкостью (см. стр. 114) для кусочков ткани, предназначенных для изготовления срезов.

1. Поместите различные инструменты, пинцеты, ножницы, скальпели и т. д., необходимые для вскрытия, внутрь стерилизатора и стерилизуйте кипячением в течение десяти минут; затем откройте стерилизатор, поднимите лоток изнутри и положите его поперек краев.

2. Нагрейте прижигающие инструменты докрасна на отдельной газовой плите.

Fig. 197.—Apparatus for post-mortem examination, animal
on board.

3. Обильно смочите мех (или перья) 2-процентным раствором лизола. Это служит двойной цели: предотвращает разлетание волос и их попадание в полости тела во время вскрытия, а также делает безвредными любых паразитов, которые могут присутствовать на животном.

Fig. 198.—Searing iron.

4. Внимательно осмотрите труп. Помните, что лабораторные животные не всегда выносливы; смерть может быть вызвана воздействием тепла или холода, голоданием, чрезмерным или неправильным кормлением или нападением крыс, а не бактериальной инфекцией.

5. Закрепите тело животного брюшной поверхностью вверх (если нет особой причины оставлять спину открытой) на доске с помощью медных гвоздей, вбитых через конечности.

6. Стерильными пинцетом и скальпелем сделайте разрез кожи по средней линии от верхушки грудины до лобка. Сделайте другие разрезы под прямым углом к первому до подмышек и паха и откиньте кожу двумя боковыми лоскутами. (Положите теперь инфицированные инструменты на доску рядом с телом или поддержите их на фарфоровой подставке для ножей.)

Место инокуляции.

7. Осмотрите место инокуляции. Если виден какой-либо местный очаг поражения, прижгите его открытую поверхность и платиновой петлей удалите материал из более глубоких частей для приготовления посевов в пробирках и на поверхностных чашках, а также мазков.

Соберите образцы гноя или другого экссудата в капиллярные пипетки для последующего исследования.

8. Осмотрите соседние лимфатические узлы и попытайтесь проследить путь вируса.

9. Прижгите всю открытую поверхность грудной клетки прижигающими инструментами.

Плевральная полость.

10. Разрежьте ребра с обеих сторон грудины и удалите прямоугольную часть передней стенки грудной клетки стерильными ножницами и свежей парой пинцетов, обнажив сердце. Положите инфицированные инструменты рядом с первым набором.

11. Наблюдайте состояние передних средостенных узлов, тимуса и легких. Соберите количество плеврального выпота, если таковой имеется, в пипетку для дальнейшего исследования позже.

12. Поднимите перикардиальный мешок свежей парой пинцетов и прожгите эту структуру прижигающим инструментом.

Соберите образец перикардиальной жидкости в пипетку для микроскопического и культурального исследования.

13. Захватите верхушку сердца пинцетом и прижгите поверхность правого желудочка.

14. Погрузите открытый кончик капиллярной пипетки через прижженную область в желудочек и наполните кровью.

Сделайте посевы и мазки сердечной крови.

15. Соберите дополнительный образец крови или сыворотки для последующего исследования на наличие антител.

Брюшная полость.

16. Прижгите широкую полосу по средней линии брюшной стенки; вскройте брюшную полость разрезом в центре прижженной линии. Наблюдайте состояние сальника, брыжейки, внутренних органов и брюшинной поверхности кишечника.

17. Соберите образец перитонеальной жидкости (или гноя, если таковой имеется) в капиллярную пипетку. Сделайте посевы в пробирки и на поверхностные чашки, а также мазки из этого места.

18. Соберите образец мочи из переполненного мочевого пузыря в большую пипетку (способом, указанным для сердечной крови) для дальнейшего исследования путем посевов, микроскопических препаратов и химического анализа.

19. Соберите образец желчи из желчного пузыря аналогичным образом.

20. Извлеките селезенку и поместите ее в стерильную капсулу. Позже прижгите поверхность этого органа; погрузите копьевидный шпатель в центр прижженной области, поверните его между пальцами и извлеките из органа. Достаточное количество материала будет извлечено в ушке на его конце для приготовления посевов. Повторение процесса даст материал для мазков.

21. Захватите один конец селезенки стерильным пинцетом. Прижгите узкую полоску ткани вокруг всего органа и разрежьте селезенку в этом месте ножницами. Удерживая кусочек селезенки пинцетом, приложите срезанную поверхность к поверхностной чашке в нескольких разных местах.

22. Аналогичным образом исследуйте другие органы — печень, легкие, почки, лимфатические узлы (брыжеечные, печеночные, поясничные и т. д.) и т. д. Подготовьте посевы и мазки.

23. Препарируйте длинную кость из одной верхней и одной нижней конечности и одно из самых больших ребер. В каждом случае приготовьте культуры из костного мозга. Отложите эти кости для последующего приготовления мазков костного мозга.

24. Мазки костного мозга лучше всего делать по методу Прайс-Джонса. Захватите кость плоскогубцами и выдавите немного костного мозга; примите его на платиновую петлю и перенесите в часовое стекло с диссоциирующей жидкостью и эмульгируйте. Диссоциирующая жидкость представляет собой нейтральный 10-процентный раствор глицерина, приготовленный следующим образом:

Отмерьте 10 см³ лучшего глицерина Прайса и 90 см³ стерильной дистиллированной воды, не содержащей аммиака. Смешайте. Титруйте раствором едкого натра n/10, используя фенолфталеин в качестве индикатора. Начальная реакция обычно составляет + 0,1 до + 0,5; добавьте рассчитанное количество раствора едкого натра n/10 для нейтрализации.

25. Поместите петлю свежей диссоциирующей жидкости на предметное стекло 3 × 1 дюйм; добавьте аналогичную петлю эмульсии костного мозга и очень осторожно распределите по поверхности стекла.

26. Дайте мазку высохнуть на воздухе (защищенном от пыли) без нагревания.

27. Окрасьте полихромным красителем Дженнера (стр. 97) в течение двух с половиной минут.

28. Промойте дистиллированной водой, не содержащей аммиака, тщательно высушите и заключите в ксилоловый бальзам.

Черепная и спинномозговая полости.

29. В некоторых случаях может потребоваться (например, экспериментальная инокуляция бешенства) исследовать черепную полость или извлечь спинной мозг. Верните внутренние органы в брюшную полость; стяните лоскуты кожи вместе и закрепите стальными зажимами Мишеля. Вытащите медные гвозди, крепящие конечности к доске, переверните животное и снова прибейте конечности — теперь тело лежит спиной вверх.

30. Сделайте продольный разрез по средней линии от морды до корня хвоста и четыре поперечных разреза — один, соединяющий корни двух ушей, один поперек тела на уровне остистых отростков лопаток, другой на уровне реберного края и последний поперек верхнего уровня таза. Откиньте эти лоскуты кожи.

31. Пинцетом и скальпелем препарируйте мышцы, лежащие в борозде с обеих сторон остистых отростков.

32. Перережьте основания поперечных отростков костными кусачками. Срежьте свод черепа, перережьте корни нервов и извлеките головной и спинной мозг, поместите в большую стеклянную чашку для исследования. Подготовьте посевы из спинномозговой жидкости. Извлечение головного и спинного мозга — утомительный процесс, и во время препарирования трудно избежать повреждения этих структур.

Операция, однако, выполняется очень быстро и аккуратно с помощью хирургического двигателя (см. стр. 361). К наконечнику крепится маленькая циркулярная пила. Кости черепа прорезаются, и весь свод удаляется, обнажая всю верхнюю часть мозга. Аналогичным образом все остистые отростки могут быть удалены в один ряд, проведя пилой сначала по одной стороне позвоночника, а затем по другой. Таким образом, получается достаточно места для удаления нервных тканей с минимумом усилий.

33. Завершив подготовку культур, не спеша извлеките небольшие части различных органов и поместите каждую в отдельные флаконы с фиксирующей жидкостью для будущего изготовления срезов. Наклейте на каждый флакон этикетку с указанием всех необходимых деталей о его содержимом.

34. При необходимости извлеките части органов для сохранения и демонстрации в качестве музейных экспонатов (см. стр. 404).

35. Соберите все инфицированные инструменты, верните их в стерилизатор и продезинфицируйте кипячением в течение десяти минут.

Fig. 199.—Spear-headed platinum spatula (actual size.)

36. Насыпьте сухие опилки в открытые полости тела, чтобы впитать кровь и жидкость. Накройте тело промокательной или фильтровальной бумагой, смоченной 2-процентным раствором лизола. Поместите в оцинкованное железное ведро с крышкой, готовое к транспортировке в крематорий.

37. Кремируйте труп вместе с доской, на которой он закреплен.

38. Окрасьте мазки подходящими методами и исследуйте микроскопически.

39. Инкубируйте посевы и внимательно осматривайте их изо дня в день.

40. Сделайте полные записи о состоянии различных полостей тела и внутренних органов сразу после завершения вскрытия; и добавьте результат микроскопического и культурального исследования, когда он будет доступен.

Как часть картотечной системы, используемой в лаборатории автора, о которой уже упоминалось (см. стр. 335), существует специальная желтая карточка для записей о вскрытии. На лицевой стороне карточки напечатаны заголовки для различных данных — некоторые из которых иногда непреднамеренно опускаются, — а на обороте есть схематический рисунок, который можно использовать для указания положения основных поражений на трупе любого из лабораторных животных.

Fig. 200.—Front of post-mortem card.

41. Наконец, результаты действия выделенного организма или организмов могут быть соотнесены с симптомами, наблюдавшимися при жизни, и наблюдения суммированы под следующими заголовками:

Тканевые изменения:

1. Local—i. e., produced in the neighbourhood of the bacteria.
Position: (a) At primary lesion.
(b) At secondary foci.
Character: (a) Vascular changes and tissue reactions.}Acute or chronic.
(b) Degeneration and necrosis.}
2. General (i. e., produced at a distance from the bacteria, by absorption of toxins):
(a) In special tissues—e. g., nerve cells and fibres, secreting cells, vessel walls, etc.
(b) General effects of malnutrition, etc.
Symptoms:
(a) Associated with known tissue changes.
(b) Without known tissue changes.

Fig. 201.—Back of post-mortem card.

Постоянные препараты — музейные экспонаты.

I. Ткани. — Внешний вид пораженных тканей можно сохранить следующим методом:

1. Извлеките ткань или орган из трупа как можно скорее после смерти, соблюдая большую осторожность, чтобы избежать деформации или повреждения.

2. Поместите его в широкогорлую банку с пробкой, достаточно большую, чтобы удобно его разместить, на подкладку из ваты, и расположите в том положении, которое он должен занимать (но если предполагается показать срез ткани или органа, пока не разрезайте его).

3. Залейте фиксирующим раствором Кайзерлинга и закройте банку пробкой; оставьте ткани в этом растворе на срок от сорока восьми часов до семи дней (в зависимости от размера) для фиксации. Сделайте любые необходимые срезы.

Модифицированный раствор Кайзерлинга готовится следующим образом:

Отвесьте

Potassium acetate30 grammes.
Potassium nitrate15 grammes.

и растворите в

Distilled water1000 c.c.

затем добавьте

Formalin150 c.c.

Отфильтруйте.

Этот фиксирующий раствор можно использовать многократно, пока он остается прозрачным. Даже когда он стал мутным, если простой фильтрации достаточно, чтобы сделать его прозрачным, фильтрат можно использовать снова.

4. Перенесите ткань в ванну с метилированным спиртом (95 процентов) на срок от тридцати минут до одного часа.

5. Перенесите в свежую ванну со спиртом и внимательно наблюдайте. Когда естественные цвета проявятся в своих первоначальных оттенках, среднее время от трех до шести часов, извлеките ткани из спиртовой ванны, высушите спирт с разрезанных поверхностей, промокнув мягкой тканью, затем перенесите в монтирующий раствор.

Монтирующий раствор Жора (модифицированный) состоит из

Glycerine500 c.c.
Distilled water750 c.c.
Formalin2 c.c.

Столь же хорош, но гораздо дешевле монтирующий раствор Фроста:

Potassium acetate160 grammes.
Sodium fluoride80 grammes.
Chloral hydrate80 grammes.
Cane sugar (Tate's cubes)3,500 grammes.
Saturated thymol water8,000 c.c.

6. Через двадцать четыре часа в этом растворе, или как только ткань осядет, перенесите в музейную банку, наполните свежим монтирующим раствором и запечатайте.

6a. Или перенесите в музейную банку и наполните разжиженным желатином, в который добавлено 1 процент формалина. Накройте банку и дайте желатину застыть. Когда он станет твердым, запечатайте крышку банки на месте.

7. Чтобы запечатать музейный препарат, сначала нагрейте стеклянную пластину, которая служит крышкой. Это удобнее всего сделать, поместив очищенную и отполированную покровную пластину на кусок асбестового картона над пламенем горелки Бунзена, убавленным до минимума.

8. Нанесите ровный слой горячего цемента на фланец банки. Цемент готовится следующим образом:

Отвесьте и смешайте в железном ковше

Gutta percha (pure)4 parts.
Asphaltum5 parts.

и расплавьте вместе над пламенем горелки Бунзена, помешивая железным стержнем до полного растворения.

9. Переверните стеклянную пластину над банкой и плотно прижмите к цементу. Положите сверху кусок асбестового картона и на него установите подходящий груз, пока цемент не остынет и полностью не затвердеет.

10. Обрежьте выступающие куски цемента старым ножом, загладьте шов между банкой и крышкой горячим гладким куском металла (например, прижигающим инструментом).

11. Нанесите узкую полоску японского черного лака для отделки вокруг шва, перекрывая крышку.

II. Культуры бактерий в пробирках. — При демонстрации типичного внешнего вида их можно сохранить, если не постоянно, то по крайней мере на многие годы, в качестве музейных экспонатов следующим методом:

1. Возьмите большую стеклянную банку высотой 25 см и диаметром 18 см с прочным основанием и широким фланцем, тщательно отшлифованным вокруг горлышка. Банка должна быть снабжена диском из листового стекла, отшлифованным с одной стороны, чтобы служить крышкой.

2. Нанесите толстый слой смоляной мази (Британская фармакопея) на фланец вокруг горлышка банки.

3. Покройте дно банки слоем ваты и пропитайте ее формалином.

4. Удалите ватную пробку из пробирок с культурами и поместите их горлышком вверх внутрь банки. (Если в какой-либо из пробирок с культурами присутствует конденсат, его следует удалить с помощью капиллярной пипетки перед помещением пробирок в формалиновую камеру.)

5. Установите стеклянный диск отшлифованной стороной вниз на горлышко банки и закрепите его, плотно прижав к мази вращательным движением.

6. Извлеките пробирки из формалиновой камеры по прошествии недели и высушите каждую снаружи.

Fig. 202.—Bulloch's tubes.

7. Запечатайте открытое горлышко каждой пробирки в пламени паяльной трубки и наклейте этикетку.

Если культуры предназначены для музейных целей с момента их первого посева, удобнее использовать пробирки Буллока. Они немного длиннее обычных пробирок и снабжены сужением примерно на 2 см ниже горлышка (рис. 202) — особенность, которая делает запечатывание в пламени паяльной трубки легким делом.

XX. ИЗУЧЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ.

Студент, добросовестно отработавший методы и т. д., рассмотренные ранее, находится в положении, позволяющем делать точные наблюдения и писать точные описания результатов таких наблюдений. Поэтому ему теперь доверяют чистые культуры различных патогенных бактерий, чтобы он мог изучить жизненный цикл каждой из них и записать результаты своих собственных наблюдений — которые впоследствии будут исправлены или дополнены демонстратором. Таким образом, он становится независимым от описаний в учебниках, утверждения в которых он в противном случае слишком склонен принимать на веру, не пытаясь лично проверить их точность.

В ходе этой работы внимание также должно быть направлено, по мере возникновения необходимости, на другие бактерии, патогенные или сапрофитные, которые связаны с конкретными организмами, находящимися под наблюдением, или настолько напоминают их, что становятся возможными источниками ошибок, путем их проработки параллельными методами — другими словами, различные бактерии следует изучать «группами». На следующих страницах принята группировка, используемая в элементарных классах автора для студентов-медиков и стоматологов, а также для кандидатов на службу общественного здравоохранения, поскольку довольно длительный опыт полностью подтвердил ценность и полезность этого расположения, и с его помощью получается фонд информации относительно сходств и различий, морфологических и культуральных, большого числа бактерий. Тот факт, что некоторые бактерии появляются более чем в одной из этих групп, отнюдь не является недостатком, а является положительным приобретением для студента, поскольку только при повторении будет приобретено необходимое знакомство с культуральными характеристиками важных бактерий. Изучение различных групп, конечно, будет варьироваться в деталях у отдельных демонстраторов и в зависимости от требований студента — общее направление, которое оно должно принять, кратко указано в связи только с первой группой (стр. 410-411). Этот раздел следует тщательно проработать, прежде чем студент приступит к изучению бактериоскопического анализа.

Принято начинать изучение патогенных бактерий с организмов нагноения. Это большая группа, так как все патогенные бактерии обладают способностью при определенных условиях инициировать чисто гнойные процессы вместо или в дополнение к своим специфическим поражениям (например, Bacillus tuberculosis, Streptococcus lanceolatus, Bacillus typhosus и т. д.). Существует, однако, определенное количество организмов, которые обычно проявляют свою патогенность в образовании гноя. Их обычно группируют вместе под названием «пиогенные бактерии», в отличие от тех, которые лишь изредка выполняют пиогенную роль.

Организмы, включенные в эту группу:

1. Staphylococcus pyogenes albus.

2. Staphylococcus pyogenes aureus.

3. Staphylococcus pyogenes citreus.

4. Streptococcus pyogenes longus.

5. Micrococcus tetragenus.

6. Bacillus pyocyaneus.

7. Bacillus pneumoniæ.

и в некоторых специальных тканях

8. Micrococcus gonorrhϾ.

9. Micrococcus intracellularis meningitidis (Meningococcus).

10. Micrococcus catarrhalis.

11. Bacillus ægypticus (Koch-Weeks Bacillus).

Группу можно с преимуществом подразделить, как указано на следующих страницах:

I. Пиогенные кокки.

Staphylococcus pyogenes albus.

Staphylococcus pyogenes aureus.

Staphylococcus pyogenes citreus.

to contrast with

Micrococcus candicans.

Micrococcus agilis.

1. Подготовьте субкультуры из каждой:

Bouillon, }

Agar streak, }

Blood serum, }

Litmus milk. } and incubate at 37°C.

Agar streak, }

Gelatine stab, }

Potato. } and incubate at 20°C.

Сравните внешний вид культур изо дня в день. Отметьте, что M. agilis отказывается расти при 37° C.

2. Сделайте препараты «висячая капля» из бульонных и агаровых культур после двадцати четырех часов инкубации. Исследуйте микроскопически и сравните. Отметьте локомоторную активность M. agilis и броуновское движение остальных микрококков.

3. Подготовьте мазки из агаровых культур после двадцати четырех часов инкубации. Окрасьте на жгутики модифицированным методом Питфилда. Отметьте, что M. agilis — единственный микрококк, показывающий жгутики.

4. Сделайте микроскопические препараты каждого из всех различных сред после двадцати четырех, сорока восьми часов и трех дней инкубации. Окрасьте карболовым метиленовым синим, карболовым фуксином и по методу Грама. Исследуйте мазки микроскопически и сравните. Отметьте в препарате по Граму грамотрицательный характер некоторых отдельных кокков в каждом мазке, приготовленном из трехдневного роста — такие кокки мертвы.

5. Окрасьте срез ткани почки (показывающий образование абсцесса Staphylococcus aureus) по методу Грама и докрасьте эозином.

6. Окрасьте мазок гноя из абсцесса (содержащий Staphylococcus pyogenes aureus) карболовым метиленовым синим, а также по методу Грама, докрашенному эозином.

7. Инокулируйте [15] белую мышь подкожно тремя петлями сорокавосьмичасовой агаровой культуры Staphylococcus aureus, эмульгированной в 0,2 см³ стерильного бульона.

Внимательно наблюдайте при жизни, а когда наступит смерть, проведите тщательное посмертное исследование.

II. Пиогенные кокки.

Micrococcus gonorrhϾ.

Micrococcus intracellularis meningitidis (meningococcus).

Micrococcus catarrhalis.

Micrococcus tetragenus.

Micrococcus paratetragenus.

III. Пиогенные кокки.

Streptococcus pyogenes longus.

Streptococcus of bovine mastitis.

Streptococcus lanceolatus (Diplococcus pneumoniæ or pneumococcus).

to contrast with

Streptococcus brevis.

Streptococcus lebensis.

IV. Пиогенные бациллы.

Bacillus pneumoniæ (Friedlaender).

Bacillus rhinoscleromatis.

Bacillus lactis aerogenes.

V. Пиогенные бациллы.

Bacillus pyocyaneus.

to contrast with

Bacillus fluorescens liquefaciens.

Bacillus fluorescens non-liquefaciens.

VI. Группа пневмонии.

Streptococcus lanceolatus (pneumococcus).

Bacillus pneumoniæ (Friedlaender).

Streptococcus pyogenes longus.

VII. Дифтероидная группа.

Bacillus diphtheriæ (Klebs-Lœffler).

Bacillus Hoffmanni.

Bacillus xerosis.

Bacillus septus.

VIII. Группа кишечной палочки-тифа.

B. typhi abdominalis (B. typhosus).

B. coli communis.

B. enteritidis (Gaertner).

to contrast with

B. aquatilis sulcatus.

IX. Группа Эшериха.

B. coli communis (Escherich).

B. coli communior.

B. lactis aerogenes.

B. cloacæ.

X. Группа Гертнера.

Bacillus enteritidis (Gaertner).

B. paratyphosus A.

B. paratyphosus B.

Bacillus choleræ suum (Hog Cholera).

B. psittacosis.

XI. Группа Эберта.

B. typhosus (Eberth).

B. dysenteriæ (Shiga).

B. dysenteriæ (Flexner).

B. fæcalis alcaligines.

XII. Группа спирилл.

Vibrio choleræ.

Vibrio metschnikovi.

to contrast with

Vibrio proteus (Finkler and Prior).

Spirillum rubrum.

Spirillum rugula.

XIII. Группа сибирской язвы.

Bacillus anthracis.

to contrast with

Bacillus subtilis.

Bacillus mycoides.

Bacillus mesentericus fuscus.

XIV. Кислотоустойчивая группа.

Bacillus tuberculosis (human).

" " (bovine).

" " (avian).

" " (fish).

to contrast with

Bacillus phlei (Timothy grass bacillus).

Butter bacillus of Rabinowitch.

XV. Группа чумы.

Bacillus pestis.

B. septicæmiæ hæmorrhagicæ.

B. suipestifer.

XVI. Группа гриппа.

B. influenzæ.

Bacillus ægypticus (Koch-Weeks).

Bacillus pertussis.

XVII. Разное.

Bacillus lepræ.

Bacillus mallei.

Micrococcus melitensis.

XVIII. Группа стрептотриксов.

Streptothrix actinomycotica.

Streptothrix maduræ.

to contrast with

Cladothrix nivea.

XIX. Группа столбняка.

Bacillus tetani.

Bacillus œdematis maligni.

Bacillus chauvei (symptomatic anthrax).

XX. Группа Enteritidis sporogenes.

Bacillus enteritidis sporogenes.

B. botulinus.

B. butyricus.

B. cadaveris.

СНОСКИ:

[15] См. примечание о лицензии на вивисекцию, стр. 334.

XXI. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ АНАЛИЗЫ.

Каждый бактериологический или бактериоскопический анализ воздуха, земли, сточных вод, различных пищевых продуктов и т. д. включает, как правило, два отдельных исследования, дающих результаты очень неравной ценности:

1. Quantitative.

2. Qualitative.

Первое является чисто количественным и как таковое имеет второстепенное значение, поскольку оно направлено просто на подсчет (приблизительный) общего количества бактерий, присутствующих в любой данной единице объема, независимо от природы и характера отдельных организмов.

Второе и более важное исследование носит как качественный, так и количественный характер, поскольку оно направлено на то, чтобы точно идентифицировать такие патогенные бактерии, которые могут присутствовать, в то время как, попутно, рекомендуемые методы рассчитаны на то, чтобы с достаточной степенью точности указать числовую частоту таких бактерий в образце, находящемся под исследованием.

Общие принципы, лежащие в основе бактериологических анализов воды, сточных вод, воздуха и пыли, почвы, молока, мороженого, мяса и других консервированных продуктов, как это показано методами, используемыми автором, указаны на следующих страницах, вместе с методами тестирования фильтров и химических бактерицидов; и техника, изложенная там, окажется способной к расширению и адаптации к любым обстоятельствам или набору обстоятельств, с которыми может столкнуться студент.

Контроли. — Необходимость существования адекватных контролей во всей экспериментальной работе не может быть слишком настойчиво подчеркнута. Каждая партия чашек, которая заливается, должна включать по крайней мере одну с предположительно «стерильной» средой; чашечные или пробирочные культуры должны быть сделаны из различных разбавляющих жидкостей; каждая пробирка с углеводной средой, которая инокулируется, должна поступать в инкубатор в компании с аналогичной, но неинокулированной пробиркой, и так далее.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ.

Бактерии, присутствующие в воде, могут включать не только разновидности, которые имеют свою нормальную среду обитания в воде и, следовательно, будут развиваться при 20° C, но также, если вода была загрязнена экскрементами, разновидности, которые произошли из организма животного или являются патогенными для него и которые будут хорошо развиваться только при температуре 37° C. Чтобы продемонстрировать присутствие каждого из этих классов, необходимо будет инкубировать различные культуры при каждой из этих температур.

Далее, образец воды может содержать плесень, дрожжи или торулы, и развитие их будет лучше всего обеспечено путем посева в сусло-желатин и инкубации при 20° C.

1. Количественный.

Сбор образца. — Наиболее подходящими сосудами для приема образца воды являются небольшие стеклянные бутылки емкостью 60 см³ с узкими горлышками и нависающими стеклянными пробками (для предотвращения загрязнения горлышек бутылок падающей пылью). Они должны быть тщательно стерилизованы в стерилизаторе горячим воздухом (см. стр. 31).

(a) Если образец получен из крана или трубы, включите воду и дайте ей течь в течение нескольких минут. Удалите пробку из бутылки и удерживайте ее в руке, пока вода течет в бутылку и заполняет ее на три четверти. Замените пробку и привяжите ее, но не запечатывайте.

(b) Если образец получен из ручья, резервуара или водохранилища, закрепите кусок прочной проволоки вокруг горлышка бутылки, удалите пробку и удерживайте ее в руке. Затем, используя проволоку в качестве ручки, погрузите бутылку в воду горлышком вниз, пока она не окажется глубоко под поверхностью; затем переверните ее, дайте наполниться и извлеките из воды. Вылейте несколько кубических сантиметров воды из бутылки, замените пробку и привяжите ее.

Fig. 203.—Esmarch's collecting bottle for water
samples.

(c) Если образец получен из озера, реки или моря; или когда желательно сравнить образцы, взятые на разной глубине, используется аппарат, разработанный фон Эсмархом (рис. 203). В нем стерилизованная бутылка заключена в утяжеленную металлическую клетку, которую можно опустить с помощью градуированной линии до достижения необходимой глубины. В этой точке бутылка открывается тонким проволочным шнуром, прикрепленным к пробке; когда бутылка полна (судя по прекращению подъема пузырьков воздуха), натяжение шнура ослабляется, и напряжение спиральной пружины над пробкой снова вдавливает ее в горлышко бутылки. Когда аппарат вынимают из воды, маленькие бутылки наполняют из него и упаковывают в ледяной ящик, упомянутый ниже.

Недорогую замену бутылке Эсмарха можно сделать в лаборатории следующим образом:

Выберите широкогорлую стеклянную бутылку с притертой пробкой емкостью около 500 см³ (около 20 см в высоту и 8 см в диаметре).

Удалите стеклянную пробку и вставьте на ее место резиновую пробку с двумя отверстиями.

Через одно отверстие пропустите кусок стеклянной трубки длиной около 5 см, а через другое — кусок длиной 22 см, достигающий почти дна бутылки, причем каждая трубка выступает примерно на 2,5 см над резиновой пробкой. Заткните открытые концы трубок ватой. Закрепите пробку на месте тонкой медной проволокой.

Fig. 204.—Thresh's deep water sampling bottle.

Стерилизуйте подготовленную бутыль в автоклаве. Удалите ватные пробки и соедините выступающие трубки отрезком свободно прилегающей прочной резиновой трубки длиной около 5 см, предварительно простерилизованной кипячением.

Возьмите отрезок прочного резинового шнура длиной около 33 см и диаметром 10 мм (такой, как используется для дверных пружин), наденьте на него стальное разрезное кольцо и плотно закрепите свободные концы на горлышке бутыли с помощью шнура или кетгута.

Прикрепите шнур, используемый для опускания бутыли в воду, к разрезному кольцу на резиновом подвесе. Лучшим материалом для этой цели является изолированный хлопчатобумажной оплеткой электрический провод, завязанный узлом через каждый метр.

Соедините разрезное кольцо также с коротким отрезком резиновой трубки, объединяющей две стеклянные трубки, с помощью кетгута (или тонкой медной проволоки) такой длины, чтобы при подвешивании бутыли резиновая трубка не натягивалась, но при этом легко соскакивала при резком рывке за подвесной шнур.

Теперь оберните тяжелую свинцовую трубку диаметром около 1 см вокруг верхней части бутыли, начиная от горлышка чуть выше плечиков. Это обеспечивает погружение бутыли в вертикальном положении (рис. 204).

Подготовленный аппарат опускают на требуемую глубину, затем делают резкий рывок за подвесной шнур, который отсоединяет резиновую трубку и тем самым открывает две стеклянные трубки. Вода поступает через более длинную трубку, а воздух вытесняется через более короткую. Пузырьки воздуха можно видеть или слышать, как они поднимаются через воду, пока бутыль не заполнится почти полностью, при этом в горлышке бутыли остается небольшой объем сжатого воздуха.

По мере подъема аппарата заключенный в нем воздух расширяется и предотвращает поступление дополнительного количества воды с меньшей глубины.

Fig. 205.—Ice-box for transmission of water samples,
etc.

Транспортировка пробы. — Если исследование пробы нельзя начать немедленно, необходимо принять меры для предотвращения размножения бактерий, содержащихся в воде, в течение времени, затраченного на транспортировку от места сбора до лаборатории. Для этой цели необходим ледник, подобный показанному (на рис. 205). Он состоит из металлического цилиндра с двойными стенками, в который вставляется цилиндрическая камера достаточной вместимости для размещения четырех бутылей по 60 см³; она, в свою очередь, закрывается металлическим диском — все три части скрепляются винтами с накатанной головкой через выступающие фланцы. При использовании поместите бутыли, обернутые ватой, в центральную камеру, заполните пространство между стенками дробленым льдом, надежно закройте металлическую коробку, завинтив барашковые гайки, и поместите ее в деревянный ящик с войлочной подкладкой. (Было показано, что, хотя бактерии выживают при воздействии температуры тающего льда, практически ни одна из них не размножается при этой температуре.)

По прибытии в лабораторию метод исследования заключается в добавлении отмеренных количеств пробы воды в несколько пробирок с питательными средами, предварительно разжиженными нагреванием, приготовлении чашечных культур из каждой из этих пробирок, инкубации при подходящей температуре и, наконец, подсчете колоний, появившихся на чашках.

Необходимая аппаратура:

Plate-levelling stand.

Case of sterile plates.

Case of sterile pipettes, 1 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).

Case of sterile capsules, 25 c.c. capacity.

Tubes of nutrient gelatine.

Tubes of nutrient agar.

Tubes of wort gelatine.

One 250 c.c. flask of sterile distilled water.

Tall cylinder containing 2 per cent. lysol solution.

Bunsen burner.

Grease pencil.

Water-bath regulated at 42° C.

Метод. —

1. Установите платформу для выравнивания чашек, заполнив ее водяной отсек водой при температуре 45° C.

2. Пронумеруйте пробирки с агаром последовательно от 1 до 6; пробирки с желатином — от 1 до 6, а пробирки с суслом — 1, 2 и 3. Прокалите пробки и убедитесь, что они не прилипли к краям пробирок.

3. Поместите пробирки с агаром в кипящую воду до расплавления среды, затем перенесите их на водяную баню, отрегулированную на 42° C. Разжижьте питательный желатин и желатин на сусле в пробирках, погрузив их на ту же водяную баню.

4. Выньте бутыль с пробой воды из ледника, равномерно распределите бактериальное содержимое по всему объему воды путем встряхивания, разрежьте шнурок, удерживающий пробку, и ослабьте пробку, но не вынимайте ее.

Fig. 206.—Withdrawing water from water sample bottle.

5. Возьмите одну из пипеток объемом 1 см³ из футляра, держа ее за гладкую часть трубки. Дважды проведите градуированную часть через пламя горелки Бунзена. Наклоните бутыль с пробой воды на столе, удерживая горлышко между средним и безымянным пальцами левой руки; захватите головку пробки указательным и большим пальцами и выньте ее из бутыли.

6. Введите пипетку в горлышко бутыли, удерживая ее кончик значительно ниже поверхности воды (рис. 206). Наберите в пипетку чуть больше 1 см³ и дайте ей вытечь; это увлажнит внутреннюю поверхность пипетки и сделает возможным точное измерение. Теперь наберите в пипетку ровно 1 см³. Выньте пипетку из бутыли, верните пробку на место и поставьте бутыль вертикально.

7. Возьмите первую расплавленную пробирку с агаром в левую руку, удалите ватную пробку и добавьте в ее содержимое 0,5 см³ пробы воды из пипетки; снова закройте пробирку пробкой и верните ее на водяную баню. Аналогичным образом добавьте 0,3 см³ воды в содержимое второй пробирки и 0,2 см³ — в содержимое третьей.

8. Аналогичным образом добавьте 1 см³ пробы в содержимое четвертой пробирки.

9. Аналогично добавьте 0,5 см³ и 0,1 см³ соответственно в содержимое пятой и шестой пробирок.

10. Опустите пипетку в цилиндр с раствором лизола.

11. Смешайте пробу воды со средой в каждой пробирке способом, описанным в разделе «Чашечные культуры»; залейте чашку из каждой пробирки. Наклейте на каждую чашку этикетку с указанием (а) отличительного номера пробы, (b) количества содержащейся в ней пробы воды и (c) даты.

12. Вылейте содержимое пробирки с расплавленным агаром — без инокуляции — в чашку Петри в качестве контроля для демонстрации стерильности используемой партии агара.

13. Дайте чашкам застыть и инкубируйте при 37° C.

14. Опорожните водяной отсек выравнивающего аппарата и наполните его ледяной водой.

15. С помощью стерильной пипетки объемом 10 см³ внесите 9,9 см³ стерильной дистиллированной воды в стерильную стеклянную капсулу.

16. Добавьте 0,1 см³ пробы воды к 9,9 см³ стерильной воды в капсуле. Это даст разведение 1 к 100.

17. Засейте шесть пробирок с питательным желатином следующим образом: в первую пробирку добавьте 0,5 см³ пробы воды непосредственно из бутыли; во вторую — 0,3 см³; в третью — 0,2 см³; и залейте чашку из каждой пробирки. В четвертую пробирку добавьте 0,5 см³ разведенной пробы воды из капсулы; в пятую — 0,3 см³; в шестую — 0,2 см³; и залейте чашку из каждой.

18. Наклейте на каждую чашку этикетку с указанием количества содержащейся в ней пробы воды — то есть 0,5 см³, 0,3 см³, 0,2 см³, 0,005 см³, 0,003 см³ и 0,002 см³.

19. Залейте контрольную (неинокулированную) чашку с желатином.

20. Дайте чашкам застыть и инкубируйте при 20° C.

21. В первую пробирку с расплавленным желатином на сусле добавьте 0,5 см³ пробы воды; во вторую — 0,3 см³; в третью — 0,2 см³.

22. Наклейте этикетки на чашки, дайте им застыть и инкубируйте при 20° C.

23. Подсчитайте и запишите количество колоний, развившихся на агаре при 37° C после сорока восьми часов инкубации.

24. Отметьте количество колоний, присутствующих на каждой из чашек с желатином и желатином на сусле после сорока восьми часов инкубации.

25. Верните чашки с желатином и желатином на сусле в инкубатор; наблюдайте снова через три, четыре и пять дней.

26. Рассчитайте и запишите количество организмов, присутствующих в одном кубическом сантиметре исходной воды, исходя из среднего значения по шести чашкам с желатином на максимально поздний срок до семи дней — наличие разжижающих бактерий может сделать расчет необходимым на более раннем сроке, отсюда важность ежедневных наблюдений.

Метод подсчета. — Наиболее точным методом подсчета колоний на каждой из чашек является использование счетного диска Джеффри или Пейкса. Каждый из этих дисков представляет собой кусок бумаги, на котором напечатан абсолютно черный диск, разделенный концентрическими окружностями и радиусами, напечатанными белым цветом. В счетчике Джеффри (рис. 207) каждое подразделение имеет площадь 1 квадратный сантиметр; в счетчике Пейкса (рис. 208) радиусы делят круг на шестнадцать равных секторов, а подсчет облегчается концентрическими окружностями, равноудаленными от центра.

Fig. 207.—Jeffery's disc, reduced.

Fig. 208.—Pakes' disc, reduced.

(а) При окончательном подсчете каждой чашки поместите чашку поверх счетного диска и отцентрируйте ее, если возможно, совместив ее периферию с той или иной концентрической окружностью.

(b) Снимите крышку чашки и с помощью ручной лупы подсчитайте колонии, появляющиеся в каждом из секторов по очереди. Сделайте пометку о количестве, присутствующем в каждом из них.

(c) Если колоний менее 500, следует подсчитать всю чашку целиком. Если же их число превышает это значение, подсчитайте половину или четверть чашки, или подсчитайте сектор здесь и там, и на основе этих цифр оцените количество колоний, присутствующих на всей чашке. На практике обнаружится, что диск Пейкса более подходит для первого класса чашек; диск Джеффри — для второго. Однако следует помнить, что если чашки не были тщательно выровнены и среда не имеет одинаковой толщины по всей поверхности, бесполезно пытаться выводить среднее значение по малым площадям, поскольку там, где среда толстая, будут развиваться все бактерии, а там, где слой тонкий, лишь немногие бактерии найдут достаточно питательного субстрата для образования видимых колоний.

Следует отметить, что количества воды, выбранные для добавления в каждый набор пробирок с питательными средами, были тщательно подобраны для получения пригодных для работы результатов даже при работе с сильно различающимися пробами. Чашки, приготовленные на агаре с 0,1 см³ и на желатине с 0,02 см³, можно подсчитать даже при наличии в пробе большого количества бактерий; тогда как если микроорганизмов относительно мало, агаровая чашка № 4 и желатиновая чашка № 1 дадут наиболее надежные результаты подсчета. Кроме того, результаты подсчета чашек в некоторой степени контролируют друг друга; например, вторая и третья чашки каждой серии с желатином должны вместе содержать столько же колоний, сколько первая, а вторая должна содержать примерно вдвое больше, чем третья, и так далее.

2. Качественный анализ. —

Сбор пробы. — Проба воды, необходимая для рутинного исследования, которое удобно рассмотреть в первую очередь, составляет около 110 см³. Ее собирают способом, описанным ранее (см. стр. 416); используются аналогичные бутыли, и если заполнить четыре из них, то суммарное содержимое, составляющее около 240 см³, обеспечит достаточный материал как для качественного, так и для количественного анализа. Если исследование не может быть начато немедленно, необходимо использовать ледник, иначе водные бактерии и другие сапрофиты, вероятно, будут размножаться за счет микробов, указывающих на загрязнение, и тем самым увеличат трудности исследования.

При рутинном исследовании водоснабжения принято ограничивать качественный анализ поиском

A. B. coli и ее близких родственников.

B. Стрептококков,

организмов, которых часто называют индикаторными микробами, так как их присутствие считается доказательством загрязнения воды материалом, происходящим из пищеварительного тракта млекопитающих, и, таким образом, представляет собой сигнал опасности.

C. Некоторые исследователи до сих пор придают значение присутствию B. enteritidis sporogenes, но поскольку поиск этой бактерии (относительно редкой в воде) требует сбора довольно большого количества воды, она обычно не включается в рутинное исследование.

В случае проб воды, исследуемых во время эпидемии, новых источников водоснабжения и неизвестных вод, поиск расширяется, охватывая других представителей группы кишечной палочки — тифа; и иногда может потребоваться исследование вопроса о присутствии или отсутствии Vibrio choleræ или (реже) таких бактерий, как B. anthracis или B. tetani.

Когда в воде присутствуют патогенные или экскрементальные бактерии, их количество относительно невелико из-за разбавления, которому они подверглись, и при начале исследования обычно принято применять один из следующих методов:

A. Обогащение, при котором безвредные непатогенные бактерии могут быть уничтожены или их рост подавлен, в то время как рост паразитических бактерий поощряется.

Это достигается путем такой организации среды (т. е. среды, температуры инкубации и атмосферы), чтобы способствовать росту патогенных организмов за счет безвредных сапрофитов.

B. Концентрирование, при котором все бактерии, присутствующие в пробе воды, патогенные или иные, концентрируются в небольшом объеме жидкости.

Это обычно осуществляется путем фильтрации пробы воды через фарфоровую фильтровальную свечу и последующей эмульсией бактериального осадка, оставшегося на стенках свечи, с небольшим отмеренным количеством стерильного бульона.

A. Метод обогащения.

(Работа с демонстрацией бактерий кишечного происхождения.)

Необходимая аппаратура (Предварительный этап):

Incubator running at 42° C.

Case of sterile pipettes, 1 c.c. graduated in tenths.

Case of sterile pipettes, 10 c.c. graduated in c.c.

Case of sterile pipettes, graduated to deliver 25 c.c.

Tubes of bile salt broth (vide page 180).

Flask of double strength bile salt broth (vide page 199).

Tubes of litmus silk.

Sterile flasks, 250 c.c. capacity.

Buchner's tubes.

Tabloids pyrogallic acid.

Tabloids sodium hydrate.

Bunsen burner.

Grease pencil.

(Более поздний этап):

Incubator running at 37° C.

Surface plates of nutrose agar (see page 232).

Aluminium spreader.

Tubes of various media, including carbohydrate media.

Agglutinating sera, etc.

Метод. —

1. Пронумеруйте набор пробирок с желчным бульоном от 1 до 5 и дублирующий набор от 1a до 5a.

2. Пронумеруйте одну колбу 7, а другую 8.

3. В пробирки № 1 и 1a добавьте 0,1 см³ пробы воды.

В пробирки № 2 и 2a добавьте 1 см³ пробы воды.

В пробирки № 3 и 3a добавьте 2 см³ пробы воды.

В пробирки № 4 и 4a добавьте 5 см³ пробы воды.

В пробирки № 5 и 5a добавьте 10 см³ пробы воды.

4. Поместите все пробирки в пробирки Бухнера и инкубируйте анаэробно при 42° C.

Примечание. — Среда с желчными солями особенно подходит для культивирования бактерий кишечного происхождения и в то же время подавляет рост бактерий, происходящих из других источников.

Анаэробные условия также способствуют размножению кишечных бактерий, а также их ферментативной активности. Температура 42° C уничтожает обычные водные бактерии и подавляет рост многих обычных мезофильных бактерий.

5. Отпипетируйте 25 см³ желчного бульона двойной концентрации в колбу 6 и 50 см³ желчного бульона двойной концентрации в колбу 7.

6. Отпипетируйте 25 см³ пробы воды в колбу 6 и 50 см³ пробы воды в колбу 7.

7. Инкубируйте обе колбы аэробно при 42° C.

8. После двадцати четырех часов инкубации отметьте в каждой культуре:

a. Наличие или отсутствие видимого роста.

b. Реакцию среды, как указано изменением цвета, если таковое произошло с лакмусом.

c. Наличие или отсутствие газообразования, на что указывает пена на поверхности среды и скопление газа во внутренней «газовой» трубке.

9. Верните те пробирки, которые не показывают признаков роста, в инкубатор. Исследуйте через еще один период в двадцать четыре часа (всего сорок восемь часов инкубации) в отношении тех же пунктов.

10. Выньте культуральные пробирки, которые показывают видимый рост, из пробирок Бухнера, независимо от того, присутствуют ли образование кислоты и газообразование.

11. Исследуйте все пробирки, которые показывают рост, с помощью препаратов «висячая капля». Отметьте те, которые показывают наличие цепочек кокков.

12. Приготовьте поверхностные чашечные культуры на нутрозо-агаре из каждой пробирки, которая показывает рост макроскопически или микроскопически, и инкубируйте в течение двадцати четырех часов аэробно при 37° C.

13. Исследуйте рост на чашках невооруженным глазом или с помощью небольшой ручной лупы. Практика облегчит распознавание колоний группы кишечной палочки, группы тифа и группы паратифа; а также тех, которые обусловлены ростом стрептококков. Исследование с этого этапа идет по двум расходящимся направлениям — первое касается идентификации бацилл — тифозных бацилл, второе — идентификации кокков.

A. B. Coli и ее союзники.

14. Отберите колиформные или тифоформные колонии; сделайте пересевы штрихом или мазком на питательный агар; инкубируйте аэробно в течение двадцати четырех часов при 37° C.

15. Тщательно исследуйте рост в каждой пробирке как макроскопически, так и микроскопически. Если рост нечистый, сделайте пересев на нутрозо-агар, отберите колонии и снова сделайте пересев. Когда рост в пробирке чистый, добавьте 5 см³ стерильного физиологического раствора или стерильного бульона и эмульгируйте им весь поверхностный рост.

16. Используйте эмульсию для приготовления серии пересевов на перечисленных ниже средах, используя обычную петлю для пересевов на твердые среды, но добавляя одну десятую кубического сантиметра эмульсии в каждую из жидких сред с помощью стерильной пипетки.

Gelatine streak.

Agar streak.

Potato.

Nutrient broth.

Litmus milk.

Dextrose peptone solution.

Lævulose peptone solution.

Galactose peptone solution.

Maltose peptone solution.

Lactose peptone solution.

Saccharose peptone solution.

Raffinose peptone solution.

Dulcite peptone solution.

Mannite peptone solution.

Glycerin peptone solution.

Inulin peptone solution.

Dextrin peptone solution.

17. Дифференцируйте бациллы после выделения с помощью их культуральных реакций и биологических характеристик на представителей:

I. Группа Эшериха.

B. coli communis.

B. coli communior.

B. lactis aerogenes.

B. cloacæ.

II. Группа Гертнера.

Bacillus enteritidis (of Gærtner).

B. paratyphosus A.

B. paratyphosus B.

Bacillus choleræ suum.

III. Группа Эберта.

B. typhosus.

B. dysenteriæ (Shiga).

B. dysenteriæ (Flexner).

B. fæcalis alcaligines.

18. Подтвердите эти результаты путем тестирования выделенных организмов против специфических агглютинирующих сывороток, полученных от экспериментально инокулированных животных.

Если при использовании этого метода получен положительный результат, требуется лишь простой расчет, чтобы определить наименьшее количество (до 0,1 см³) пробы, которое содержит по крайней мере один из индикаторных микробов. Например, если рост происходит во всех пробирках от 4 до 10, и этот рост впоследствии оказывается обусловленным размножением B. coli, то из этого следует, что по крайней мере одна кишечная палочка присутствует в каждых 10 см³ пробы воды, но не в каждых 5 см³. Если, с другой стороны, присутствие B. coli может быть доказано только в колбе № 7, то среднее количество кишечных палочек, присутствующих в пробе, составляет по крайней мере одну на каждые 50 см³ (т. е. двадцать на литр), но не одну на каждые 25 см³, и так далее.

Общая схема метода идентификации представителей группы кишечной палочки — тифа приведена в форме аналитической схемы, в то время как полные дифференциальные детали изложены в табличной форме.

АНАЛИТИЧЕСКАЯ СХЕМА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ГРУПП КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ И ТИФА.

B. Стрептококки.

19. Pick off streptococcus colonies and subcultivate upon nutrient agar
exactly as directed in steps 14, 15 and 16.

20. Дифференцируйте выделенные стрептококки на представителей сапрофитной группы короткоцепочечных кокков или представителей паразитической (патогенной) группы длинноцепочечных кокков с помощью их культуральных характеристик и запишите их численную частоту способом, указанным для представителей группы кишечной палочки — тифа.

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ТАБЛИЦА ГРУППЫ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ — ТИФА

  Motility Dextrose Lævulose Galactose Maltose Lactose Sacchrarose Raffinose Dextrin
A = acid reaction

G = gas formation  A G A G A G A G A G A G A G A G
The Escherich Group. 
 B. coli communis + + + + + + + + + + + O + + + +
 B. coli communior + + + + + + + + + + + + + + + + +
 B. lactis aerogenes - + + + + + + + + + + O O + +
 B. acidi lactici - + + + + + + + + + + O O O
 B. pneumoniæ - + + + + + + + + + + + + + + + +
 B cloaceæ(A) + + + + + + + + + + + + + + + + +
The Gærtner Group. 
 B. enteritidis + + + + + + + + + O O O O
 B. paratyphosus A + + + + + + + + + O O O O
 B. paratyphosus B + + + + + + + + + O O O O
 B. choleræ suum + + + + + + + + + O O  O
 B. suipestifer + + + + + + + + + O O  O
The Eberth Group. 
 B. typhosus + + + + + O O O +
 B. dysenteriæ (Shiga) - + + + O O O O O
 B. dysenteriæ (Flexner) - + + + + O O ± O
 B. fæcalis alkaligines + O O O O O O O O
 Table Notes:(B) (C)  

  Inulin Salicin Glycerine Dulcite Mannite Sorbite IndolLitmus Milk
A=acid reaction G=gas formation A G A G A G A G A G A G   Early Late
The Escherich Group  
B. coli communis O O + + + + + + + + + + + C
B. coli communior O O + + + + + + + + + + + C
B. lactis aerogenes O O O O + + + + - + + C
B. acidi lactici O O O + + + + + + + + + C
B. pneumoniæ O O + + + + + + + + - + + C
B cloaceæ[A] O O + + O + + - + + + + C
The Gærtner Group.  
B. enteritidis O O O + + + + + + - ± -
B. paratyphosus A O ± O + + + + + + - + O
B. paratyphosus B O O O + + + + + + - + -
B. choleræ suum O O O O O + + ± + -
B. suipestifer O O O + + + + + + - + -
The Eberth Group.  
B. typhosus O O O O + + - + +
B. dysenteriæ (Shiga) O O O O O O - + -
B. dysenteriæ (Flexner) O O O O + O ± + -
B. fæcalis alkaligines O O O O O O - - -
Table Notes:    (D) (E)

Примечания к таблице:

(A) * Разжижает желатин.

(B) + = подвижный. - = неподвижный.

(C) + = образование кислоты или газа. ± = слабое образование кислоты. O = без изменений.

(D) + = образование индола. ± = слабое образование индола. - = индол не образуется.

(E) + = образование кислоты. - = образование щелочи. O = без изменений в реакции. C = сгусток.

21. Определите патогенность для мышей (подкожная инокуляция) и кроликов (внутривенная инокуляция) выделенных стрептококков.

На противоположной вставной странице воспроизведен бланк из «Лабораторной книги анализа воды» автора, с помощью которого можно вести точный учет с минимумом усилий для каждой исследованной пробы.

B. Метод концентрирования.

Остальные организмы, упомянутые на стр. 426, удобнее искать методом концентрирования.

Сбор пробы. — Количество воды, необходимое для этого метода исследования, составляет около 2000 см³, и сосудом, обычно выбираемым для ее приема, является обычная бутыль из синего стекла емкостью в одну кварту (Винчестер), стерилизованная в сухожаровом шкафу, поверх которой надевается бумажный или пергаментный колпачок, закрепленный шнурком. Бутыль может быть упакована в деревянный ящик или в обычную плетеную корзину. Метод сбора пробы идентичен описанному в разделе «Количественный анализ»; однако нет такой настоятельной необходимости упаковывать пробу в лед для транспортировки в лабораторию.

Необходимая аппаратура:

Стерильная «белая» фарфоровая фильтровальная свеча Шамберлана или Доултона с открытым горлышком, снабженная резиновой прокладкой.

Резиновая пробка для горлышка фильтровальной свечи, с одним отверстием.

Kitasato serum flask, 2500 c.c. capacity.

Воздушный насос Герика или водоструйный насос.

Склянка Вульфа, оснащенная как промывная склянка и содержащая серную кислоту (для выполнения функции предохранительного клапана между фильтром и насосом).

Напорные трубки, зажимы, винтовой зажим.

Штатив с кольцом и зажимом.

Резиновая пробка для горлышка бутыли Винчестера, с двумя отверстиями, оснащенная одним отрезком прямой стеклянной трубки длиной 6 см и одним V-образным куском стеклянной трубки, одно плечо которого имеет длину 32 см, другое — 52 см, причем более короткое плечо заткнуто ватой. Резиновая пробка должна быть простерилизована кипячением, а стеклянные трубки — горячим воздухом перед использованием.

Колба, содержащая 250 см³ стерильного бульона.

Ершик для пробирок, подходящий к просвету свечи, заключенный в стерильную пробирку (и предварительно простерилизованный сухим жаром или кипячением).

Case of sterile pipettes, 10 c.c. in tenths.

Case of sterile pipettes, 1 c.c. in tenths.

Case of sterile pipettes, 1 c.c. in hundredths.

Пробирки с различными питательными средами (в соответствии с требованиями).

Двенадцать пробирок Бухнера с резиновыми пробками.

Таблетки пирогалловой кислоты.

Таблетки каустической соды.

Fig. 209.—Water filtering apparatus. That portion of the
figure to the left of the vertical line is drawn to a larger scale than
that on the right, in order to show details of Sprengel's pump.

Метод. —

1. Соберите фильтровальный аппарат, как показано на прилагаемой схеме (рис. 209), поместив промывную склянку с серной кислотой между фильтровальной колбой и нагнетательным насосом (в положении, занимаемом на схеме центральной вертикальной линией), и поместив еще один винтовой зажим на резиновую трубку, соединяющую боковой отвод фильтровальной колбы с промывной склянкой.

Fig. 210. Sterile test-tube brush.

2. Отфильтруйте все 2000 см³ воды через фильтровальную свечу.

3. Когда фильтрация завершена, закрутите зажимы и тем самым перекройте два отрезка напорной трубки.

4. Поменяйте положение стеклянных трубок в склянке Вульфа так, чтобы трубка, ближайшая к воздушному насосу, теперь погружалась в серную кислоту.

5. Медленно откройте металлические зажимы и позвольте воздуху постепенно пройти через кислоту и войти в фильтровальную колбу, тем самым восстановив давление.

6. Разберите аппарат, выньте пробку из горлышка свечи.

7. Отпипетируйте 10 см³ стерильного бульона внутрь свечи и с помощью стерильного ершика для пробирок (рис. 210) эмульгируйте слизистый осадок, выстилающий свечу, с бульоном.

Практически все бактерии, содержавшиеся в исходных 2000 см³ воды, теперь суспендированы в 10 см³ бульона, так что 1 см³ суспензии эквивалентен, с точки зрения содержащихся организмов, 200 см³ исходной воды. (Некоторые бактерии, конечно, останутся на стенках фильтра и в его порах.)

До этого момента метод идентичен, независимо от конкретного организма, присутствие которого желательно продемонстрировать; но с этого момента методы должны быть специально адаптированы для выделения определенных групп организмов или отдельных бактерий.

Группа кишечной палочки — тифа. —

1. Пронумеруйте девять пробирок с желчным бульоном (см. стр. 180) последовательно от 1 до 9.

2. В № 1 добавьте 1 см³ } исходной пробы воды 2 добавьте 2 см³ } до начала фильтрации. 3 добавьте 5 см³ }

3. В оставшиеся пробирки с желчным бульоном добавьте различные количества суспензии с помощью подходящих градуированных стерильных пипеток следующим образом:

№ 4 0,05 см³ (эквивалентно 10 см³ исходной пробы воды). № 5 0,125 см³ (эквивалентно 25 см³ исходной пробы воды). № 6 0,25 см³ (эквивалентно 50 см³ исходной пробы воды). № 7 0,5 см³ (эквивалентно 100 см³ исходной пробы воды). № 8 1,0 см³ (эквивалентно 200 см³ исходной пробы воды). № 9 2,5 см³ (эквивалентно 500 см³ исходной пробы воды).

4. Поместите каждую пробирку анаэробно в пробирку Бухнера и инкубируйте при 42° C.

5. Последующие шаги идентичны описанным в методе обогащения (см. стр. 428–431; шаги 8–18).

Альтернативные методы. —

Некоторые из старых методов выделения представителей групп кишечной палочки — тифа упоминаются, но они значительно уступают уже описанным.

(A) Карболовый метод:

1. Возьмите десять пробирок с карболизованным бульоном (см. стр. 202) и пронумеруйте их последовательно от 1 до 10.

2. Инокулируйте каждую пробирку разным количеством пробы воды или суспензии, как в предыдущем методе.

3. Инкубируйте аэробно при 37° C.

4. Исследуйте культуральные пробирки после двадцати четырех часов инкубации.

5. Из тех пробирок, которые показывают признаки роста, залейте чашки обычным способом, используя карболизованный желатин (см. стр. 202) вместо обычного желатина, и инкубируйте при 20° C в течение трех, четырех или пяти дней, как может потребоваться.

6. Сделайте пересев из любых колоний, которые появляются, и определите их идентичность по линиям, изложенным в предыдущем методе.

(B) Метод Париетти:

1. Возьмите девять пробирок с бульоном Париетти (см. стр. 202) — т. е. по три из тех, которые содержат 0,1 см³, 0,2 см³ и 0,5 см³ раствора Париетти соответственно. Четко отметьте на внешней стороне каждой пробирки количество раствора Париетти, которое она содержит.

2. В каждую пробирку добавьте разное количество исходной воды или суспензии и инкубируйте при 37° C.

3. Исследуйте культуральные пробирки после двадцати четырех и сорока восьми часов инкубации и сделайте посев на питательный карболизованный или картофельный желатин из тех, в которых произошел рост.

4. Отберите подозрительные колонии, если таковые появятся на чашках, сделайте пересев на различные среды и идентифицируйте их.

(C) Метод Эльснера: Этот метод просто заключается в замене обычного питательного желатина картофельным желатином Эльснера (см. стр. 204) в любом из ранее упомянутых методов.

(D) Метод свечи Камбье:

Обработайте большой объем пробы воды методом концентрирования (см. стр. 434).

1. Снимите резиновую пробку с горлышка фильтровальной свечи, введите 10 см³ стерильного бульона внутрь и эмульгируйте бактериальный осадок; снова заткните горлышко свечи ватным тампоном из стерильной ваты.

2. Выньте фильтровальную свечу из фильтровальной колбы и вставьте ее в горлышко колбы или стеклянного цилиндра, содержащего стерильный бульон в количестве, достаточном, чтобы достичь почти резиновой прокладки на свече.

3. Инкубируйте в течение двадцати четырех — тридцати шести часов при 37° C.

4. Из помутневшего бульона в стеклянном цилиндре залейте желатиновые чашки и инкубируйте при 20° C.

5. Сделайте пересев и идентифицируйте любые подозрительные колонии, которые появятся.

(Метод основан на предположении, что представители групп тифа и кишечной палочки проникают через фарфоровый фильтр изнутри в окружающий бульон с более высокой скоростью, чем сопутствующие бактерии.)

B. Enteritidis Sporogenes. —

1. Перенесите 5 см³ эмульсии из фильтровальной свечи в стерильную пробирку и тщательно заткните пробкой.

2. Поместите пробирку внутрь бензольной бани, используемой для выделения спорообразующих организмов (см. стр. 257), и подвергните воздействию температуры 80° C в течение двадцати минут.

3. Пронумеруйте десять пробирок с лакмусовым молоком последовательно от 1 до 10.

4. Выньте пробирку из бензольной бани и хорошо встряхните, чтобы равномерно распределить споры по жидкости.

5. В каждую пробирку с лакмусовым молоком добавьте отмеренное количество суспензии, соответствующее количествам, используемым при выделении группы кишечной палочки (см. стр. 437).

6. Инкубируйте каждую пробирку анаэробно при 37° C. Анаэробные условия могут быть получены путем помещения культур в пробирки Бухнера или в аппарат Буллока. Если, однако, при приготовлении лакмусового молока использовалось цельное молоко, слоя сливок, который поднимается на поверхность, будет достаточно для обеспечения анаэробиоза; в то время как если использовалось обезжиренное молоко, будет достаточно налить слой стерильного вазелина или жидкого парафина на поверхность жидкости.

7. Исследуйте после двадцати четырех часов инкубации. Отметьте (если присутствует B. enteritidis sporogenes) —

(a) Кислую реакцию среды, на что указывает цвет лакмуса или его полное обесцвечивание.

(b) Наличие свертывания и отделение прозрачной сыворотки.

(c) Наличие газа, на что указывают трещины и пузырьки в коагуляте, и, возможно, массы коагулята, вытесненные вверх по пробирке почти до пробки.

8. Верните пробирки, которые не показывают признаков роста, в инкубатор на дополнительный период в двадцать четыре часа и снова исследуйте в отношении тех же пунктов.

9. Выньте те пробирки, которые дают признаки роста, из пробирок Бухнера и осторожно отпипетируйте сыворотку; исследуйте сыворотку микроскопически.

10. Инокулируйте двух морских свинок подкожно по 0,5 см³ сыворотки и наблюдайте за результатом.

Vibrio Choleræ. —

1. Пронумеруйте десять пробирок с пептонной водой последовательно от 1 до 10.

2. В каждую из пробирок с пептонной водой добавьте отмеренное количество суспензии, соответствующее тем количествам, которые используются при выделении представителей группы кишечной палочки (см. стр. 437).

3. Инкубируйте аэробно при 37° C в течение двадцати четырех часов. Тщательно исследуйте пробирки на наличие видимого роста, особенно образования нежной пленки, которую при наличии следует исследовать микроскопически на наличие вибрионов, как с помощью окрашенных препаратов, так и с помощью свежих образцов с темнопольным освещением.

4. Инокулируйте свежие пробирки с пептонной водой из тех пробирок, которые проявляют образование пленки — из самой пленки — и инкубируйте при 37° C в течение двадцати четырех часов.

5. Протестируйте саму пептонную воду на присутствие индола и нитрита путем добавления чистой концентрированной H₂SO₄.

5. Приготовьте желатиновые и агаровые чашки обычным способом из тех пробирок, которые показывают образование пленки.

6. Отберите с чашек любые колонии, напоминающие колонии Vibrio choleræ, и сделайте пересев на все обычные лабораторные среды.

7. Протестируйте выделенный вибрион против сыворотки животного, иммунизированного к Vibrio choleræ, на агглютинацию.

B. Anthracis. —

1. Перенесите 5 см³ эмульсии из фильтровальной свечи в стерильную пробирку и тщательно заткните пробкой.

2. Поместите пробирку внутрь бензольной бани, используемой для выделения спорообразующих организмов (см. стр. 257), и подвергните воздействию температуры 80° C в течение двадцати минут.

3. Инокулируйте молодую белую крысу подкожно (на внутренней стороне одной из задних лап) 1 см³ эмульсии. Наблюдайте в течение жизни, и, если животное погибает, проведите полное патологоанатомическое вскрытие.

4. Расплавьте три пробирки с питательным агаром в кипящей воде и охладите до 42° C.

5. Пронумеруйте пробирки 1, 2 и 3. В № 1 добавьте 0,2 см³, в № 2 добавьте 0,3 см³ и в № 3 добавьте 0,5 см³ суспензии и залейте из них чашки.

6. Инкубируйте при 37° C в течение двадцати четырех или сорока восьми часов.

7. Отберите любые колонии, напоминающие колонии сибирской язвы, и сделайте пересев на все обычные лабораторные среды.

8. Инокулируйте другую молодую белую крысу, как в п. 3, используя две петли агарового пересева, эмульгированные в 1 см³ стерильного бульона. Наблюдайте в течение жизни, и если животное погибает, проведите полное патологоанатомическое вскрытие.

B. Tetani. —

1. Действуйте, как подробно описано выше в шагах 1 и 2 для выделения B. anthracis.

2. Добавьте 1 см³ суспензии в каждую из трех пробирок с глюкозо-формиатным бульоном и инкубируйте анаэробно в пробирках Бухнера при 37° C.

3. Из тех пробирок, которые показывают видимый рост (с образованием газа или без него) после двадцати четырех часов инкубации, инокулируйте морских свинок подкожно (под кожу живота), используя 0,1 см³ бульонной культуры в качестве дозы. Тщательно наблюдайте в течение жизни, и, если наступает смерть, проведите полное патологоанатомическое вскрытие.

4. Из тех же пробирок залейте агаровые чашки и инкубируйте анаэробно в аппарате Буллока при 37° C.

5. Сделайте пересев подозрительных колоний на различные среды, инкубируйте анаэробно, делая контрольные посевы на глюкозо-формиатный агар, уколом и штрихом, для инкубации аэробно, и проведите дальнейшие эксперименты по инокуляции с полученными культурами.

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОКА.

«Однокоровье» или «цельное» молоко, если оно взято от внешне здорового животного (то есть животного без каких-либо явных поражений вымени или сосков) с соблюдением обычных мер предосторожности в отношении чистоты, избегания пыли и т. д., содержит лишь немного организмов. При работе с молоком от одной коровы, от подозрительного или явно больного животного, полный анализ должен включать исследование (как качественное, так и количественное) проб (а) первой порции молока, (b) средней порции молока, (c) последних порций молока и, если возможно, из каждой четверти вымени. «Смешанное» молоко, с другой стороны, к тому времени, когда оно покидает руки розничного продавца, обычно содержит столько же микроорганизмов, сколько равный объем сточных вод, и, действительно, во время исследования с ним обращаются как с таковым.

Однако возможно собирать и хранить смешанное молоко настолько чисто, что его содержание микробов не превышает 5000 микроорганизмов на кубический сантиметр. Такая относительная свобода от посторонних бактерий обычно обеспечивается поставщиком только тогда, когда он прибегает к процессу пастеризации (нагревание молока до 65° C в течение двадцати минут или до 77° C в течение одной минуты) или более простому плану добавления консервантов в молоко. Информацию об использовании этих методов для уничтожения бактерий всегда следует искать в случае проб смешанного молока, и в этой связи следующие тесты окажутся полезными:

1. Сырое молоко (Сол).

К 10 см³ молока в пробирке добавьте 1 см³ 1-процентного водного раствора ортола (сульфата орто-метил-амино-фенола), недавно приготовленного, и перемешайте. Затем добавьте 0,2 см³ 3-процентного раствора перекиси водорода. Появление кирпично-красного цвета в течение 30 секунд указывает на сырое молоко. Молоко, нагретое до 74° C в течение тридцати минут, не претерпевает изменения цвета; если нагрето до 75° C только в течение десяти минут, кирпично-красный цвет появляется после стояния в течение около двух минут.

2. Борная кислота.

Evaporate to dryness, 50 c.c. of the milk which has been rendered
slightly alkaline to litmus, then incinerate.

Растворите в дистиллированной воде, добавьте небольшой избыток разбавленной соляной кислоты и снова выпарьте досуха.

Растворите остаток в небольшом количестве горячей воды и смочите этим раствором полоску куркумовой бумаги. Высушите куркумовую бумагу. Розовый или вишнево-красный цвет = бура или борная кислота.

3. Формальдегид (Хенер).

К 10 см³ молока в пробирке медленно добавьте 5 см³ концентрированной технической серной кислоты так, чтобы две жидкости не смешивались. Держите пробирку вертикально и очень осторожно перемешайте. Фиолетовая зона на границе двух жидкостей = формальдегид.

4. Перекись водорода.

К 10 см³ молока (разбавленного равным количеством воды) в пробирке добавьте 0,4 см³ 4%-го спиртового раствора бензидина и 0,2 см³ уксусной кислоты. Синее окрашивание смеси = перекись водорода.

5. Салициловая кислота.

Осадите казеиноген добавлением уксусной кислоты и отфильтруйте. К фильтрату добавьте несколько капель 1%-го водного раствора хлорида железа. Пурпурное окрашивание = салициловая кислота.

6. Карбонат или бикарбонат натрия.

К 10 см³ молока в пробирке добавьте 10 см³ спирта и 0,3 см³ 1%-го спиртового раствора розоловой кислоты. Коричневатый цвет = чистое молоко; розовый цвет = консервированное молоко.

Fig. 211.—Milk-collecting bottle and dipper in case.

Количественный анализ.—

Сбор пробы.—

Аппаратура, используемая для сбора розничной пробы смешанного молока, состоит из цилиндрического медного футляра высотой 16 см и диаметром 9 см, снабженного съемной крышкой, внутри которого находится мерная ложка для молока, также изготовленная из меди; а внутри него, в свою очередь, находится стеклянная бутыль с широким горлышком и пробкой емкостью около 250 см³ (высотой около 14 см и диаметром 7 см), имеющая на боковой стороне матовую пластинку для записей. Медный цилиндр и его содержимое, защищенные от тряски прокладкой из ваты, стерилизуются в сушильном шкафу (рис. 26).

При сборе пробы:

1. Снимите крышку с цилиндра.

2. Выньте вату.

3. Выньте бутыль вместе с мерной ложкой.

4. Наберите молоко стерильной мерной ложкой и перелейте его непосредственно в стерильную бутыль.

5. Внесите сведения, необходимые для идентификации образца, на пластинку с помощью карандаша или ручки с чернилами.

6. Упакуйте аппарат в ящик со льдом для отправки в лабораторию точно так же, как обычную пробу воды.

«Цельное» молоко можно с успехом собирать непосредственно в стерильную бутыль, так как горлышко достаточно широкое, чтобы доярка могла направить струю молока прямо в него.

Сгущенное молоко необходимо разбавить стерильной дистиллированной водой в соответствии с указаниями, напечатанными на этикетке, а затем обрабатывать как обычное молоко.

Необходимая аппаратура:

Case of sterile capsules (25 c.c. capacity).

Case of sterile graduated pipettes, 10 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).

Case of sterile graduated pipettes, 1 c.c. (in tenths of a cubic centimetre).

Flask containing 250 c.c. sterile bouillon.

Tall cylinder containing 2 per cent. lysol solution.

Plate-levelling stand.

Case of sterile plates.

Tubes nutrient gelatine or gelatine agar.

Tubes of wort gelatine.

Tubes of nutrient agar.

Water-bath regulated at 42° C.

Bunsen burner.

Grease pencil.

Метод.—

1. Расставьте четыре стерильные капсулы в ряд; пронумеруйте их I, II, III и IV.

2. Налейте 9 см³ стерильного бульона в первую капсулу и по 9,9 см³ бульона в каждую из трех оставшихся.

3. Возьмите 1 см³ молока из одной из бутылей с помощью стерильной пипетки и добавьте его в бульон в капсуле I; тщательно перемешайте путем многократного наполнения и опорожнения пипетки.

4. Возьмите 0,1 см³ молочного бульона из капсулы I, добавьте его в содержимое капсулы II и перемешайте, как прежде.

5. Таким же образом добавьте 0,1 см³ содержимого капсулы II в капсулу III, а затем 0,1 см³ содержимого капсулы III в капсулу IV.

Then 1 c.c. of dilution I contains 0.1 c.c. milk sample.

1 c.c. of dilution II contains 0.001 c.c. milk sample.

1 c.c. of dilution III contains 0.00001 c.c. milk sample.

1 c.c. of dilution IV contains 0.0000001 c.c. milk sample.

6. Расплавьте желатин и агар в пробирках в кипящей воде; затем перенесите на водяную баню и охладите до 42° C.

7. Пронумеруйте пробирки с желатином последовательно от 1 до 12.

8. Инокулируйте пробирки различными количествами материала следующим образом:

To tube No. 1 add 1.0 c.c. of the milk sample.

2 add 0.1 c.c. of the milk sample.

{ 3 add 1.0 c.c. from capsule I.

{ 4 add 0.1 c.c. from capsule I.

{ 5 add 1.0 c.c. from capsule II.

{ 6 add 0.1 c.c. from capsule II.

{ 7 add 0.5 c.c. from capsule III.

{ 8 add 0.3 c.c. from capsule III.

{ 9 add 0.2 c.c. from capsule III.

{ 10 add 0.5 c.c. from capsule IV.

{ 11 add 0.3 c.c. from capsule IV.

{ 12 add 0.2 c.c. from capsule IV.

9. Залейте чашки Петри из пробирок с желатином; подпишите и инкубируйте при 20° C.

10. Разжижьте пять пробирок с сусло-желатином и добавьте в них 1,0 см³ пробы молока и такое же количество разбавленного молока из капсул I, II, III и IV соответственно.

11. Залейте чашки Петри из сусло-желатина; подпишите и инкубируйте при 20° C.

12. Инокулируйте разжиженные пробирки с агаром следующим образом:

To tube No. 1 add 0.1 c.c. of the milk sample.

2 add 0.1 c.c. from capsule I.

3 add 0.1 c.c. from capsule II.

4 add 0.1 c.c. from capsule III.

5 add 1.0 c.c. from capsule IV. }

6 add 0.1 c.c. from capsule IV. }

13. Залейте чашки Петри из пробирок с агаром; подпишите и инкубируйте при 37° C.

14. После двадцати четырех часов инкубации «осмотрите», а после сорока восьми часов инкубации «подсчитайте» агаровые чашки и оцените количество «организмов, растущих при 37° C», присутствующих в одном кубическом сантиметре пробы молока.

15. После трех, четырех или пяти дней инкубации «подсчитайте» желатиновые чашки и оцените на их основе количество «организмов, растущих при 20° C», присутствующих в одном кубическом сантиметре пробы молока.

16. После аналогичного интервала «подсчитайте» чашки с сусло-желатином и оцените количество плесневых грибов и дрожжей, присутствующих в одном кубическом сантиметре пробы молока.

Примечание.—Многие исследователи предпочитают использовать желатин-агар (см. стр. 193) для количественного анализа. В этом случае следует заливать чашки с желатин-агаром из пробирок, содержащих количества материала, указанные на этапе 8, инкубировать при 28° C – 30° C и через пять дней регистрировать «общее количество организмов, развивающихся при 28° C».

Качественный анализ.—Качественное бактериологическое исследование молока направлено главным образом на обнаружение присутствия одной или нескольких из следующих патогенных бактерий и, при их наличии, на оценку их численной частоты.

Members of the Coli-typhoid group.

Vibrio choleræ.

Streptococcus pyogenes longus.

Micrococcus melitensis.

Staphylococcus pyogenes aureus.

Bacillus enteritidis sporogenes.

Bacillus diphtheriæ.

Bacillus tuberculosis.

Некоторые из них встречаются как случайные загрязнения, либо из водоснабжения молочной фермы, либо от работников фермы, в то время как другие попадают непосредственно от коровы.

При исследовании молока, как и при исследовании воды, доступны два метода, а именно: обогащение и концентрирование — первый используется для обнаружения бактерий кишечного происхождения, второй — для выделения микроорганизмов дифтерии и туберкулеза. Первым существенным моментом в последнем процессе является концентрирование бактериального содержимого большого объема пробы в малом объеме; но в случае молока вместо фильтрации применяется тщательное центрифугирование.

Необходимая аппаратура:

Большая центрифуга. Эта машина, чтобы быть действительно полезной при бактериологическом исследовании молока, должна соответствовать следующим требованиям:

1. Центрифуга должна быть такого размера и должна нести пробирки или бутыли такой емкости, чтобы можно было обрабатывать от 200 до 500 см³ молока за один раз.

2. Скорость центрифугирования должна составлять от 2500 до 3000 оборотов в минуту.

3. Часть машины, предназначенная для размещения пробирок, должна представлять собой металлический диск достаточного веса, чтобы обеспечить хорошее «инерционное» движение, продолжающееся в течение значительного периода времени. Другими словами, машина должна останавливаться очень постепенно и медленно после отключения движущей силы, тем самым предотвращая любое нарушение относительного положения твердых частиц в растворе, который центрифугируется.

4. Машина предпочтительно должна приводиться в действие электричеством или механическим приводом, но в случае ручных машин —

(а) Передача должна быть устроена так, чтобы необходимая скорость достигалась не более чем сорока или пятьюдесятью оборотами рукоятки в минуту, чтобы ее можно было поддерживать в течение двадцати или тридцати минут без чрезмерного напряжения.

(б) Используемая рукоятка должна быть снабжена специальным креплением (например, муфтой, подобной той, что используется для свободного хода велосипеда) или должна быть легко отсоединяемой, чтобы при прекращении вращения рукоятка своим весом и сопротивлением воздуха не действовала как тормоз и не останавливала машину слишком внезапно.

Одна из немногих удовлетворительных машин этого класса показана на рисунке 212.

Fig. 212.—Electrically driven centrifugal machine, with
flexible (broken) spindle encircled by the field magnets of the motor.

Стерильные центрифужные пробирки емкостью около 60-70 см³, сужающиеся к закрытому концу, закрытые ватными пробками.

Малая центрифуга для работы с двумя пробирками емкостью 10 см³ при 2500–3000 оборотах в минуту, предпочтительно с электрическим приводом, типа изображенного на стр. 327 (рис. 162).

Стерильные центрифужные пробирки емкостью 10 см³ с дистальным концом, суженным в узкую трубку и градуированным в сотых долях кубического сантиметра (рис. 213).

Стерилизованный пробочник.

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths of a cubic
centimetre).

Case of sterile pipettes, 1 c.c. (in tenths of a cubic
centimetre).

Стерильные пипетки с резиновой грушей.

Колба со стерильным физиологическим раствором.

Метод.—

1. Налейте по 50 см³ пробы молока в каждую из четырех пробирок, замените ватные пробки сплошными резиновыми пробками (стерилизованными кипячением) и установите пробирки в центрифугу.

Примечание.—Один или два кубических сантиметра жидкого парафина, введенные в стаканы центрифуги перед установкой стеклянных пробирок, исключат риск поломки последних.

Fig. 213.—Milk sedimenting tubes.

Fig. 214.—Milk in centrifuge tube.

2. Центрифугируйте пробу молока в течение тридцати минут со скоростью 2500 оборотов в минуту.

3. Отключите движущую силу и дайте машине постепенно замедлиться.

4. Выньте пробирки с молоком из центрифуги. Каждая пробирка теперь будет показывать (рис. 214):

(а) Поверхностный слой сливок (варьирующийся по толщине в разных пробах), спрессованный в полутвердую массу, в которой можно обнаружить некоторое количество организмов и несколько лейкоцитов.

(б) Центральный слой отделенного молока, жидкий, водянистый и опалесцирующий, содержащий крайне мало бактерий.

(в) Осадок или отложение, состоящее из подавляющего большинства содержащихся бактерий и лейкоцитов, вместе с посторонними веществами, такими как грязь, волосы, эпителиальные клетки, фекальные остатки и т. д.

5. Выньте резиновую пробку и извлеките центральную часть сливок из каждой пробирки с помощью стерильного пробочника; поместите эти массы сливок в две стерильные капсулы. Подпишите C1 и C2.

6. Удалите все, кроме последних одного или двух см³ отделенного молока из каждой пробирки с помощью стерильных пипеток.

7. Тщательно перемешайте осадки с остаточным молоком, перенесите смесь из каждой пары пробирок в одну стерильную пробирку емкостью 10 см³ (градуированную) с помощью стерильных пипеток с грушей, затем доведите до отметки 10 см³ стерильным физиологическим раствором и перемешайте. Подпишите D1 и D2.

8. Поместите две пробирки со смешанным осадком в центрифугу, уравновесьте их добавлением или удалением физиологического раствора так, чтобы они точно соответствовали друг другу, и центрифугируйте в течение десяти минут.

Примечание.—Каждая пробирка теперь содержит осадок из 100 см³ пробы молока, и количество можно считать в сотых долях сантиметра. Умножение этой цифры на 100 даст количество «видимых загрязнений» в «частях на миллион» — обычный метод регистрации этого качества молока.

9. Отпипетируйте всю надосадочную жидкость и переверните пробирку, чтобы она стекла на прокладку из стерилизованной ваты, находящуюся в стакане. (Эта вата впоследствии сжигается.)

10. Исследуйте как сливки (C1), так и осадок (D1) микроскопически —

(а) В препаратах «висячая капля».

(б) В мазках, окрашенных карболовым метиленовым синим, по методу Грама, по методу Нейссера и по методу Циль-Нильсена.

Отметьте наличие или отсутствие измененных и неизмененных растительных волокон; гнойных клеток, кровяных телец; кокков в группах или цепочках, дифтероидных палочек, грамотрицательных палочек или кокков, спор и кислотоустойчивых бактерий.

11. Приспособьте заключительные этапы исследования к особым требованиям каждой отдельной пробы, таким образом:

1. Члены группы кишечной и тифозной палочек.—

1. Эмульгируйте осадок из второй центрифужной пробирки (D2) с 10 см³ стерильного бульона и инокулируйте три пробирки с бульонной средой с желчными солями следующим образом:

To Tube No. 1 add 2.5 c.c. milk deposit emulsion (=25 c.c. original milk.)

To Tube No. 2 add 1.0 c.c. milk deposit emulsion (=10 c.c. original milk.)

To Tube No. 3 add 0.5 c.c. milk deposit emulsion (= 5 c.c. original milk.)

2. Инокулируйте пробирку с бульонной средой с желчными солями № 4 1 см³ исходного молока.

3. Инокулируйте дополнительные пробирки с бульонной средой с желчными солями предварительно приготовленными разведениями (см. стр. 445) следующим образом:

To tube No. 5 add 1.0 c.c. from capsule I.

To tube No. 6 add 0.1 c.c. from capsule I.

To tube No. 7 add 1.0 c.c. from capsule II.

To tube No. 8 add 0.1 c.c. from capsule II.

To tube No. 9 add 1.0 c.c. from capsule III.

To tube No. 10 add 0.1 c.c. from capsule III.

To tube No. 11 add 1.0 c.c. from capsule IV.

To tube No. 12 add 0.1 c.c. from capsule IV.

и инкубируйте анаэробно (в пробирках Бухнера) при 42° C в течение максимального периода сорока восьми часов.

4. Если рост происходит, завершите исследование, как подробно описано в соответствующем разделе исследования воды (см. стр. 428–431).

Примечание.—B. coli communis, происходящая из кишечных выделений коровы, почти повсеместно присутствует в больших или малых количествах в розничном молоке. Поэтому ее обнаружение, если только не в огромных количествах (когда это указывает на отсутствие чистоты), имеет малое значение.

2. Vibrio Choleræ.—Инокулируйте пробирки с пептонной водой, используя те же количества, что и при поиске членов групп кишечной и тифозной палочек (см. выше 1–3); инкубируйте аэробно при 37° C и завершите исследование, как подробно описано в соответствующем разделе исследования воды (см. стр. 439).

3. B. Enteritidis Sporogenes.—Инокулируйте пробирки с лакмусовым молоком такими же количествами, как те, что использовались в предыдущих поисках, пропуская пробирку № 1 (см. выше 1–3), поместите в дифференциальный стерилизатор при 80° C на десять минут, а затем инкубируйте анаэробно при 37° C в течение максимального периода сорока восьми часов. Завершите исследование, как подробно описано в соответствующем разделе исследования воды (см. стр. 438).

4. B. Diphtheriæ.—

(А) 1. Посейте три серии последовательных культур, по двенадцать пробирок в каждой серии, из (а) сливок C2, (б) осадка D1 на скошенную свернутую сыворотку крови и инкубируйте при 37° C.

2. Снимите любые подозрительные колонии, которые могли появиться через двенадцать часов после инкубации, исследуйте микроскопически и пересейте на сыворотку крови и поместите в инкубатор; верните исходные пробирки в инкубатор.

3. Повторите это после восемнадцати часов инкубации.

4. Из полученных культур сделайте мазки на покровных стеклах и окрасьте карболовым метиленовым синим, по методу Нейссера, по методу Грама. Пересейте те, которые кажутся состоящими из дифтерийных палочек, в раствор глюкозо-пептона. Отметьте те, в которых происходит образование кислоты.

5. Инокулируйте морских свинок подкожно одним или двумя кубическими сантиметрами сорокавосьмичасовой культуры на глюкозном бульоне, полученной из первого пересева каждого ферментатора глюкозы, и наблюдайте за результатом.

6. Если наступает смерть, по-видимому, от дифтерийной токсемии, инокулируйте еще двух морских свинок таким же количеством летальной культуры. Оставьте одно животное в качестве контроля, а другому введите 1000 единиц противодифтерийной сыворотки. Если контрольное животное умирает, а леченое выживает, доказательство идентичности выделенного организма с палочкой Клебса-Леффлера становится абсолютным.

7. Инокулируйте морских свинок подкожно фильтрованными культурами на глюкозном бульоне (токсины?) и наблюдайте за результатом.

(Б) 1. Эмульгируйте остаток осадка с 5 см³ стерильного бульона и инокулируйте двух морских свинок, таким образом: морская свинка «а» — подкожно 1 см³ эмульсии; морская свинка «б» — подкожно 2 см³ эмульсии; и наблюдайте за результатом.

2. Если одно или оба инокулированных животных погибают, произведите полное вскрытие и попытайтесь выделить патогенные организмы из местного поражения. Подтвердите их идентичность, как в A5 и 6 (см. выше).

5. Bacillus Tuberculosis.—

(А) 1. Инокулируйте каждую из трех морских свинок (предварительно проверенных туберкулином, чтобы доказать их свободу от спонтанного туберкулеза) подкожно во внутреннюю сторону сгиба левого колена 1 см³ эмульсии осадка, оставшейся в той или иной пробирке (D1 или D2).

2. Введите небольшое количество сливок в подкожный карман, подготовленный на внутренней стороне сгиба правого колена каждого из этих трех животных. Наложите на рану герметичную повязку.

3. Тщательно наблюдайте и точно взвешивайте каждый день.

4. Умертвите одну морскую свинку в конце второй недели и произведите полное вскрытие.

5. Если результат исследования отрицательный или неубедительный, умертвите вторую морскую свинку в конце третьей недели и тщательно исследуйте.

Fig. 215.—Cadaver of guinea-pig experimentally infected
with B. tuberculosis.

6. Если результат по-прежнему отрицательный или неубедительный, умертвите третью морскую свинку в конце шестой недели. Произведите тщательное вскрытие. Исследуйте материал из любых казеозных желез микроскопически и обильно инокулируйте на яичную среду Дорсета.

Примечание.—Каждое вскрытие животных, зараженных туберкулезным материалом, должно включать осмотр невооруженным глазом и микроскопическое исследование подколенных, поверхностных и глубоких паховых, подвздошных, поясничных и подмышечных желез с каждой стороны тела, а также запеченочных, бронхиальных и грудинных желез, селезенки, печени и легких (рис. 215).

(Б) 1. Тщательно смешайте все имеющиеся сливки и осадок из пробы молока и перенесите в стерильную колбу Эрленмейера.

2. Обработайте смесь методом антиформина (см. Приложение, стр. 502).

3. Инокулируйте каждую из двух морских свинок внутрибрюшинно половиной полученной эмульсии.

4. Умертвите одну из морских свинок в конце первой недели и тщательно исследуйте.

5. Умертвите вторую морскую свинку в конце второй недели и тщательно исследуйте.

6. Используйте остаток осадка для микроскопического исследования и культивирования на яичной среде Дорсета.

Примечание.—Результат микроскопического исследования на наличие B. tuberculosis не имеет никакой ценности, если он не подтвержден результатами экспериментов по инокуляции.

6. Streptococcus Pyogenes Longus.—

(А) 1. Сделайте последовательные поверхностные посевы на нутрозо-агар. Также сделайте последовательные посевы на скошенный питательный агар (шесть пробирок в серии).

2. Если полученный рост показывает колонии, которые напоминают колонии стрептококка, сделайте пересевы на агар и в бульон в первую очередь и тщательно изучите.

(Б) 1. Посейте большую петлю осадка D2 в каждую из трех пробирок с глюкозо-формиатным бульоном и инкубируйте анаэробно (в пробирках Бухнера) в течение двадцати четырех часов при 37° C.

2. Если полученный рост напоминает рост стрептококка, сделайте пересевы на питательный агар.

3. Подготовьте пересевы любых подозрительных колоний, которые появляются, на все обычные среды и тщательно изучите.

Если стрептококк успешно выделен, инокулируйте культуры из сывороточного бульона мыши, морской свинке и кролику, чтобы определить его патогенность и вирулентность.

7. Staphylococcus Pyogenes Aureus.—

1. Тщательно исследуйте рост на последовательных культурах на сыворотке крови, подготовленных для выделения B. diphtheriæ, и последовательных культурах на агаре для выделения стрептококков после сорока восьми часов инкубации.

2. Снимите любые подозрительные оранжевые колонии, посейте на скошенный агар и инкубируйте при 20° C. Наблюдайте за образованием пигмента.

3. Подготовьте пересевы из любых подозрительных культур на все обычные среды, тщательно изучите и исследуйте их патогенность.

8. Micrococcus Melitensis.—Молоко от животного, зараженного M. melitensis, обычно содержит организмы в больших количествах и лишь немногие другие бактерии.

1. Сделайте несколько серий поверхностных посевов на нутрозо-агар, каждый из одной петли осадка в пробирке D1 или D2.

2. Сделайте несколько серий поверхностных посевов на нутрозо-агар, каждый из одной капли исходной пробы молока.

3. Инкубируйте аэробно при 37° C и осматривайте ежедневно до конца десяти дней.

4. Снимите подозрительные колонии, исследуйте их микроскопически и пересейте на нутрозо-агар в пробирках; на глюкозный агар и в лакмусовое молоко.

5. Проверьте последующий рост против сыворотки экспериментального животного, инокулированного против M. melitensis, чтобы определить его агглютинируемость.

6. Если это по-видимому M. melitensis, инокулируйте культуру с нутрозо-агара после трех дней инкубации внутричерепно морской свинке.

МОРОЖЕНОЕ.

Сбор пробы.—

1. Возьмите пробу из барабана черпаком или ложкой, которой продавец торгует мороженым, и немедленно поместите ее в стерильную медную капсулу, подобную той, что используется для проб почвы (см. стр. 471).

2. Упакуйте для отправки в ящик со льдом.

3. По прибытии в лабораторию поместите медные капсулы с мороженым в инкубатор при 20° C на пятнадцать минут — то есть до тех пор, пока хотя бы часть мороженого не станет жидкой.

Качественный и количественный анализ.—Обрабатывайте жидкое мороженое как молоко и проводите исследование точно так же, как описано для молока (см. стр. 443).

ИССЛЕДОВАНИЕ СЛИВОК И МАСЛА.

Сбор пробы.—Собирайте, храните и отправляйте пробы в лабораторию точно так же, как это делается в случае с мороженым.

Количественный анализ.—

Необходимая аппаратура:

Sterile test-tube.

Sterilised spatula.

Water-bath regulated at 42° C.

Case of sterile plates.

Case of sterile graduated pipettes, 1 c.c. (in hundredths).

Tubes of gelatine-agar (+10 reaction).

Plate-levelling stand, with its water chamber filled with water at 42° C.

Метод.—

1. Перенесите несколько граммов пробы в стерильную пробирку с помощью стерилизованного шпателя.

2. Поместите пробирку на водяную баню при 42° C, пока содержимое не станет жидким.

3. Разжижьте восемь пробирок с желатин-агаром, поместите их на водяную баню при 42° C и охладите до этой температуры.

4. Инокулируйте пробирки с желатин-агаром следующими количествами пробы с помощью стерильной пипетки, градуированной в сотых долях кубического сантиметра, а именно:

To tube No. 1 add 1 c.c. liquefied butter.

2 add 0.5 c.c. liquefied butter.

3 add 0.3 c.c. liquefied butter.

4 add 0.2 c.c. liquefied butter.

5 add 0.1 c.c. liquefied butter.

6 add 0.05 c.c. liquefied butter.

7 add 0.03 c.c. liquefied butter.

8 add 0.02 c.c. liquefied butter.

9 add 0.01 c.c. liquefied butter.

5. Залейте чашку Петри из каждой пробирки с желатин-агаром и инкубируйте при 28° C.

6. «Подсчитайте» чашки после трех дней инкубации и на основе полученных цифр оцените количество организмов, присутствующих в одном кубическом сантиметре пробы.

Качественный анализ.—

Необходимая аппаратура:

Стерильный стакан, горлышко которого закрыто стерильной ватной пробкой.

Противовес для стакана.

Весы и гири.

Стерилизованный шпатель.

Водяная баня, отрегулированная на 42° C.

Делительная воронка емкостью 250 см³, выходная трубка которой защищена от загрязнения путем пропускания ее через ватную пробку внутрь небольшой колбы Эрленмейера, служащей опорой для воронки. Этот аппарат стерилизуется целиком в сушильном шкафу.

Большая центрифуга.

Стерильные пробирки (для центрифуги), закрытые сплошными резиновыми пробками.

Case of sterile pipettes, 10 c.c.

Case of sterile graduated pipettes, 1 c.c. (in tenths of a
cubic centimetre).

Метод.—

1. Отвесьте 100 граммов пробы в стерильный стакан.

2. Закройте горлышко стакана стерильной ватной пробкой и погрузите стакан в водяную баню при 42° C, пока содержимое полностью не разжижится.

3. Перелейте разжиженное масло в стерильную делительную воронку.

4. Перенесите воронку в инкубатор при 37° C и оставьте ее там на четыре дня.

По истечении этого времени содержимое воронки разделится на два четких слоя.

(а) Поверхностный маслянистый слой, практически свободный от бактерий.

(б) Глубокий водянистый слой, мутный и облачный от роста бактерий.

5. Слейте нижний мутный слой в стерильные центрифужные пробирки, предварительно нагретые примерно до 42° C, и немедленно центрифугируйте.

6. Отпипетируйте надосадочную жидкость и наполните пробирки теплым стерильным 1%-м раствором карбоната натрия; закройте пробирки пробками и энергично встряхивайте в течение нескольких минут.

7. Снова центрифугируйте.

8. Отпипетируйте надосадочную жидкость; наполните пробирки теплым стерильным бульоном, хорошо встряхните и снова центрифугируйте, чтобы промыть осадок.

9. Отпипетируйте надосадочную жидкость.

10. Подготовьте мазки на покровных стеклах, зафиксируйте и очистите, как для препаратов молока, окрасьте карболовым метиленовым синим, по методу Грама, по методу Циль-Нильсена и исследуйте микроскопически с помощью 1/12-дюймового иммерсионного объектива.

11. Продолжите исследование осадка, как в случае с осадком молока (см. стр. 450 и далее).

ИССЛЕДОВАНИЕ ИСПОРЧЕННОГО МЯСА.

(Включая консервированное или паштетное мясо, рыбу и т. д.)
Бактериоскопическое исследование испорченных продуктов направлено главным образом на обнаружение тех членов группы кишечной и тифозной палочек — B. enteritidis Гертнера и их союзников, — которые обычно связаны с эпидемическими вспышками пищевых отравлений, а также таких анаэробных бактерий, которые инициируют процессы гниения в пище, приводящие к образованию ядовитых птомаинов; следовательно, количественный анализ в чистом виде часто опускается.

А. Культуральное исследование.

Количественный анализ.—

Необходимая аппаратура:

Стерилизованный консервный нож (если необходимо).

Колба Эрленмейера (емкостью 500 см³), содержащая 200 см³ стерильного бульона и снабженная сплошной резиновой пробкой.

Противовес.

Ножницы и пинцет.

Весы и гири.

Водяной стерилизатор.

Подкожный шприц.

Шприц с внутрижелудочной трубкой.

Крысиный пинцет.

Набор стерильных капсул.

Фильтровальный аппарат, как для анализа воды.

Набор стерильных чашек.

Case of sterile graduated pipettes, 10 c.c. (in tenths of a
cubic centimetre).

Case of sterile graduated pipettes, 1 c.c. (in tenths of a
cubic centimetre).

Подставка для выравнивания чашек.

Пробирки с питательным желатином.

Пробирки с питательным агаром.

Водяная баня, отрегулированная на 42° C.

Аппарат Буллока.

Метод.—

1. Поместите колбу, содержащую 200 см³ стерильного бульона, на одну чашку весов и точно уравновесьте.

2. Измельчите часть пробы с помощью стерильных ножниц и пинцета и добавьте измельченную пробу в бульон в колбе в количестве 20 граммов.

3. Сделайте экстракт, поместив колбу в инкубатор, работающий при 42° C (или на водяную баню, отрегулированную на эту температуру), на полчаса, время от времени встряхивая содержимое. Лучшие результаты получаются, если внутри инкубатора установлен электрический шейкер и колба находится в движении в течение всех тридцати минут.

Теперь каждый сантиметр содержит бактерии, вымытые из 0,1 грамма исходной пищи.

4. Инокулируйте пробирки с разжиженным желатином следующим образом:

To tube No. 1 add 1.0 c.c. of the extract.

2 add 0.5 c.c. of the extract.

3 add 0.3 c.c. of the extract.

4 add 0.2 c.c. of the extract.

5 add 0.1 c.c. of the extract.

Залейте чашки из этих пробирок и инкубируйте при 20° C.

5. Подготовьте точно такой же набор агаровых чашек и инкубируйте при 37° C.

6. Отпипетируйте 5 см³ экстракта в стерильную пробирку, нагрейте в дифференциальном стерилизаторе при 80° C в течение десяти минут.

7. Из нагретого экстракта подготовьте дублирующие наборы агаровых и желатиновых чашек и инкубируйте анаэробно в аппарате Буллока при 37° C и 20° C соответственно.

8. После трех дней инкубации исследуйте агаровые чашки, как аэробные, так и анаэробные, и подсчитайте колонии, развившиеся из спор (7), и из вегетативных форм и спор (5), и рассчитайте и запишите количество каждой группы на грамм исходной пищи.

9. После семи дней инкубации (или раньше, если это необходимо из-за роста разжижающих колоний) подсчитайте желатиновые чашки таким же образом.

10. Сделайте пересевы из колоний, которые появляются, и идентифицируйте различные организмы.

11. Продолжите исследования в отношении обнаружения патогенных организмов, как описано в разделе «Вода» (стр. 429 и далее).

Качественный анализ.—

I. Культуральный.

Микроорганизмы, которые ищут во время исследования испорченных продуктов, включают следующее:

Члены групп кишечной и тифозной палочек (главным образом класса Гертнера).

B. anthracis.

Стрептококки.

Анаэробные бактерии:

B. enteritidis sporogenes.

B. botulinus.

B. cadaveris.

Методы, с помощью которых эти организмы, если они присутствуют, могут быть идентифицированы и выделены, уже описаны в соответствующем разделе исследования воды, за исключением тех, которые применимы к B. botulinus и B. cadaveris. Их можно удовлетворительно выделить только из тел экспериментально инокулированных животных.

II. Экспериментальный.

Ткань.—

1. Кормите крыс и мышей порциями пробы и наблюдайте за результатом.

2. Если кто-либо из животных умирает, произведите полное вскрытие и попытайтесь выделить патогенные организмы.

Экстракт.—

1. Вводите различные количества бульонного экстракта в желудки нескольких крыс, мышей и морских свинок повторно в течение двух или трех дней внутрижелудочным методом инокуляции (см. стр. 367) и наблюдайте за результатом. Морские свинки и мыши очень восприимчивы к инфекции B. botulinus этим методом; кролики менее восприимчивы.

2. Инокулируйте крыс, мышей и морских свинок подкожно в глубокие карманы и внутрибрюшинно различными количествами бульонного экстракта и наблюдайте за результатом.

3. Отфильтруйте часть экстракта через свечу Шамберлана и инкубируйте фильтрат, чтобы определить наличие растворимых токсинов.

4. Если кто-либо из животных погибает от любого из этих методов инокуляции, произведите тщательное вскрытие и попытайтесь выделить патогенные организмы.

ИССЛЕДОВАНИЕ УСТРИЦ И ДРУГИХ МОЛЛЮСКОВ.

При открытии раковины устрицы обнаруживается некоторое количество жидкости, называемой «ликером». Это количество варьируется от капли до многих кубических сантиметров (0,1 см³ – 10 см³) — в последнем случае большая часть жидкости, вероятно, является последним квантом воды, проглоченным двустворчатым моллюском перед закрытием раковины. Чтобы получить рабочее среднее значение бактериологической флоры пробы, следует взять десять устриц, а тело, желудочный сок и ликер следует тщательно перемешать перед исследованием. Исследование, как и при работе с другими продуктами питания, направлено на поиск членов группы кишечной и тифозной палочек, сточных стрептококков и, возможно, также B. enteritidis sporogenes.

Необходимая аппаратура:

Две жесткие щетки для ногтей.

Жидкое мыло.

Стерильная вода в аспираторной банке с выпускным соплом, управляемым пружинным зажимом.

Стерильные ножи для устриц.

Стерильная стеклянная чашка с крышкой, достаточно большая, чтобы вместить десять устриц.

Стерильный пинцет.

Стерильные ножницы.

Стерильные полотенца или большие марлевые прокладки.

Стерильные градуированные цилиндры емкостью 1000 см³, с крышкой или дном стерильной чашки Петри, перевернутыми над открытым горлышком в качестве крышки.

Стеклянные палочки.

Corrosive sublimate solution, 1 per mille.

Пробирки с бульонной средой с желчными солями.

Пробирки с лакмусовым молоком.

Поверхностные чашки с нутрозо-агаром.

Case of sterile pipettes, 1 c.c. (in tenths of a c.c.)

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths of a c.c.)

Набор стерильных стеклянных капсул.

Erlenmeyer flasks, 250 c.c. capacity.

Бульонная среда с желчными солями двойной концентрации.

Метод.—

1. Тщательно очистите внешнюю поверхность раковин устриц, очищая каждую по очереди жидким мылом и щеткой для ногтей под краном с проточной водой. Затем, держа раковину устрицы в паре стерильных щипцов, промойте каждую часть внешней стороны раковины струей стерильной воды, вытекающей из аспираторной банки; поместите устрицу внутрь стерильной стеклянной чашки. Повторите процесс с каждой из оставшихся устриц.

2. Прежде чем продолжить, тщательно очистите руки чистой щеткой для ногтей, мылом и водой, затем погрузите их в 2%-й раствор лизола и, наконец, в стерильную воду.

3. Расстелите стерильное полотенце на столе.

4. Возьмите одну из устриц из стерильной стеклянной чашки и положите ее, опираясь на выпуклую раковину, на полотенце. Поверните угол стерильного полотенца над верхней плоской раковиной, чтобы обеспечить более прочный захват левой рукой, которая удерживает раковину в нужном положении.

5. Стерильным ножом для устриц (в правой руке) откройте раковину и отделите тело устрицы от внутренней поверхности верхней плоской раковины. Отогните и отделите плоскую раковину, оставив тело устрицы внутри и прикрепленным к вогнутой раковине. Избегайте проливания ликера.

(Некоторую ловкость в открывании устриц следует приобрести перед проведением этих экспериментов).

6. Разрежьте тело устрицы стерильными ножницами на мелкие кусочки и дайте ликеру, освободившемуся из тела во время процесса, смешаться с ликером, который ранее находился в раковине.

7. Перенесите измельченную устрицу и ликер в цилиндр.

8. Обработайте каждую из оставшихся устриц аналогичным образом.

9. Тщательно перемешайте содержимое цилиндра, помешивая стерильной стеклянной палочкой. Общий объем составит около 100 см³.

10. Используйте 0,1 см³ смешанного ликера для инокуляции каждой из серии трех поверхностных чашек с нутрозо-агаром.

11. Инокулируйте 0,1 см³ смешанного ликера в каждую из трех пробирок с лакмусовым молоком.

12. Добавьте стерильную дистиллированную воду к содержимому цилиндра до 1000 см³, тщательно перемешайте стерильной стеклянной палочкой и дайте отстояться. Бактериальное содержание каждой устрицы можно рассматривать для всех практических целей как содержащееся в 100 см³ жидкости.

13. Расставьте четыре стеклянные капсулы в ряд и пронумеруйте I, II, III, IV. Отпипетируйте по 9 см³ стерильной дистиллированной воды в каждую.

14. В капсулу № I добавьте 1 см³ разбавленного ликера и т. д. из цилиндра и тщательно перемешайте. В капсулу II добавьте 1 см³ разведения из капсулы I и тщательно перемешайте. Перенесите 1 см³ жидкости из капсулы II в капсулу III, после чего добавьте 1 см³ жидкости из капсулы III в капсулу IV.

15. Промаркируйте пробирки с бульонной средой с желчными солями и инокулируйте их следующими количествами разведенных устриц:

No. 6 with 10 c.c. cylinder fluid = 0.1 oyster.

No. 5 with 1 c.c. cylinder fluid = 0.01 oyster.

No. 4 with 1 c.c. capsule I fluid = 0.001 oyster.

No. 3 with 1 c.c. capsule II fluid = 0.0001 oyster.

No. 2 with 1 c.c. capsule III fluid = 0.00001 oyster.

No. 1 with 1 c.c. capsule IV fluid = 0.000001 oyster.

16. Перенесите 100 куб. см жидкости из цилиндра (= 1 устрица) в коническую колбу, добавьте 50 куб. см бульонной среды с желчными солями двойной концентрации и промаркируйте цифрой 7.

17. Сделайте дубликаты всех вышеуказанных культур.

18. Поместите пробирочные культуры в пробирки Бухнера и инкубируйте в анаэробных условиях при температуре 42° C.

Если в пробирке 1 наблюдается рост, то окончательно выделенный микроорганизм, например B. coli, должен был присутствовать в количестве одного миллиона на устрицу.

19. Завершите исследование на наличие представителей группы кишечной палочки-тифа и сточных стрептококков, как указано в разделе «Исследование воды», стр. 429 (шаги 11-21).

20. Инокулируйте серию из 6 пробирок с лакмусовым молоком количествами материала, аналогичными указанным в шаге 15; нагрейте до 80° C в течение десяти минут и инкубируйте в анаэробных условиях при 37° C. Исследуйте на наличие B. enteritidis sporogenes, как указано в разделе «Исследование воды», стр. 438 (шаги 7-10).

ИССЛЕДОВАНИЕ СТОЧНЫХ ВОД И СТОЧНЫХ ЭФФЛУЕНТОВ.

Количественное исследование.—

Сбор пробы.—Поскольку требуется лишь небольшое количество материала, пробы следует собирать способом, аналогичным описанному для количественного исследования воды, и транспортировать в ледяном аппарате, используемом для упаковки таких проб.

Необходимое оборудование.—Как для воды (см. стр. 420).

Метод.—

1. Расставьте четыре стерильные капсулы в ряд и пронумеруйте их I, II, III, IV.

2. Пипеткой внесите 9 куб. см стерильного бульона в капсулу № I.

3. Пипеткой внесите 9,9 куб. см стерильного бульона в капсулы II, III и IV.

4. Добавьте 1 куб. см сточной воды в капсулу № I с помощью стерильной пипетки и тщательно перемешайте.

5. Возьмите чистую стерильную пипетку и перенесите 0,1 куб. см смеси из № I в № II и тщательно перемешайте.

6. Таким же образом перенесите 0,1 куб. см из № II в № III, а затем 0,1 куб. см из № III в № IV.

Теперь 1 куб. см разведения № I содержит 0,1 куб. см исходной сточной воды. 1 куб. см разведения № II содержит 0,001 куб. см исходной сточной воды. 1 куб. см разведения № III содержит 0,00001 куб. см исходной сточной воды. 1 куб. см разведения № IV содержит 0,0000001 куб. см исходной сточной воды.

7. Залейте набор желатиновых чашек из содержимого каждой капсулы, по три чашки в наборе, содержащих соответственно 0,2, 0,3 и 0,5 куб. см разведения. Тщательно промаркируйте; инкубируйте при 20° C в течение трех, четырех или пяти дней.

8. Подсчитайте количество микроорганизмов в тех наборах чашек, где не произошло разжижение, вероятно, в тех, что из разведения III или IV, и рассчитайте на их основе количество, присутствующее в одном кубическом сантиметре исходной пробы сточных вод.

Качественное исследование.—Качественное исследование сточных вод связано с идентификацией и подсчетом тех же бактерий, что рассматривались в соответствующем разделе исследования воды; следовательно, оно проводится по точно таким же принципам, как уже указано (см. стр. 426–441).

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДУХА.

Количественное исследование.—

Необходимое оборудование:

Аспирационная бутыль емкостью 10 литров, снабженная отводной трубкой, горлышко которой закрыто перфорированной резиновой пробкой, через которую проходит короткий отрезок стеклянной трубки.

Erlenmeyer flask, 250 c.c. capacity (having a wide mouth
properly plugged with wool), containing 50 c.c. sterile
water.

Резиновая пробка, подходящая к горлышку колбы, с двумя отверстиями, оснащенная следующим образом:

Возьмите стеклянную трубку длиной 9 см и согните 3 см на одном конце под прямым углом к основной длине трубки. Пропустите длинное плечо угла через одно из отверстий в пробке; заткните открытый конец короткого плеча ватой.

Возьмите стеклянную воронку диаметром 5 или 6 см со стеблем длиной 12 см и согните стебель близко к вершине воронки, сделав плавный изгиб на четверть круга; пропустите длинный стебель через другое отверстие в резиновой пробке.

Банка для батареи или небольшая водяная баня для размещения конической колбы, обложенной льдом.

Запас колотого льда.

Резиновая трубка.

Винтовые зажимы и пружинные зажимы для трубок.

Стерилизатор для воды.

Штатив и зажимы.

Оборудование для посева на чашки (как для подсчета микроорганизмов в воде, см. стр. 420).

Метод.—

1. Налейте 10 литров воды в аспирационную бутыль и прикрепите кусок резиновой трубки с винтовым зажимом к отводной трубке. Полностью откройте краны и отрегулируйте винтовой зажим опытным путем так, чтобы трубка выдавала 1 куб. см воды каждую секунду. Винтовой зажим больше не трогают во время эксперимента.

При такой скорости аспирационная бутыль опорожнится чуть менее чем за три часа. Закройте кран и снова долейте содержимое аспирационной бутыли до 10 литров.

2. Стерилизуйте подогнанную резиновую пробку с воронкой и трубкой путем кипячения в стерилизаторе для воды в течение десяти минут.

3. Удалите ватную пробку из колбы и замените ее резиновой пробкой с приспособлениями. Убедитесь, что конец стебля воронки погружен в бульон.

4. Поместите колбу в стеклянный или металлический сосуд и обложите ее толченым льдом. Установите колбу с ледяной оболочкой чуть выше горлышка аспирационной бутыли.

Fig. 216.—Arrangement of apparatus for air analysis.

5. Соедините свободный конец стеклянной трубки от колбы — после удаления ватной пробки — с трубкой для входа воздуха в горлышке аспирационной бутыли (рис. 216).

6. Полностью откройте кран и дайте воде стечь.

При необходимости время от времени пополняйте лед.

(Опорожняясь, аспирационная бутыль будет медленно всасывать 10 литров воздуха через воду в конической колбе.)

7. Когда аспирация завершена, отсоедините колбу и извлеките ее из ледяной упаковки.

8. Разжижьте три пробирки с питательным желатином и добавьте в них соответственно 0,5 куб. см, 0,3 куб. см и 0,2 куб. см воды из колбы с помощью стерильной градуированной пипетки, как при количественном исследовании воды. Разлейте по чашкам.

9. Залейте второй аналогичный набор желатиновых чашек.

10. Инкубируйте оба набора чашек при 20° C.

11. Подсчитайте колонии, присутствующие в двух наборах желатиновых чашек через три, четыре или пять дней, и усредните результаты, полученные таким образом; оцените количество микроорганизмов, присутствующих в 1 куб. см, а затем в 50 куб. см бульона в колбе.

12. Результат исследования воздуха обычно выражается как количество бактерий, присутствующих в одном кубическом метре (т. е. килолитре) воздуха; и поскольку количество микроорганизмов, присутствующих только в 50 куб. см воды, представляет собой те, что содержатся в 10 литрах воздуха, полученную цифру необходимо умножить на 100.

Качественное исследование.—

1. Действуйте точно так же, как при количественном исследовании воздуха (см. выше), шаги с 1 по 10.

2. Залейте чашки с сусло-агаром аналогичными количествами воды, зараженной воздухом, и инкубируйте при 37° C.

3. Залейте чашки с питательным агаром аналогичными количествами воды и инкубируйте при 37° C.

4. Залейте аналогичные чашки с сусло-желатином и инкубируйте при 20° C.

5. Отберите отдельные колонии, которые появляются на различных чашках, пересейте их на различные среды и идентифицируйте.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ.

Бактериологическое исследование почвы дает ценную информацию санитарному врачу в ходе процесса гомогенизации «насыпного грунта» (например, зоны свалки городских отходов) и определяет период, в течение которого такая территория может быть надлежащим образом и безопасно использована для строительных целей; или сельскохозяйственному специалисту, информируя его о пригодности любого участка для выращивания сельскохозяйственных культур.

Поверхность земли, подвергающаяся бактерицидному воздействию солнечного света и резким сменам тепла и холода, дождя и ветра, содержит лишь немного микроорганизмов. Кроме того, из-за плотности молекул глубоких слоев почвы и отсутствия аэрации, с одной стороны, и фильтрующего действия верхних слоев почвы и бактериального антагонизма, с другой, бактериальная жизнь практически прекращается на глубине около 2 метров. Промежуточный слой почвы, расположенный на глубине от 25 до 50 см ниже поверхности, неизменно дает наиболее многочисленную и разнообразную бактериальную флору.

Сбор пробы.—Небольшая медная капсула высотой 6 см и диаметром 6 см со съемной крышкой, закрепленной байонетным затвором, предварительно стерилизованная в сушильном шкафу, является наиболее удобным сосудом для проб почвы.

Fig. 217.—Soil scoop.

Инструмент, используемый для фактического извлечения почвы из ее естественного положения, будет варьироваться в зависимости от того, требуются ли нам поверхностные пробы или почва с разной глубины.

(а) Для поверхностных проб используйте железный совок, по форме напоминающий рожок для обуви, но снабженный острым шипом (рис. 217). Его оборачивают асбестовой тканью и стерилизуют в сушильном шкафу. После извлечения из шкафа оберните кусок промасленной бумаги, шелка или гуттаперчевой ткани поверх асбестовой ткани и закрепите его бечевкой в качестве дополнительной защиты от загрязнения.

По прибытии на место, откуда должны быть взяты пробы, покрытия совка снимаются, а асбестовая ткань используется для сметания рыхлых камней и мусора с выбранного участка. Затем поверхностная почва разрыхляется острием совка, соскабливается, собирается в корпус совка и переносится в стерильную капсулу для транспортировки.

Fig. 218.—Fraenkel's borer.

(б) Для глубоких проб, собранных на различных расстояниях от поверхности, можно вырыть экспериментальную траншею на требуемую глубину и собрать пробы в нужных точках на срезе. Однако предпочтительнее использовать какую-либо форму бура, например, разработанную Френкелем (рис. 218).

Земляной бур Френкеля.—Этот инструмент состоит из прочного стержня из твердой стали длиной 150 см, размеченного в сантиметрах от наконечника сверла. Он снабжен поперечной рукояткой (регулируемой в любой точке по длине стержня с помощью винтовой гайки). Терминальные сантиметры толще остальной части стержня, и с одной стороны вырезана вертикальная полость глубиной около 0,5 см. Она закрыта фланцевой втулкой, пока бур ввинчивается в почву по часовой стрелке, и открывается для приема пробы почвы, когда достигнута требуемая глубина, путем изменения направления вращения, и снова закрывается перед извлечением бура из земли путем возобновления первоначального направления вращения. Его можно стерилизовать способом, аналогичным тому, что принят для совка, или путем многократного заполнения полости эфиром и его выжигания.

Количественное исследование.—Полное количественное бактериологическое исследование почвы включает четыре отдельных исследования:

1. Подсчет аэробных микроорганизмов.

2. Подсчет спор аэробов.

3. Подсчет анаэробных микроорганизмов (включая факультативные анаэробы).

4. Подсчет спор анаэробов.

Кроме того, путем объединения результатов первого и второго, а также третьего и четвертого из них, получается соотношение спор к вегетативным формам.

Необходимое оборудование:

Набор стерильных капсул (емкостью 25 куб. см).

Case of sterile graduated pipettes, 10 c.c. (in tenths of a
cubic centimetre).

Case of sterile graduated pipettes, 1 c.c. (in tenths of a
cubic centimetre).

Колба, содержащая 250 куб. см стерильного бульона.

Высокий цилиндр, содержащий 2-процентный раствор лизола.

Штатив для выравнивания чашек.

12 стерильных чашек.

Пробирки с питательным желатином.

Пробирки с сусло-желатином.

Пробирки с питательным агаром.

Пробирки с глюкозо-формиатным желатином.

Пробирки с глюкозо-формиатным агаром.

Водяная баня, отрегулированная на 42° C.

Горелка Бунзена.

Восковой карандаш.

Стерильная ступка и пестик (агатовые).

Стерильная коническая колба с широким горлышком (емкостью 500 куб. см).

Стерильная металлическая воронка с короткой трубкой с широким отверстием, чтобы как раз подходила к горлышку колбы.

Сплошная резиновая пробка, подходящая к колбе (стерилизованная кипячением).

Весы.

Противовес (рис. 107).

Стерильная металлическая (никелевая) ложка или шпатель.

Дробный стерилизатор (рис. 140).

Метод.—

1. Расставьте четыре стерильные капсулы, пронумерованные I, II, III и IV; пипеткой внесите 9 куб. см стерильного бульона в первую капсулу и 9,9 куб. см в каждую из оставшихся трех.

2. Пипеткой внесите 100 куб. см стерильного бульона в коническую колбу.

3. Удалите ватную пробку из колбы и замените ее стерильной воронкой.

4. Поместите колбу и воронку на одну чашку весов и точно уравновесьте.

5. Высыпьте пробу почвы в ступку и тщательно разотрите.

6. С помощью стерильного шпателя добавьте 10 граммов пробы земли в бульон в колбе.

Конечные результаты будут более надежными, если шаги 2, 3, 4 и 5 выполняются под вытяжным шкафом — для защиты от падающей пыли и т. д.

7. Снимите воронку с горлышка колбы; замените ее резиновой пробкой и энергично встряхните; затем дайте твердым частицам осесть в течение примерно тридцати минут. Один кубический сантиметр мутного бульона содержит смывы с 0,1 грамма почвы.

8. Отберите пипеткой 1 куб. см надосадочного бульона, называемого «почвенной водой», и добавьте его к содержимому капсулы I; тщательно перемешайте.

9. Удалите 0,1 куб. см зараженного бульона из капсулы I и добавьте его в капсулу II, перемешайте.

10. Таким же образом добавьте 0,1 куб. см содержимого капсулы II в капсулу III, а затем 0,1 куб. см содержимого капсулы III в капсулу IV.

Тогда 1 куб. см жидкости из капсулы I содержит почвенную воду из 0,01 г земли. Тогда 1 куб. см жидкости из капсулы II содержит почвенную воду из 0,0001 г земли. Тогда 1 куб. см жидкости из капсулы III содержит почвенную воду из 0,000001 г земли. Тогда 1 куб. см жидкости из капсулы IV содержит почвенную воду из 0,00000001 г земли.

(А) Аэробы (вегетативные формы и споры).—

11. Залейте набор желатиновых чашек из содержимого каждой капсулы — по две чашки в наборе, содержащих соответственно 0,1 куб. см и 0,4 куб. см разведенной почвенной воды. Промаркируйте и инкубируйте.

12. Залейте аналогичные наборы чашек с сусло-желатином из содержимого капсул II и III, промаркируйте и инкубируйте при 20° C.

13. Залейте аналогичные наборы агаровых чашек из содержимого капсул II и III; промаркируйте и инкубируйте при 37° C.

14. Отвесьте вторую пробу почвы — 10 граммов — высушите на водяной бане до постоянного веса и рассчитайте соотношение

wet soil weight

———————

dry soil weight

15. «Подсчитайте» чашки после инкубации в течение трех, четырех или пяти дней и, скорректировав полученные таким образом цифры с помощью соотношения «влажной» к «сухой» почве, оцените—

(а) Количество аэробных микроорганизмов, присутствующих в одном грамме почвы.

(б) Количество дрожжей и плесневых грибов, присутствующих в одном грамме почвы.

(в) Количество аэробных микроорганизмов, «растущих при 37° C», присутствующих в одном грамме почвы.

(Б) Анаэробы (вегетативные формы и споры).—

16. Залейте аналогичные наборы чашек с глюкозо-формиатным желатином и агаром и инкубируйте в анаэробном аппарате Буллока.

(В) Аэробы и анаэробы (только споры).—

17. Пипеткой внесите 5 куб. см почвенной воды в стерильную пробирку.

18. Поместите в дифференциальный стерилизатор при 80° C на десять минут.

19. Залейте два набора из четырех желатиновых чашек, содержащих соответственно 0,1, 0,2, 0,5 и 1 куб. см почвенной воды; промаркируйте и инкубируйте при 20° C, один набор в аэробных условиях, другой в анаэробных в аппарате Буллока.

20. «Подсчитайте» чашки (отложите подсчет как можно дольше) и оцените количество спор аэробов и анаэробов, присутствующих соответственно в одном грамме почвы.

21. Рассчитайте соотношение, существующее между спорами и спорами + вегетативными формами в каждой из двух групп, аэробных и анаэробных микроорганизмов.

Качественное исследование.—Качественное исследование почвы обычно направлено на обнаружение одного или нескольких из следующих микроорганизмов:

Представители группы кишечной палочки-тифа.

Стрептококки.

Bacillus anthracis.

Bacillus tetani.

Bacillus œdematis maligni.

Нитрифицирующие микроорганизмы (нитритные).

Нитрифицирующие микроорганизмы (нитратные).

1. Перенесите остаток почвенной воды (88 куб. см) в стерильную коническую колбу с помощью стерильного сифона.

2. Установите фильтрующее устройство, как для качественного исследования воды, и отфильтруйте почвенную воду.

3. Суспендируйте бактериальный осадок в 5 куб. см стерильного бульона (техника аналогична описанной для пробы воды, см. стр. 434–436).

Каждый кубический сантиметр суспензии теперь содержит почвенную воду почти из 1 грамма земли.

Методы до этого момента идентичны, независимо от того, какой микроорганизм или группу микроорганизмов желательно выделить; но с этого этапа процесс немного варьируется для каждой конкретной бактерии.

I. Группа кишечной палочки-тифа.—

II. Стрептококки.—

III. Bacillus anthracis.—

IV. Bacillus tetani.—

Методы, принятые для выделения этих микроорганизмов, идентичны тем, что уже описаны в разделе «Вода» (стр. 437 и далее).

V. Bacillus œdematis maligni.—Метод точно такой же, как применяемый для B. tetani.

VI. Нитритные микроорганизмы.—

1. Возьмите десять пробирок с раствором Виноградского № I (см. стр. 198) и пронумеруйте их последовательно от 1 до 10.

2. Инокулируйте каждую пробирку различными количествами материала следующим образом:

To tube No. 1 add 1.0 c.c. of the soil water.

To tube No. 2 add 0.1 c.c. of the soil water.

To tube No. 3 add 1.0 c.c. from Capsule I.

To tube No. 4 add 0.1 c.c. from Capsule I.

To tube No. 5 add 1.0 c.c. from Capsule II.

To tube No. 6 add 0.1 c.c. from Capsule II.

To tube No. 7 add 1.0 c.c. from Capsule III.

To tube No. 8 add 0.1 c.c. from Capsule III.

To tube No. 9 add 1.0 c.c. from Capsule IV.

To tube No. 10 add 0.1 c.c. from Capsule IV.

Промаркируйте и инкубируйте при 30° C.

VII. Нитратные микроорганизмы.—

3. Возьмите десять пробирок с раствором Виноградского № II, пронумеруйте их последовательно от 1 до 10 и инокулируйте количествами почвенной воды, аналогичными тем, что перечислены в разделе VI, шаг 2. Промаркируйте и инкубируйте при 30° C.

4. Исследуйте после двадцати четырех и сорока восьми часов инкубации. Из тех пробирок, которые показывают признаки роста, сделайте пересевы в свежие пробирки с той же средой и инкубируйте при 30° C.

5. Сделайте дальнейшие пересевы из тех пробирок, которые показывают рост, и снова инкубируйте.

6. Если в этих пересевах происходит рост, сделайте поверхностные мазки на чашках с силикатным желе Виноградского (см. стр. 198).

7. Отберите колонии, которые появляются, и пересейте на каждую из этих двух сред.

ИСПЫТАНИЕ ФИЛЬТРОВ.

Фарфоровые фильтрующие свечи исследуются на предмет их способности задерживать все микроорганизмы, взвешенные в жидкостях, которые фильтруются через них, и пропускать только стерильные фильтраты. Чтобы определить отсутствие в фильтре дефектов и трещин, которые позволили бы бактериям пройти, независимо от того, насколько совершенна общая структура свечи, свечу необходимо сначала прикрепить с помощью длинного куска напорной трубки к мощному насосу, такому как ножной велосипедный насос, оснащенный манометром. Затем свечу погружают в банку с водой и держат полностью погруженной, пока внутреннее давление постепенно не повышается до двух атмосфер действием насоса. Любая трещина или дефект сразу станут очевидными из-за потока пузырьков воздуха, выходящих из них.

Исследование на проницаемость проводится следующим образом:

Необходимое оборудование:

Фильтрующее устройство: используемая фильтрующая свеча должна быть той самой, которую предполагается испытать, и должна быть предварительно тщательно стерилизована; устройство аппарата, естественно, будет варьироваться в зависимости от каждой формы фильтра, одной из тех, что уже описаны (см. стр. 42–48).

Штатив для выравнивания чашек.

Набор стерильных чашек.

Case of sterile pipettes, 10 c.c. (in tenths).

Case of sterile pipettes, 1 c.c. (in tenths).

Пробирки с питательным желатином.

Колба, содержащая стерильный физиологический раствор.

Sterile measuring flask, 1000 c.c. capacity.

Метод.—

1. Приготовьте поверхностные культуры Bacillus mycoides на питательном агаре в культуральной бутыли и инкубируйте при 20° C в течение сорока восьми часов.

2. Пипеткой внесите 5 куб. см стерильного физиологического раствора в культуральную бутыль и эмульгируйте в нем весь поверхностный рост.

3. Пипеткой перенесите эмульсию в стерильную мерную колбу и доведите до 1000 куб. см добавлением стерильной воды.

4. Залейте эмульсию в резервуар фильтра и начните фильтрацию.

5. Когда фильтрация завершена, залейте шесть агаровых чашек, каждая из которых содержит 1 куб. см фильтрата.

6. Инкубируйте при 37° C до завершения семи дней, если это необходимо.

7. Если фильтрат не стерилен, пересейте прошедший микроорганизм и определите его идентичность с тест-бактерией, прежде чем выбраковывать фильтр — поскольку фильтрат мог быть случайно загрязнен.

8. Если фильтрат стерилен, рестерилизуйте свечу и повторите тест, теперь заменив его культурой B. prodigiosus — бациллы меньшего размера.

9. Если второй тест удовлетворительный, испытайте свечу против культуры очень маленького кокка, например Micrococcus melitensis, аналогичным образом; в этом случае продолжая инкубацию культур из фильтрата в течение четырнадцати дней.

ИСПЫТАНИЕ ДЕЗИНФЕКТАНТОВ.

Методы уже были подробно описаны (стр. 310) с целью изучения жизненной устойчивости микроорганизмов к летальному эффекту гермицидов. Но часто случается, что бактериологу приходится определять относительную эффективность «дезинфектантов» с точки зрения санитарии и коммерции, а не с точки зрения исследователя. При проведении этого направления исследований удобно сравнивать эффективность предлагаемого дезинфектанта в лабораторных условиях с эффективностью какого-либо стандартного гермицида, такого как чистый фенол. При этом, и для того чтобы можно было сравнивать работу разных наблюдателей, следует стремиться к максимально единообразным условиям. Описанный метод — это метод, который использовался автором в течение многих лет, недавно модифицированный принятием некоторых рекомендаций Комиссии Ланцета по стандартизации дезинфектантов — особенно расчета для определения фенольного коэффициента.

Этот метод имеет много общего с той модификацией «капельного» метода, которая известна как тест Риделя-Уокера.

Общие соображения.—

Их можно сгруппировать под тремя заголовками: Тестовый микроб, Гермицид и Окружающая среда.

1. Тестовый микроб.—B. coli.

Поскольку дезинфектанты тестируются для санитарных целей, очевидно, что в качестве тестового микроба следует выбирать представителя группы кишечной палочки-тифа. B. coli выбирается из-за его относительной непатогенности, легкости, с которой он может быть выделен и идентифицирован разными наблюдателями в разных частях мира, стабильности его фундаментальных характеристик и равномерности его устойчивости при использовании для этих тестов; наконец, поскольку кишечная палочка — это микроорганизм, который немного более устойчив к летальному действию гермицидов, чем более патогенные представители этой группы, в тест вводится запас прочности, который, безусловно, повышает его ценность.

B. coli должен быть недавно выделен из нормального стула и высеян на чашки не менее двух раз, чтобы обеспечить чистоту штамма; и должна быть приготовлена исходная агаровая культура, которая должна использоваться на протяжении любого конкретного теста. Для любого конкретного эксперимента приготовьте мазковую культуру на агаре и инкубируйте при 37° C в течение 24 часов в анаэробных условиях. Затем эмульгируйте весь поверхностный рост в 10 куб. см стерильной воды. Перенесите эмульсию в стерильную пробирку с несколькими стерильными стеклянными бусинами и тщательно встряхните, чтобы обеспечить гомогенную эмульсию. Перенесите в центрифужную пробирку и центрифугируйте эмульсию, чтобы осадить любые массы бактерий, которые могли избежать дезинтегрирующего действия бусин. Пипеткой отберите надосадочную эмульсию для использования в тесте.

2. Гермицид.—

а. Дезинфектант, подлежащий тестированию.—

Первым важным моментом является тестирование неизвестного дезинфектанта, который можно назвать гермицидом-x, по принципам, изложенным на стр. 311, для определения его коэффициента ингибирования.

После того как эта константа установлена, приготовьте различные растворы гермицида-x со стерилизованной дистиллированной водой точными объемными методами, начиная с раствора, несколько более сильного, чем тот, который представляет коэффициент ингибирования. Растворы должны быть приготовлены в довольно большом объеме, при этом для приготовления любого процентного раствора используется не менее 5 куб. см дезинфектанта.

б. Стандартный контроль.—Фенол.

Стандартный гермицид, используемый для сравнения, должен быть таким, который не подвержен изменениям в своем химическом составе, и тем, который получил почти универсальное применение, является фенол.

Следующая таблица показывает влияние различных процентных концентраций карболовой кислоты на B. coli при различном времени контакта, составленная на основе эксперимента, проведенного в стандартных условиях, упомянутых в разделе «Окружающая среда». Результаты тесно соответствуют тем, что были зарегистрированы Комиссией Ланцета по дезинфектантам в 1909 году.

Percentage of phenol Contact time in minutes.
 2-1/2 510 15 20 25 30 35
1.20 - - - - - - - -
1.10 - - - - - - - -
1.0 + - - - - - - -
0.9 + - - - - - - -
0.85 + + - - - - - -
0.80 + + + - - - - -
0.75 + + + + + - - -
0.7 + + + + + + - -
0.65 + + + + + + + -

- = Нет роста, т. е. бактерии убиты. + = Рост, т. е. бактерии все еще живы.

Из этого видно, что необходимо будет приготовить следующие процентные растворы, а именно: 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,75%, 0,7% в качестве контроля для каждого эксперимента.

Приготовьте растворы различной процентной концентрации, отвесив количество карболовой кислоты, необходимое для каждого, и растворив в 100 куб. см чистой дистиллированной воды в точно стандартизированной мерной колбе. Растворы должны готовиться свежими по мере необходимости каждый день.

Окружающая среда.—

а. Общие положения.—

Закройте окна и двери лаборатории, в которой проводится исследование, чтобы избежать сквозняков. Промойте рабочий стол и прилегающий пол раствором сулемы 1:1000. Предупредите ассистента, если таковой имеется, чтобы он избегал ненужных движений или разговоров.

б. Температура контакта, 15–18° C.—

Это температура, при которой происходит контакт между гермицидом и тестовым микробом, и она важна, поскольку некоторые гермициды (например, фенол) кажутся более мощными при высоких температурах. 18° C — практически обычная комнатная температура — это температура, при которой размножение B. coli является сравнительно медленным процессом, но отклонение на градус выше этой температуры или на два-три градуса ниже не имеет значения. Если комнатная температура ниже 15° C во время проведения экспериментов, установите водяную баню, отрегулированную на 18° C, для размещения пробирок, содержащих смесь микроба и гермицида; если выше 19° C, погрузите пробирки в холодную воду, в которую время от времени добавляются небольшие кусочки льда, чтобы предотвратить повышение температуры выше 18° C.

в. Относительный пропорциональный объем тестового микроба и гермицида, 50:1.—

Пять кубических сантиметров — это удобное количество гермицидного раствора для использования, и к нему следует добавить 0,1 куб. см эмульсии тестового микроба.

г. Объем пробы, удаляемой из смеси микроба и гермицида в каждый из периодов времени, 0,1 куб. см.—

Этого достаточно, чтобы получить справедливую пробу микробного содержания смеси, и в то же время недостаточно, чтобы оказать какое-либо ингибирующее действие при переносе в среду для пересева.

д. Среда для пересева. Бульон с желчными солями.—

Жидкая среда необходима для получения немедленного разведения перенесенного гермицида; в то же время выгодно использовать селективную среду, которая благоприятствует росту тестового микроба, исключая организмы, способные загрязнить препарат, и, если возможно, такую, которая дает характерные культурные признаки.

Бульон с желчными солями (стр. 180) сочетает в себе эти пожелания; он позволяет расти только кишечным бактериям, в то время как образование кислой реакции и выделение газа в пересевах, приготовленных из смеси микроба и гермицида, является довольно полным доказательством присутствия живых B. coli.

Количество среды, присутствующей в каждой пробирке, является важным вопросом, поскольку среда не только обеспечивает питание для тестового микроба, но также действует как разбавитель для гермицида, чтобы снизить его концентрацию ниже коэффициента ингибирования. Для рутинной работы каждая пробирка для пересева содержит 10 куб. см среды, но очевидно, что если гермицид-x обладает коэффициентом ингибирования 0,1%, добавление 0,1 куб. см 10-процентного раствора к 10 куб. см среды эффективно предотвратило бы последующий рост тестового микроба после периода контакта, недостаточного для уничтожения его жизнеспособности. Следовательно, предварительные тесты могут в некоторых случаях указывать на необходимость присутствия 12 куб. см, 15 куб. см или более жидкой среды в культуральных пробирках.

е. Температура инкубации, 37° C.—

ж. Период наблюдения за пересевами, семь дней.—

Чтобы определить, были ли уничтожены тестовые микробы, наблюдения должны всегда продолжаться — когда рост кажется отсутствующим — до конца семи дней, прежде чем записывать «нет роста».

з. Идентификация организмов, развивающихся в пересевах после контакта в растворе микроба и гермицида.—

Это основано на видимых невооруженным глазом характеристиках роста в бульоне с желчными солями, дополненных при необходимости методами посева на чашки, дальнейшими пересевами на углеводные среды и реакциями агглютинации. Знак (+) используется для обозначения того, что рост тестового организма произошел в пересевах, а знак (-) — для обозначения того, что тестовые микробы были уничтожены и последующего роста не произошло.

Метод.—

Необходимое оборудование:

Стерильные пробирки (узкие, диаметром не более 1,3 см).

Штатив для пробирок (рис. 219).

Sterile graduated pipettes in case, 1 c.c. (in tenths).

Sterile graduated pipettes in case, 5 c.c. (in c.c.).

Круглые резиновые шайбы диаметром 2,5 см с центральным отверстием, стерилизованные кипячением непосредственно перед использованием, затем перенесенные в стерилизованную стеклянную двойную чашку.

Электрические сигнальные часы или секундомер.

Стерильный пинцет.

Стерилизованные стеклянные бусины.

Аппарат для встряхивания.

Восковой карандаш.

Необходимые материалы:

Процентные растворы гермицида-x (см. стр. 481).

Процентные растворы чистого фенола (см. стр. 482).

Водная эмульсия B. coli (см. стр. 481).

Пробирки с бульоном с желчными солями.

Предварительные тесты.—

а. Коэффициент ингибирования.—

Определите самый низкий процент гермицида-x, который ингибирует рост B. coli в бульоне с желчными солями, и самый высокий процент, который не ингибирует (стр. 311). На основе результата этого эксперимента определите объем среды, необходимый в пробирках для пересева, и процентные растворы, которые будут использоваться в пробном прогоне. Предполагая, что коэффициент ингибирования составляет 1:1000, будет вполне безопасно использовать обычные культуральные пробирки, содержащие 10 куб. см среды в последующих экспериментах.

б. Пробный прогон.—

Определите летальный эффект серии из пяти растворов гермицида-x (скажем, 1:100, 1:250, 1:300, 1:500, 1:600) при времени контакта 2,5, 5, 25 и 30 минут следующим образом:

1. Расставьте пять пробирок, помеченных от A до E, в нижнем ярусе штатива для пробирок.

2. В пробирку A пипеткой внесите 5 куб. см раствора гермицида-x 1:100.

В пробирку B пипеткой внесите 5 куб. см раствора гермицида-x 1:200.

В пробирку C пипеткой внесите 5 куб. см раствора гермицида-x 1:300.

В пробирку D пипеткой внесите 5 куб. см раствора гермицида-x 1:500.

В пробирку E пипеткой внесите 5 куб. см раствора гермицида-x 1:600.

3. Расставьте 20 пробирок с бульоном с желчными солями в верхнем ярусе штатива для пробирок в два ряда, те, что в переднем ряду, пронумеруйте последовательно слева направо 1–10, те, что в заднем ряду, 11–20.

4. Поместите квадратную проволочную корзину вместимостью около 50 пробирок близко к левой стороне штатива для пробирок для приема инокулированных пробирок.

5. Возьмите стерильную пипетку на 1 куб. см из футляра, возьмите стерильную резиновую шайбу пинцетом и вставьте кончик пипетки в центральное отверстие.

6. Положите пинцет на стол так, чтобы стерильные кончики выступали за край. Не вынимая пробирку из штатива, снимите ватную пробку с пробирки A и опустите пипетку с прикрепленной резиновой шайбой на открытое горлышко пробирки; с помощью пинцета, чтобы зафиксировать шайбу, протолкните пипетку через отверстие, пока кончик пипетки не достигнет нескольких миллиметров от дна пробирки (см. рис. 219).

7. Таким же образом установите пипетку и шайбу в горлышко каждой из других пробирок, B, C, D и E.

8. Установите электрические сигнальные часы, чтобы они прозвенели для начала эксперимента и через последующие интервалы в 2,5, 5, 25 и 30 минут.

9. Возьмите 0,5 куб. см эмульсии B. coli в стерильную пипетку, градуированную в десятых долях кубического сантиметра, и будьте готовы.

10. Как только прозвенит звонок, поднимите пипетку из пробирки A левой рукой и из заряженной пипетки, удерживаемой в правой руке, внесите 0,1 куб. см эмульсии B. coli в раствор 1:100. Затем верните пипетку и шайбу на место.

Fig. 219.—Test-tube rack.

11. Поднимите пробирку левой рукой и встряхните ее, чтобы смешать микроб и гермицид, возвращая при этом пипетку для внесения в правой руке.

12. Повторите процесс с пробирками B, C, D и E; затем опустите зараженную пипетку для внесения в банку с лизолом. Инокуляция пяти пробирок может быть выполнена очень быстро, но для каждой пробирки должно быть отведено 10 секунд.

13. Когда прозвенит звонок через 2,5 минуты, продуйте пипетку в пробирке A (это взбалтывает смесь микроба и гермицида и обеспечивает сбор справедливой пробы); дайте смеси войти в пипетку, и так как столбик жидкости поднимается значительно выше конечной градуировки, правый указательный палец, установленный над торцом пипетки перед тем, как ее поднять, удержит более 0,1 куб. см смеси внутри канала, когда кончик пипетки окажется вне жидкости в пробирке. Коснитесь кончиком пипетки внутренней стенки пробирки и дайте излишкам жидкости вытечь, удерживая в пипетке только 0,1 куб. см.

14. В то же время левой рукой снимите пробирку с желчными солями № 1 с верхнего яруса штатива, выньте ватную пробку рукой, в которой уже держите пипетку (относительное положение пипетки, пробки и пробирок с культурой практически такое же, как у платиновой петли, пробки и пробирки с культурой, показанных на рис. 68, стр. 74).

15. Введите кончик пипетки в пробирку с субкультурой и выдуйте смесь в среду — закройте пробирку пробкой и опустите ее в проволочную корзину. Верните пипетку с шайбой в пробирку А.

Как только кончик пипетки войдет в горлышко пробирки А, ее можно отпустить, так как она уже отрегулирована таким образом, что едва не касается дна пробирки, а эластичная шайба предотвратит повреждение пробирки.

Steps 13, 14 and 15 occupy on an average 10 seconds.

16. Repeat steps 13, 14 and 15 with each of the other tubes B, C, D and
E.

17. Repeat these various steps 13-16 when the bell rings at 5, 25 and 30
minutes.

18. Поместите все инокулированные пробирки в инкубатор при температуре 37° C.

19. Исследуйте пробирки с интервалом в 24 часа и запишите результаты в табличной форме, как показано в таблице на стр. 491 (цифры в квадратах указывают количество часов, через которое впервые появились изменения в среде вследствие роста B. coli).

20. Если рассмотрение табличных результатов указывает на концентрации Germicide-x, летальные через 2-1/2 и 30 минут, можно организовать окончательный тест; если же этот результат не был достигнут, вероятно, будет получено достаточно данных для планирования второго пробного теста, который даст необходимую информацию.

Окончательный тест.

c. Определение фенольного коэффициента.

X-дезинфектант. — Это включает два отдельных теста: один для Germicide-x, другой для стандартного фенола.

1. Установите пять четко промаркированных пробирок в нижний ярус штатива.

2. Пипеткой внесите в каждую по 5 куб. см соответствующих пяти процентных растворов x-дезинфектанта, которые, как показал пробный запуск, будут включать те, что обеспечивают летальные значения через 2-1/2 и 30 минут.

3. Разместите 20 пробирок с бульоном на желчных солях в верхнем ярусе штатива для пробирок в два ряда: пробирки в переднем ряду пронумеруйте последовательно слева направо 1-10, в заднем ряду — 11-20.

4. Подготовьте еще 20 пробирок с бульоном на желчных солях, пронумерованных 21-40, в два ряда во втором меньшем штативе, который можно поставить на верхний ярус штатива, как только первые 20 пробирок будут инокулированы.

5. Поставьте квадратную проволочную корзину вместимостью около 50 пробирок вплотную слева от штатива для пробирок для приема инокулированных пробирок.

6. Установите стерильную пипетку объемом 1 куб. см в горлышко каждой из пробирок A, B, C, D и E с помощью шайбы, как описано ранее.

7. Установите электрические сигнальные часы так, чтобы они звонили в начале эксперимента, а затем через 2-1/2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35 минут.

8. Выполните действия в точности так, как указано в разделе «Пробные запуски», шаги 9-19.

Контрольный фенол.

Сразу после инокуляции пробирки с субкультурой из 30-минутного периода контакта проведите точно такой же эксперимент, в котором пять процентных концентраций фенола (например, 1,1, 1,0, 0,9, 0,75, 0,7) размещены в нижнем ярусе штатива для пробирок вместо пяти концентраций Germicide-x.

Рассчитайте фенольный коэффициент следующим методом:

(a) Разделите цифру, представляющую процентную концентрацию самого слабого летального разведения контрольного карболового раствора при 2-1/2-минутном периоде контакта, на цифру, представляющую процентную концентрацию самого слабого летального разведения x-дезинфектанта за тот же период. Частное = фенольный коэффициент через 2-1/2 минуты.

(b) Аналогичным образом получите фенольный коэффициент при 30-минутном периоде контакта.

(c) Запишите среднее значение двух коэффициентов, полученных в (a) и (b), как средний фенольный коэффициент или просто как фенольный коэффициент.

Детали окончательного теста фактического определения приведены в прилагаемой таблице.

ТАБЛИЦА 27

Organism employed, B. Coli Communis.

Culture Medium, Nutrient Agar (+10). Age, 24 hrs. Temp. of Incubation, 37°C.

Quantities used{ Culture}Emulsion 0.1 c.c. + 5 c.c. Germicide.
{ Emulsion }

Room Temperature during Experiments, 17°C.
GermicideStrengthTime of exposureIncubation
2-1/25101520253035TimeTemp.
1 Germicide-x4%————————7 days.37°C.
2 Germicide-x3%48———————7 days.37°C.
3 Germicide-x2%242424244872......7 days.37°C.
4 Germicide-x1%24242424722472...7 days.37°C.
5 Germicide-x0.5%242424242424242424 hours.37°C.
1 Phenol1.10%————————7 days.37°C.
2 Phenol1.00%24.....................7 days.37°C.
3 Phenol0.75%2424242448.........7 days.37°C.
4 Phenol0.70%242424242472......7 days.37°C.
5 Phenol0.65%24242424244824242 days.37°C.

  ((1.10/4.00) + (0.7/2.0)) 0.27 + 0.35 .62
Phenol Coefficient=————————————=——————=——=0.31
  2 2 2

ПРИЛОЖЕНИЕ.

МЕТРИЧЕСКАЯ И ИМПЕРСКАЯ СИСТЕМЫ ВЕСОВ И МЕР.

Исходной единицей метрической системы является метр (м) или единица длины, представляющая одну четырехмиллионную часть окружности Земли вокруг полюсов.

Единицей массы является грамм (г), который представляет вес одного кубического сантиметра воды при ее максимальной плотности (а именно 4° C и давлении ртутного столба 760 мм).

Единицей измерения объема является литр (л), который представляет объем одного килограмма дистиллированной воды при ее максимальной плотности.

Десятичные подразделения каждой из единиц обозначаются латинскими приставками milli = 1/1000; centi = 1/100; deci = 1/10; кратные каждой единицы — греческими приставками deka = 10; hecto = 100; kilo = 1000; myria = 10 000.

Для сравнения значений некоторых наиболее часто используемых выражений метрической системы и имперской системы может оказаться удобным для справки следующее:

Длина:

1 миллиметр (= 1 мм) = 1/25 дюйма.

1 сантиметр (= 1 см) = 2/5 дюйма.

1 дюйм (1") = 25 миллиметров или 2-1/2 сантиметра.

Масса:

1 миллиграмм (= 1 мг) = 0,01543 грана (или приблизительно 1/64 грана).

1 грамм (= 1 г) = 15,4323 грана.

1 «кило» или килограмм (= 1 кг) = 2 фунта, 3-1/4 унции эвердьюпойс.

1 фунт эвердьюпойс (= 1 фунт) = 453,592 грамма.

1 унция эвердьюпойс (= 1 унция) = 28,35 грамма.

1 гран = 0,0648 грамма или 64,8 миллиграмма.

Объем:

1 кубический сантиметр (= 1 куб. см) = 16,9 минима имперской меры.

1 литр (= 1 л) = 35,196 жидкой унции имперской меры.

1 жидкая унция имперской меры (= 1 ℥) = 28,42 кубических сантиметра.

1 пинта имперской меры (= 1 O.) = 568,34 кубических сантиметра.

1 галлон имперской меры (= 1 C.) = 4,546 литра, или 10 фунтов эвердьюпойс чистой воды при 62° F и атмосферном давлении 30 дюймов ртутного столба.

Коэффициенты для пересчета из одной системы в другую.

To convert grammes into grains× 15.432.
To convert grammes into ounces avoirdupois× 0.03527.
To convert kilogrammes into pounds× 2.2046.
To convert cubic centimetres into fluid ounces imperial× 0.0352.
To convert litres into fluid ounces imperial× 35.2.
To convert metres into inches× 39.37.
To convert grains into grammes× 0.0648.
To convert avoirdupois ounces into grammes× 28.35.
To convert troy ounces into grammes× 31.104.
To convert fluid ounces into cubic centimetres× 28.42.
To convert pints into litres× 0.568.
To convert inches into metres× 0.0254.

ТАБЛИЦА ДЛЯ ПЕРЕСЧЕТА ГРАДУСОВ ЦЕЛЬСИЯ В ГРАДУСЫ ФАРЕНГЕЙТА.

X° C. = ((9x/5) + 32)° F.

Cent. Faht.  Cent. Faht.  Cent. Faht.
0 32.0  34 93.2  68 154.4
1 33.8  35 95.0  69 156.2
2 35.6  36 96.8  70 158.0
3 37.4  37 98.6  71 159.8
4 39.2  38 100.4  72 161.6
5 41.0  39 102.2  73 163.4
6 42.8  40 104.0  74 165.2
7 44.6  41 105.8  75 167.0
8 46.4  42 107.6  76 168.8
9 48.2  43 109.4  77 170.6
10 50.0  44 111.2  78 172.4
11 51.8  45 113.0  79 174.2
12 53.6  46 114.8  80 176.0
13 55.4  47 116.6  81 177.8
14 57.2  48 118.4  82 179.6
15 59.0  49 120.2  83 181.4
16 60.8  50 122.0  84 183.2
17 62.6  51 123.8  85 185.0
18 64.4  52 125.6  86 186.8
19 66.2  53 127.4  87 188.6
20 68.0  54 129.2  88 190.4
21 69.8  55 131.0  89 192.2
22 71.6  56 132.8  90 194.0
23 73.4  57 134.6  91 195.8
24 75.2  58 136.4  92 197.6
25 77.0  59 138.2  93 199.4
26 78.8  60 140.0  94 201.2
27 80.6  61 141.8  95 203.0
28 82.4  62 143.6  96 204.8
29 84.2  63 145.4  97 206.6
30 86.0  64 147.2  98 208.4
31 87.8  65 149.0  99 210.2
32 89.6  66 150.8  100 212.0
33 91.4  67 152.6   

ТАБЛИЦА ДЛЯ ПЕРЕСЧЕТА ГРАДУСОВ ФАРЕНГЕЙТА В ГРАДУСЫ ЦЕЛЬСИЯ.

X° F. = (5(x - 32))/9° C.

Faht.Cent. Faht.Cent. Faht.Cent. Faht.Cent. Faht.Cent.
320. 6820.0 10440.0 14060.0 17680.0
330.6 6920.6 10540.6 14160.6 17780.6
341.1 7021.1 10641.1 14261.1 17881.1
351.7 7121.7 10741.7 14361.7 17981.7
362.2 7222.2 10842.2 14462.2 18082.2
372.8 7322.8 10942.8 14562.8 18182.8
383.3 7423.3 11043.3 14663.3 18283.3
393.9 7523.9 11143.9 14763.9 18383.9
404.4 7624.4 11244.4 14864.4 18484.4
415.0 7725.0 11345.0 14965.0 18585.0
425.6 7825.6 11445.6 15065.6 18685.6
436.1 7926.1 11546.1 15166.1 18786.1
446.7 8026.7 11646.7 15266.7 18886.7
457.2 8127.2 11747.2 15367.2 18987.2
467.8 8227.8 11847.8 15467.8 19087.8
478.3 8328.3 11948.3 15568.3 19188.3
488.9 8428.9 12048.9 15668.9 19288.9
499.4 8529.4 12149.4 15769.4 19389.4
5010.0 8630.0 12250.0 15870.0 19490.0
5110.6 8730.6 12350.6 15970.6 19590.6
5211.1 8831.1 12451.1 16071.1 19691.1
5311.7 8931.7 12551.7 16171.7 19791.7
5412.2 9032.2 12652.2 16272.2 19892.2
5512.8 9132.8 12752.8 16372.8 19992.8
5613.3 9233.3 12853.3 16473.3 20093.3
5713.9 9333.9 12953.9 16573.9 20193.9
5814.4 9434.4 13054.4 16674.4 20294.4
5915.0 9535.0 13155.0 16775.0 20395.0
6015.6 9635.6 13255.6 16875.6 20495.6
6116.1 9736.1 13356.1 16976.1 20596.1
6216.7 9836.7 13456.7 17076.7 20696.7
6317.2 9937.2 13557.2 17177.2 20797.2
6417.8 10037.8 13657.8 17277.8 20897.8
6518.3 10138.3 13758.3 17378.3 20998.3
6618.9 10238.9 13858.9 17478.9 21098.9
6719.4 10339.4 13959.4 17579.4 21199.4
            212100.0

Формула процентного содержания для добавления солей и т. д. в готовые питательные среды.

Формула для приготовления желаемого процентного содержания данной соли и т. д. в питательных средах в пробирках; например, для приготовления 4-процентного раствора KNO3 в серии пробирок с бульоном, каждая из которых содержит 10 см³ среды, при наличии 25-процентного исходного водного раствора нитрата калия.

(N + X) Y A (X)
———————=—————
100 100

N = количество кубических сантиметров, содержащихся в каждой пробирке.

X = количество исходного раствора, которое необходимо добавить в каждую пробирку.

Y = требуемый процент в среде.

A = процентное содержание исходного раствора.

Тогда

(10 + X) 4 25X
——————=———
100 100

Therefore, 40 + 4X = 25X.

Therefore, 21X = 40.

X = 1.9 c.c.

Это учитывает раствор, добавляемый к исходному объему среды.

Следовательно, 10 см³ бульона + 1,9 см³ 25-процентного водного раствора KNO3 дают 11,9 см³ среды, содержащей 4% KNO3.

ТАБЛИЦЫ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАЗВЕДЕНИЙ

(сыворотки, дезинфицирующих средств или других веществ).

При оценке содержания агглютинина или титра сыворотки, тестировании дезинфицирующих средств и для многих других целей возникает необходимость приготовления серии разведений исследуемого материала, и во избежание излишних трудозатрат удобно придерживаться определенной шкалы приращения, например, следующей:

От разведений 1:10 до 1:80 повышение с шагом 5. От разведений 1:80 до 1:200 повышение с шагом 10. От разведений 1:200 до 1:400 повышение с шагом 25. От разведений 1:400 до 1:500 повышение с шагом 50. От разведений 1:500 до 1:1000 повышение с шагом 100. От разведений 1:1000 до 1:5000 повышение с шагом 250. От разведений 1:5000 до 1:10 000 повышение с шагом 1000. От разведений 1:10 000 до 1:100 000 повышение с шагом 5000. От разведений 1:100 000 до 1:1 000 000 повышение с шагом 100 000.

При работе с веществом неизвестной силы — что особенно верно в отношении агглютинирующих сывороток — принято проводить предварительный тест, используя несколько широко разнесенных разведений, которые можно получить следующим образом:

Первое разведение — I.

1 см³ сыворотки + 9 см³ физиологического раствора = 10-процентный раствор или разведение 1:10 (из которого 1 см³ содержит 0,1 см³ исходной сыворотки).

При работе с жидкостями, отличными от сыворотки, разбавителем обычно служит дистиллированная вода; если же исходное вещество является твердым, инструкции будут выглядеть так:

1 грамм исходного вещества + 10 см³ дистиллированной воды = 10-процентный раствор и т. д.

Второе разведение — II.

1 см³ первого разведения + 9 см³ физиологического раствора = 1-процентный раствор или разведение 1:100.

Третье разведение — III.

1 см³ второго разведения + 9 см³ физиологического раствора = 1-промилле раствор или разведение 1:1000.

Четвертое разведение — IV.

1 c.c. second dilution + 9 c.c. normal saline solution = 0.1 per mille
solution or 1: 10,000 dilution.

Следующие таблицы, показывающие вторичные разведения, которые можно легко приготовить из каждого из этих четырех первичных разведений для использования при последующем определении точного титра, вероятно, окажутся полезными для тех, кто не является математиком.

ТАБЛИЦЫ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАЗВЕДЕНИЙ.

TABLE I

Using 10 % stock solution
 First dilution + Diluent TABLE II
 Using 1% stock solution
 Second dilution + Diluent
1: 10 = 1 c.c. + 0 c.c. 1: 100 = 1 c.c. + 0 c.c.
1: 15 = 1 c.c. + 0.5 c.c. 1: 110 = 1 c.c. + 0.1 c.c.
1: 20 = 1 c.c. + 1.0 c.c. 1: 120 = 1 c.c. + 0.2 c.c.
1: 25 = 1 c.c. + 1.5 c.c. [1: 125 = 1 c.c. + 0.25 c.c.]
1: 30 = 1 c.c. + 2.0 c.c. 1: 130 = 1 c.c. + 0.3 c.c.
1: 35 = 1 c.c. + 2.5 c.c. 1: 140 = 1 c.c. + 0.4 c.c.
1: 40 = 1 c.c. + 3.0 c.c. 1: 150 = 1 c.c. + 0.5 c.c.
1: 45 = 1 c.c. + 3.5 c.c. 1: 160 = 1 c.c. + 0.6 c.c.
1: 50 = 1 c.c. + 4.0 c.c. 1: 170 = 1 c.c. + 0.7 c.c.
1: 55 = 1 c.c. + 4.5 c.c. [1: 175 = 1 c.c. + 0.75 c.c.]
1: 60 = 1 c.c. + 5.0 c.c. 1: 180 = 1 c.c. + 0.8 c.c.
1: 65 = 1 c.c. + 5.5 c.c. 1: 190 = 1 c.c. + 0.9 c.c.
1: 70 = 1 c.c. + 6.0 c.c. 1: 200 = 1 c.c. + 1.0 c.c.
1: 75 = 1 c.c. + 6.5 c.c.————————————————-
1: 80 = 1 c.c. + 7.0 c.c. 1: 200 = 1 c.c. + 1.0 c.c.
——————————————— 1: 225 = 1 c.c. + 1.25 c.c.
1: 80 = 1 c.c. + 7.0 c.c. 1: 250 = 1 c.c. + 1.5 c.c.
1: 90 = 1 c.c. + 8.0 c.c. 1: 275 = 1 c.c. + 1.75 c.c.
1: 100 = 1 c.c. + 9.00 c.c. 1: 300 = 1 c.c. + 2.0 c.c.
1: 110 = 1 c.c. + 10.0 c.c. 1: 325 = 1 c.c. + 2.25 c.c.
1: 120 = 1 c.c. + 11.0 c.c. 1: 350 = 1 c.c. + 2.5 c.c.
[1: 125 = 1 c.c. + 11.5 c.c.] 1: 375 = 1 c.c. + 2.75 c.c.
1: 130 = 1 c.c. + 12.0 c.c. 1: 400 = 1 c.c. + 3.0 c.c.
1: 140 = 1 c.c. + 13.0 c.c.————————————————-
1: 150 = 1 c.c. + 14.0 c.c. 1: 400 = 1 c.c. + 3.0 c.c.
1: 160 = 1 c.c. + 15.0 c.c. 1: 450 = 1 c.c. + 3.5 c.c.
1: 170 = 1 c.c. + 16.0 c.c. 1: 500 = 1 c.c. + 4.0 c.c.
[1: 175 = 1 c.c. +-16.5 c.c.]————————————————-
1: 180 = 1 c.c. + 17.0 c.c. 1: 500 = 1 c.c. + 4.0 c.c.
1: 190 = 1 c.c. + 18.0 c.c. 1: 600 = 1 c.c. + 5.0 c.c.
1: 200 = 1 c.c. + 19.0 c.c. 1: 700 = 1 c.c. + 6.0 c.c.
———————— —————— [1: 750 = 1 c.c. + 6.5 c.c.]
1: 200 = 1 c.c. + 19.0 c.c. 1: 800 = 1 c.c. + 7.0 c.c.
1: 225 = 1 c.c. + 21.5 c.c. 1: 900 = 1 c.c. + 8.0 c.c.
1: 250 = 1 c.c. + 24.0 c.c. 1: 1000 = 1 c.c. + 9.0 c.c.
1: 275 = 1 c.c. + 26.5 c.c.————————————————
1: 300 = 1 c.c. + 29.0 c.c. 1: 1000 = 1 c.c. + 9.0 c.c.
1: 325 = 1 c.c. +-31.5 c.c. 1: 2000 = 1 c.c. + 19.0 c.c.
1: 350 = 1 c.c. + 34.0 c.c. 1: 3000 = 1 c.c. + 29.0 c.c.
1: 375 = 1 c.c. + 36.5 c.c. 1: 4000 = 1 c.c. + 39.0 c.c.
1: 400 = 1 c.c. + 39.0 c.c. 1: 5000 = 1 c.c. + 49.0 c.c.
———————————————————————————————
1: 400 = 1 c.c. + 39.0 c.c. 
1: 450 = 1 c.c. + 44.5 c.c. 
1: 500 = 1 c.c. + 49.0 c.c. 

TABLE III
 Using 0.1% stock solution

Third dilution + Diluent TABLE IV
 Using 0.01% stock solution

Fourth Dilution + Diluent
1: 1000 = 1 c.c. + 0 c.c. 1: 10,000 = 1 c.c. + 0 c.c.
1: 1250 = 1 c.c. + 0.25 c.c. 1: 15,000 = 1 c.c. + 0.5 c.c.
1: 1500 = 1 c.c. + 0.5 c.c. 1: 20,000 = 1 c.c. + 1.0 c.c.
1: 1750 = 1 c.c. + 0.75 c.c. 1: 25,000 = 1 c.c. + 1.5 c.c.
1: 2000 = 1 c.c. + 1.0 c.c. 1: 30,000 = 1 c.c. + 2.0 c.c.
1: 2250 = 1 c.c. + 1.25 c.c. 1: 35,000 = 1 c.c. + 2.5 c.c.
1: 2500 = 1 c.c. + 1.5 c.c. 1: 40,000 = 1 c.c. + 3.0 c.c.
1: 2750 = 1 c.c. + 1.75 c.c. 1: 45,000 = 1 c.c. + 3.5 c.c.
1: 3000 = 1 c.c. + 2.0 c.c. 1: 50,000 = 1 c.c. + 4.0 c.c.
1: 3250 = 1 c.c. + 2.25 c.c. 1: 55,000 = 1 c.c. + 4.5 c.c.
1: 3500 = 1 c.c. + 2.5 c.c. 1: 60,000 = 1 c.c. + 5.0 c.c.
1: 3750 = 1 c.c. + 2.75 c.c. 1: 65,000 = 1 c.c. + 5.5 c.c.
1: 4000 = 1 c.c. + 3.0 c.c. 1: 70,000 = 1 c.c. + 6.0 c.c.
1: 4250 = 1 c.c. + 3.25 c.c. 1: 75,000 = 1 c.c. + 6.5 c.c.
1: 4500 = 1 c.c. + 3.5 c.c. 1: 80,000 = 1 c.c. + 7.0 c.c.
1: 4750 = 1 c.c. + 3.75 c.c. 1: 85,000 = 1 c.c. + 7.5 c.c.
1: 5000 = 1 c.c. + 4.0 c.c. 1: 90,000 = 1 c.c. + 8.0 c.c.
1: 5000 = 1 c.c. + 4.0 c.c. 1: 100,000 = 1 c.c. + 9.0 c.c.
1: 6000 = 1 c.c. + 5.0 c.c. ——————————
1: 7000 = 1 c.c. + 6.0 c.c. 1: 100,000 = 0.1 c.c. + 0.9 c.c.
[1: 7500 = 1 c.c. + 6.5 c.c.] 1: 200,000 = 0.1 c.c. + 1.9 c.c.
1: 8000 = 1 c.c. + 7.0 c.c. [1: 250,000 = 0.1 c.c. + 2.4 c.c.]
1: 9000 = 1 c.c. + 8.0 c.c. 1: 300,000 = 0.1 c.c. + 2.9 c.c.
1: 10,000 = 1 c.c. + 9.0 c.c. 1: 400,000 = 0.1 c.c. + 3.9 c.c.
 ——————————————— 1: 500,000 = 0.1 c.c. + 4.9 c.c.
1: 10,000 = 1 c.c. + 9.0 c.c.—————————————————-
1: 15,000 = 1 c.c. + 14.0 c.c. 1: 500,000 = 0.1 c.c. + 4.9 c.c.
1: 20,000 = 1 c.c. + 19.0 c.c. 1: 600,000 = 0.1 c.c. + 5.9 c.c.
1: 25,000 = 1 c.c. + 24.0 c.c. 1: 700,000 = 0.1 c.c. + 6.9 c.c.
1: 30,000 = 1 c.c. + 29.0 c.c. [1: 750,000 = 0.1 c.c. + 7.4 c.c.]
———————————————— 1: 800,000 = 0.1 c.c. + 7.9 c.c.
   1: 900,000 = 0.1 c.c. + 8.9 c.c.
   1:1,000,000 = 0.1 c.c. + 9.9 c.c.

ТАБЛИЦА ТЕМПЕРАТУРЫ И ДАВЛЕНИЯ.

Temperature

Centigrade Mm. of Hg. Pounds per sq. in.
 absolute pressure Atmospheres
98° 707.1 13.7 0.93
99° 733.1 14.2 0.96
100° 760.0 14.7 1.00
       
101° 787.8 15.2 1.03
102° 816.0 15.8 1.07
103° 845.2 16.3 1.11
104° 875.4 16.9 1.15
105° 906.4 17.5 1.19
       
106° 938.3 18.1 1.23
107° 971.1 18.8 1.27
108° 1004.9 19.4 1.32
109° 1039.6 20.1 1.36
110° 1075.3 20.8 1.41
       
111° 1112.0 21.5 1.46
112° 1149.8 22.2 1.51
113° 1188.6 22.9 1.56
114° 1228.4 23.7 1.61
115° 1269.4 24.5 1.67
       
116° 1311.4 25.3 1.72
117° 1354.6 26.2 1.78
118° 1399.0 27.0 1.84
119° 1444.5 27.9 1.90
120° 1491.2 28.8 1.96
       
121° 1539.2 29.7 2.02
122° 1588.4 30.7 2.09
123° 1638.9 31.7 2.15
124° 1690.7 32.7 2.22
125° 1743.8 33.7 2.29

ТАБЛИЦА ДЛЯ ВЫСУШИВАНИЯ ПРИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ В ВАКУУМЕ.

Temperature
 Centigrade Mm. of Hg.
21° 18.4
22° 19.6
23° 20.8
24° 22.1
25° 23.5
   
26° 24.9
27° 26.4
28° 28.0
29° 29.7
30° 31.5
   
31° 33.3
32° 35.3
33° 37.3
34° 39.5
35° 41.7
   
36° 44.1
37° 46.6
38° 49.2
39° 51.9
40° 54.8
   
41° 57.8
42° 61.0
43° 64.3
44° 67.7
45° 71.3
   
46° 75.1
47° 79.0
48° 83.1
49° 87.4
50° 91.9

МЕТОД АНТИФОРМИНА

Для обнаружения B. Tuberculosis.

Антиформин был введен в бактериологическую технику Уленхутом в 1908 году с целью обнаружения туберкулезных бацилл, когда они присутствуют в небольшом количестве в мокроте или другом материале. Это мощный окислитель, который быстро разрушает большинство бактерий, но туберкулезные и другие кислотоустойчивые организмы сопротивляются его губительному действию в течение значительного времени, и на этом факте основан данный метод.

Для приготовления антиформина отмерьте и смешайте:

Жавелевая вода (Liquor sodæ chlorinatæ — B.P.) 50 см³ Раствор едкого натра 15-процентный водный 50 см³

Метод.

1. Поместите мокроту или другой материал (например, осадок молока и сливки; гной; измельченную железу или другой орган; казеозный материал; разрушенные очаги и т. д.) в стерильную пробирку, а затем добавьте равный объем антиформина.

2. Закройте пробирку резиновой пробкой и энергично встряхните (образец антиформина, который не «пенится» на этой стадии, малопригоден). Дезинтеграция материала начинается немедленно, сопутствующие бактерии разрушаются, и смесь быстро превращается в однородную, но мутную жидкость — процесс, который можно ускорить:

3. Поместив пробирку в инкубатор при 37° C на 30 минут, время от времени встряхивая.

4. Тщательно центрифугируйте жидкость на высокой скорости.

5. Пипеткой удалите надосадочную жидкость, долейте стерильную дистиллированную воду, закройте пробирку пробкой и встряхните, чтобы распределить осадок в воде. Снова центрифугируйте.

6. Повторите шаги 4 и 5 еще дважды.

7. Используйте одну часть конечного осадка для инокуляции морских свинок.

8. Оставшуюся часть осадка обильно нанесите на яичную среду Дорсета; закройте колпачком и инкубируйте при 37° C.

Примечание. — Если нужны только микроскопические мазки, заполните центрифужную пробирку лигроином (петролейным эфиром) вместо стерильной дистиллированной воды на шаге 5 и приготовьте мазки с поверхности жидкости для окрашивания по методу Циль-Нильсена.

УКАЗАТЕЛЬ

Конденсор Аббе, 7; окраска спор по Эбботту, 107; аберрация хроматическая, 56; сферическая, 55; абсолютный спирт как фиксатор, 82; как антисептик, 27; абсорбирующая бумага для высушивания покровных стекол, 69; смесь A.C.E., 345; уксусная кислота для просветления мазков, 82; ахроматический конденсор, 54; кислый гематин, 96; образование кислоты, таблица анализа, 283; бактериями, 145; исследование, 280; качественное исследование, 283, 284; количественное исследование, 280; кислотоустойчивые бациллы в тканях, окраска, 124; действие различных газов на бактерии, 295; активная иммунизация, иллюстративный пример, 322; регулируемая водяная баня, 299; аэробные культуры, 221; аэрогенные бактерии, 131; эскулиновый агар, 204; агар-желатин (Гуарниари), 194; методы приготовления, 167; поверхностные пластинки, 232; агар-агар, приготовление, 167; реакция агглютинации, макроскопическая, 386; микроскопическая, 385; агглютинин, 381; воздух, анализ, 468; фильтр, 40; насос, Герик, 43; альбуминовый раствор Майера, 120; образование спирта, тест, 285; щелочной пирогаллол, 239; квасцовый кармин, 96; аммиак, тест на образование, 285; амфитрихиальные бактерии, 136; анаэробные культуры, 236; метод Боткина, 243; метод Бухнера, 238; метод Буллока, 245; метод Гессе, 237; метод Маклеода, 240; среды, 180; метод Нови, 244; анаэробные культуры, биологический метод Ру, 237; физический метод, 237; вакуумный метод, 238; метод Райта, 239; анестетики, 345; анализ воздуха, аппаратура, 469; метод, 468; качественный бактериологический, 470; количественный бактериологический, 468; сливочного масла, качественный бактериологический, 458; количественный бактериологический, 457; сливок, качественный бактериологический, 458; количественный бактериологический, 457; рыбы, 460; мороженого, качественный бактериологический, 457; мяса, аппаратура, 460; метод, 460; качественный бактериологический, 462; молока, аппаратура, 444; сбор образцов, 441; метод, 441; качественный бактериологический, 446; количественный бактериологический, 444; устриц, 463; сточных вод, качественный бактериологический, 467; количественный бактериологический, 466; моллюсков, 463; почвы, аппаратура, 473; сбор образцов, 471; метод, 470; качественный бактериологический, 476; количественный бактериологический, 473; воды, аппаратура, 420, 427; сбор образцов, 416; метод, 416; качественный бактериологический, 426; анализ воды, количественный бактериологический, 420; анилиновые красители, 83; генцианвиолет, 95; анилиновая вода, приготовление, 108; среды из тканей животных (Фругони), 210; животные, естественные инфекции, 337; метод антиформина для B. tuberculosis, 502; антиген, определение, 324; антисептики, 27; действие, 310; видимые загрязнения в молоке, 450; паровой стерилизатор Арнольда, 34; артрогенные споры, 138; асцитический бульон, 210; асцитический агар (Вассерман), 213; аскомицеты, 128; аскоспоры, 129; аспарагиновые среды (Френкель и Фогес), 183; (Ушинский), 183; аспергиллы, 127; атмосферные условия, 295; аттенуация вирулентности организмов, 321; автоклав, 37; использование, 37; автоматические пипетки, 13; аутопсии, 396; аутопсия, картотека, 402; бациллы, морфология, 132; Bacillus anthracis в почве, 477; в воде, 440; B. coli в воде, обнаружение, 429; B. diphtheriæ в молоке, 452; B. enteritidis в воде, 437; B. sporogenes в молоке, 452; в воде, 438; B. œdematis maligni в почве, 477; B. tetani в почве, 477; в воде, 441; B. tuberculosis в молоке, 453; метод антиформина, 502; B. typhosus в воде, 441; бактерии, анатомия, 134; классификация, 131; группировка для изучения, 410; в тканях, демонстрация, 114; влияние среды, 142; продукты метаболизма, 143; методы идентификации, 259; микроскопическое исследование, окрашенные, 81; неокрашенные, 74; физиология, 136; бактерии, простые методы окраски, 90; бактериальная эмульсия, приготовление, 389; бактериальные ферменты, 144, 277; бактериальные ферменты, 144; питательные вещества, 142; токсины, 144; бактериологические анализы, общие соображения, 415; исследование крови, 377; основание микроскопа, 50; базидий, 128; пивное сусло, приготовление, 175; среды из свеклы, 200; Beggiotoa, морфология, 133; бензольная баня, 256; фильтр Беркефельда, 42; раствор Бейринка I, 197; II, 198; агар с желчными солями (МакКонки), 205; бульон, двойной концентрации, 199; (МакКонки), 180; биохимическое исследование культур, 276; биохимия бактерий, 276; биологическая дифференциация бактерий, 249; биполярное прорастание, 140; бисмарк-коричневый, 94; бластомицеты, морфология, 129; кровяной агар, 171, 214; пластинки, животные, 251; человеческие, 250; (Уошборн), 214; бактериологическое исследование крови, 377; клетки крови, промывка, 388; сбор крови для серологического исследования, 379; мазки крови, приготовление, 376; окраска, 97; гистологическое исследование крови, 373; пипетки для крови, 11; серологическое исследование крови, 378; красители для крови, 97; сыворотка крови (Коунсилмен и Мэллори), 208; сгущенная, 168; (Леффлер), 208; (Лоррен Смит), 208; паяльная трубка, 9; богемская колба, 4; кипящая вода, 33; костный мозг, мазки, приготовление, 400; реакция Борде-Жангу, 393; борная кислота в молоке, тест, 442; анаэробный метод Боткина, 243; бульон, приготовление, 163; экстракт мозга, 149; хлебная паста, 193; агар с бриллиантовым зеленым (Конради), 206; агар с желчными солями и бриллиантовым зеленым (Фокус), 206; броуновское движение, 79; анаэробный метод Бухнера, 238; анаэробный метод Буллока, 245; пробирки для постоянных препаратов, 407; протрава Бунге, 104; окраска китайской тушью по Бурри, 77; сливочное масло, анализ, 457; качественный анализ, 458; количественный анализ, 457; труп, подготовка к аутопсии, 397; клетки для морских свинок, 343; для лабораторных животных, 341; для мышей, 342; для кроликов, 343; для крыс, 342; расчетная величина веса массы среды, 166, 167; метод свечи Камбье для изоляции группы coli-typhoid, 438; камера люцида, 62; среда Капальди-Проскауэра, № I, 186; № II, 187; капиллярные пипетки, 10; градуированные, 13; головчатые бациллы, 139; образование капсул, 134; бактерий, 134; терморегулятор, 218; капсулы, инокуляция коллодиевых, 357; приготовление, 357; стеклянные, 6; очистка зараженных, 20; новых, 18; окраска, 99; стерилизация, 31; углеводные среды, приготовление, 177; карболовая кислота как гермицид, 27, 481; метод изоляции группы coli-typhoid, 437; карболизованный агар, 202; бульон, 202; желатин, 202; углекислый газ в культурах, тест, 289; картотека, 336, 402; среды из моркови, 200; кедровое масло для иммерсионного объектива, 88; клеточная стенка бактерий, 134; целлоидиновые мешочки, изготовление, 358; клеточный инкубатор, 216; центрифуга для работы с кровью и сывороткой, 327; для работы с молоком, 447; центрифугированное молоко, 449; градусы Цельсия, пересчет, 494; химические продукты бактерий, 145; агар с китайской зеленью (Вербицкий), 207; хлороформ как антисептик, 27; хроматическая аберрация, 56; хромогенные бактерии, 131; хромопарные бактерии, 144; хромофорные бактерии, 144; цитратный кровяной агар, 191; Cladothrix, морфология, 193; классификация бактерий, 131; грибов, 126; булавовидные бациллы, 139; просветление мазков уксусной кислотой, 82; Clostridium, 139; грубая настройка, 51; паутинный микрометр, 66; кокаин, 345; кокки, морфология, 131; кокцидиозная инфекция, 339; коэффициент, низший летальный, 312; ингибирования, 311; фенольный, 489; высший летальный, 313; раствор Кона, 191; холодный инкубатор, 217; группа coli-typhoid, дифференциальная таблица, 433; в молоке, 451; в почве, 477; изоляция, 432; представители, 430; сбор крови для бактериологического исследования, 378; для приготовления сред, 168; образцов молока, 443; патологического материала при жизни, 373; гноя, 373; образцов почвы, 471; образцов воды, 416; коллодиевые капсулы, 357; мешочки, изготовление, 357; колонии бактерий, края, 267; цветной свет, действие, 309; колумелла, 127; сравнительная гемоцитология, 374; комплемент, определение, 325; реакция связывания, 393; метод концентрации при анализе воды, 434; конденсор ахроматический, 54; темнопольный, 60; параболоидный, 60; подставочный, 54; конидий, 128; непрерывная стерилизация, 36; контрастные красители, 93; сулема (Ланг), 82; ватный фильтр, 40; контрастное окрашивание мазков, 84; подсчет колоний на пластинках, 423; мазки на покровных стеклах, 81; очистка новых, 22; использованных, 24; ящики для пробирок, 31; сливки, анализ, 457; качественный анализ, 458; количественный анализ, 457; Crenothrix, морфология, 133; критерии инфекции, 370; критерий иммунитета, 324; культуральные признаки, макроскопическое исследование, 261; культуральная колба, Гая, 5; Колле, 4; Ру, 5; клиновидные бациллы, 139; кожная инокуляция, 352; темнопольный конденсор, 60; освещение, 87; дочерние клетки, 129; дневной свет, рассеянный, действие, 308; десятичные шкалы, 340; обесцвечивающие агенты, 84; определение объектива, 56; депиляторный порошок, 346; описание чашечной культуры, 261; описательные термины, 261; высушивание, эффекты, 306; таблица, 501; эксикатор Мюллера, 307; раствор декстрозы, приготовление, 178; диафрагма, ирисная, 53; диастатические ферменты, тесты, 278; дифференциальное атмосферное культивирование, 257; инкубация, 255; среды, 255; стерилизация, 256; разбавляющая камера, 248; разведение пипеткой с грушей, 383; сыворотки, 382; таблицы, 498; разведения, приготовление, 496; дифтерия, бацилла, в молоке, 452; диплобациллы, морфология, 133; диплококки, морфология, 133; Diplococcus pneumoniæ, иммунизация против, 322; прерывистая стерилизация, 36; диски из гипса, 192; дезинфицирующие средства, действие, 310; химические, 27; тестирование, 480; диссоциирующая жидкость Прайс-Джонса, 400; дозировка инокулята, 316; двойной револьвер, 58; красители для спор, 106; агар с двойным сахаром (Рассел), 207; капельная бутыль, 73; сухой жар, 28; раствор Дурхэма, 177; красители, анилиновые, 83; глиняная коробка для грязных предметных стекол, 70; агар с земляными солями (Липман и Браун), 197; край отдельных колоний, характеристики, 267; агар с яичным альбумином, 213; бульон (Липшуц), 213; яичные среды (Дорсет), приготовление, 174; сгущенные, 212; (Лубенау), 209; (Тарханов и Колесников), 212; очистка питательных сред яйцом, 166; окуляр Эрлиха, 55; эйконометр, 65; молочно-рисовая среда Айзенберга, 189; электрический стоматологический двигатель, 360; сигнальные часы, 38; теплый столик, 59; возвышение колоний, 263; желатин Эйснера, 204; метод изоляции группы coli-typhoid, 438; эндогенные споры, 138; разновидности, 139; эндо-прорастание, 139; английский агар, Блаксалл, 193; подсчет колоний на пластинках, 423; диски, Джеффер, 424; Пейкс, 424; метод обогащения при анализе воды, 427; перечисление микроорганизмов, 423; условия окружающей среды, 142; образование ферментов, исследование, 277; эозин, 93; экваториальное прорастание, 140; колба Эрленмейера, 4; Ernstschen Koerner,

136; культура в столбике Эсмарха, 226; бутыль для сбора воды, 417; оценка реакции сред, 280; эфирное пламя, 28; растворимые в эфире кислоты, 284; эвкаин, 345; повышение вирулентности организмов, 320; исследование молока, 441; экспериментальные инфекции, изучение при жизни, 370; инокуляция животных, 332; внеклеточные токсины, 144; окуляр, Эрлих, 55; микрометр, 63; окуляры, 55; защита для глаз, 57; градусы Фаренгейта, пересчет, 495; эксперименты по кормлению, 369; реакции брожения, 279; ферментационные пробирки, 17; поле объектива, 56; филярный микрометр, 66; заполнение пробирок и т. д. средой, 160; мазки, 81; фиксация, 81; изготовление, 81; монтаж, 85; окраска, 83; фильтрующая свеча, закрытая, 47; открытая, 43; тестирование эффективности, 478; дезинфекция, 28; стерилизация, 29; колба, 6; фильтровальная бумага, складывание, 156; фильтры, ватные, 40; фарфоровые, 42; тестирование, 478; фильтрация, 40; аспирацией, 42; сред, 156; под давлением, 45; тонкая настройка, 51; головка шпинделя, 52; рыба, анализ, 460; бульон, 190; рыбий желатин, 190; желатин-агар, 190; вылавливание колоний, 253; деление, размножение, 136; фиксация, 81; теплом, 81; тканей, 114; фиксирующие жидкости для мазков, 82; жгутики, классификация бацилл, 136; окраска, 101; колба богемская, 4; Эрленмейера, 4; фильтровальная, 6; сывороточная Китасато, 6; культуральная Колле, 4; колбы и пробирки, закрытие ватой, 24; очистка грязных, 20; новых, 18; стерилизация, 31; Fleischwasser, 148; жидкие культуры, описание, 271; среды, 146; ножка микроскопа, 50; формальдегид в молоке, тест Хенера, 442; формалиновый метод консервации культур, 407; тканей, 404; дробная стерилизация, 33; раствор Френкеля и Фогеса, 183; бурав Френкеля, 472; метод замораживания для срезов, 115; французский агар с маннитом (Сабуро), 193; французский агар (Сабуро), 193; свежие препараты бактерий, 74; окраска капсул по Фридлендеру для срезов, 123; монтажная жидкость Фроста, 406; замороженные срезы, быстрый метод, 116; фуксин, 92; агар (Браун), 205; сульфитный агар (Эндо), 206; газовый анализ, качественный, 290; количественный, 290; аппарат для сбора газа, 291; генераторы, 242; образование газа бактериями, 289; пробирки для сред, 161; раствор Гаспарини, 193; желатиновый агар, 193; приготовление, 164; поверхностные пластинки, 231; общие анестетики, 345; генцианвиолет, 91; немецкая линованная бумага, 69; гермициды, 27; тестирование силы, 480; прорастание, 140; воздушный насос Герика, 43; стеклянная аппаратура, часто используемая, 3; очистка, 18; нож для резки стекла, 8; глюкозо-формиатный агар (Китасато), 180; бульон (Китасато), 180; желатин (Китасато), 180; глицеринизированный картофель, 209; глицериновый агар, 209; сыворотка крови, 208; бульон, 209; картофельный бульон, 203; бульон, 203; желатин Годби, 214; гонидий, 128; гонидофор, 128; градуированные капиллярные пипетки, 13; пипетки, 6; дифференциальная окраска по Грам-Клаудиусу, 109; по Граму, 108; Грам-Вейгерт для срезов, 121, 122; дифференциальная окраска по Грам-Вейгерту, 109; модифицированная, 110; карандаши для стекла, 72; группировка бактерий для изучения, 410; защищенный трепан, 360; агар-желатин Гуарниари, 194; клетки для морских свинок, 343; держатель, 350; раствор Галланда, 82; раствор камеди, приготовление, 116; культуральная бутыль Гая, 5; гипсовые блоки (Энгель и Хансен), 192; гематин, 95; гемоцитометр, 248; гематоксилин, 95; гемолизин, определение, 326; приготовление, 327; хранение, 331; гемолитическая сыворотка, титрование, 328; культура в висячем блоке (Хилл), 235; культуры в висячей капле, 233; исследование, 86, 79; приготовление, 78; постоянная окраска, 80; предметные стекла, 70; закалка тканей, 114; агар из фасоли, 200; бульон, 200; сенной настой, 200; водяная баня Хирсона, 299; тепло, эффект, 299; тест Хенера, 442; сывороточный агар Хеймана, 210; анаэробный метод Гессе, 237; гистологическое исследование крови, 373; держатель для морских свинок, 350; горячий воздух, 29; стерилизатор, 30; использование, 31; инкубатор, 217; воронка с горячей водой, 158; пластинки с кровяным агаром, 250; окуляр Гюйгенса, 55; водород, генерирующий аппарат, 242; в культуре, тест, 289; перекись водорода в молоке, тест, 442; гифомицеты, морфология, 126; размножение, 126; ледник для образцов воды, 419; мороженое, анализ, 457; осветитель для микроскопа, 67; иммунное тело, 393; иммунизация, методы, 321; имперская система, 492; коэффициенты пересчета, 493; оттискные мазки, 85; инкубаторы, 216; индексные карточки, 336, 403; индол, тест, 286; инфекция, определение, 370; общие наблюдения при жизни, 371; результаты, 404; влияние среды на рост бактерий, 142; ингаляция, жидкий инокулят, 365; порошкообразный инокулят, 366; коэффициент ингибирования, 310, 311; картотека инокуляций, 336; кожная, 352; внутричерепная, 360; внутримышечная, 355; внутриглазная, 362; внутрибрюшинная, 355; внутрилегочная, 363; внутривенная, 363; инокуляция коллодиевых капсул, 357; подкожная, 353; шприц, 344; инокулят, характер, 346; приготовление, 346; среды без инозита — бульон (Дурхэм), 183; нераздельные токсины, 144; прерывистая стерилизация, 36; внутриклеточные токсины, 144; интрацеребральная инокуляция, 362; внутричерепная, 360; внутрижелудочная, крупные животные, 367; метод Маркса, 367; внутримышечная, 355; внутриглазная, 362; внутрибрюшинная, 355; внутрилегочная, 363; внутривенная, 363; анаэробные культуры in vacuo, 289; инвертин-ферменты, тесты, 279; инволюционные формы, 137; раствор йода, 108; железный бульон, 185; пептонный раствор (Пейкс), 185; изоляция экспериментами на животных, 258; дифференциальной атмосферой, 257; инкубацией, 255; средами, 255; стерилизацией, 256; разведением, 248; чашечными культурами, 250; субкультуры, приготовление, 254; счетный диск Джеффера, 424; окраска по Дженнеру, 97; монтажная жидкость Йореса, 405; фиксирующий раствор Кайзерлинга, 405; сывороточный агар Кантхака, 211; убитые культуры, 318; водородный аппарат Киппа, 242; сывороточная колба Китасато, 6; бацилла Клебса-Леффлера в молоке, 452; паровой стерилизатор Коха, 34; культуральная колба Колле, 4; ферменты Lab, тест, 279; лабораторные животные, 335; сравнительная гематоцитология, 374; нормальная температура, 372; правила, 1; лактозо-лакмусовый агар (Вурц), 203; бульон, 203; желатин (Вурц), 203; лакмусовая сыворотка, 203; мазки, описание, 272; приготовление, 172; агар с нутрозой (Дригальский-Конради), 205; сыворотка, 195; агар, 196; желатин, 196; (Петрушка), 195; агар с малахитовым зеленым (Леффлер), 207; раствор солодового экстракта (Гершелл), 196; молоко, 172; рис (Айзенберг), 189; (Сойка), 189; раствор Негели, 191; агар Naehrstoff (Гессе и Ниднер), 199

нейтральный раствор лакмуса, 179 нитратный бульон, 185 пептонный раствор (Пейкс), 186 питательный, 146 агар-агар, 167 Среды, приготовление питательного бульона, 163 желатина, 164 нутрозный агар (Эйр), 172 агар с олеиновой кислотой (Флеминг), 201 питательная жидкость Омелянского, 189 бульон Париетти, 202 пастернак, 200 раствор Пастера, 191 пептонная вода с розоловой кислотой, 186 вода (Данхэм), 177 диски из гипса, 192 картофель, 174 желатина (Эльснер), 204 (Годби), 214 бульон, свободный от протеидов (Ушинский), 183 пептонные растворы с розоловой кислотой, 186 сывороточный бульон, 210 декстрозная вода (Хисс), 188 сахарная (Хисс), 188 вода, 170 сывороточный агар (Хейман), 210 (Кантака и Стивенса), 211 (Либмана), 212 (Вертхаймера), 211 силикатный гель (Виноградский), 198 твердая, 147 специальная, 182 исходная питательная, 163 сахар, 177 агар, 185 (декстрозный) бульон, 184 желатина, 184 сульфиндиготатный агар, 181 бульон (Вейль), 181 желатина (Вейль), 181 тканевая (Ногучи), 214 репа, 200 мочевой агар, 188 бульон, 187 желатина, 187 (Хеллер), 188 пшеничный бульон (Гасперини), 193 сывороточный агар, 195 желатина, 195 винное сусло, 192 раствор Виноградского (для нитрифицирующих организмов), 198 (для нитритных организмов), 198 агар на древесной золе, 201 сусло-агар, 176 желатина, 176 Среды, приготовление дрожжевой воды (Пастер), 191 стандартизация, 154 хранение в большом количестве, 159 хранение пробирок, 161 ящики для хранения, 162 титрование, 150 розлив питательных сред, 160 Merismopedia, морфология, 132 Мезофильные бактерии, 143 патогенные эффекты, 315 Конечные продукты метаболизма, 145 Метахроматические гранулы, 136 Металлические инструменты, стерилизация, 28 Метатрофные бактерии, 131 Методы культивирования, 221 идентификации бактерий, 259 инокуляции, 352 изоляции, 248 стерилизации, 26 Метиленовый синий, 90 Метрическая система, 492 коэффициенты пересчета, 493 Кармин Мейера, 96 Микробы-индикаторы, 426 Микрококки, морфология, 132 Micrococcus melitensis в молоке, 456 Микрометр, винтовой, 66 сетчатый, 63 окулярный, 63 объективный, 62 Микрометрия, методы, 61 Микрон, 61 Микроскоп, 49 Микроскопическое исследование бактерий, 86 окрашенных, 88 неокрашенных, 86 наблюдения культур, 272 Молоко, анализ, качественный, 446 количественный, 444 сгущенное, анализ, 444 среды, 193 приготовление, 172 рисовое (Эйзенберг), 193 (Сойка), 189 пробы, сбор, 443 пробирки для осаждения, 449 Минимальная летальная доза, 316 Зеркало микроскопа, 55 Окраска спор по Мёллеру, 107 Влажный жар, 32 Молекулярное движение, 79 Монотрихиальные бациллы, 136 Подвижность, исследование, 79 истинная, 80 Плесневые грибы, исследование, 126 для заливки в парафин, 117 , 119 Монтировка пленочных препаратов, 85 парафиновых срезов, 119 Клетки для мышей, 342 держатель, 351 весы, 341 Mucor mucedo, 126 Mucorinae, 126 Эксикатор Мюллера, 307 Муфельная печь, 28 Окраска капсул по Мьюру, 100 жгутиков по Мьюру, 101 Музейные препараты бактерий, 407 тканей, 404 герметизация, 406 Мицелий, 126 Микопротеин, 135 Раствор Негели, 191 Naehrstoff агар (Гессе и Ниднер), 199 Открытое пламя, 28 Окраска по Нейссеру модифицированная, 111 Сетчатый микрометр, 63 Нейтральный раствор лакмуса, приготовление, 179 красный, 94 Нитратный бульон, 185 пептонный раствор (Пейкс), 186 Нитрифицирующие организмы в почве, 478 Нитрозоиндольная реакция, 287 Нитритные организмы в почве, 477 Нормальные средние показатели (t.p.r.), 372 сыворотка, 375 Револьвер объективов, 57 двойной, 58 тройной, 58 Анаэробный метод Нови, 244 банки, 245 Ядра, окраска, 105 Ядро бактерий, 135 Числовая апертура, 56 Питательные среды, 146 Нутрозный агар (Эйр), приготовление, 172 Маркер объектов, 61 Объективы, 55 Скошенные культуры в пробирках, 223 Окулярный микрометр, 63 Окуляры, 55 Платиновая петля, 71 Oidium, 128 Масло чесночное, 27 горчичное, 27 Агар с олеиновой кислотой (Флеминг), 201 Питательная жидкость Омелянского, 189 Операционные столы (Эйра), 352 (Татена), 351 Опсонический индекс, 393 определение, 390 Опсонин, 387 Оптические характеристики колоний, 267 Оптимальная реакция среды, определение, 305 температура, определение, 298 Организмы нагноения, 409 Газовый аппарат Орса-Лунге, 292 Кармин Орта, 96 Окраска Actinomyces по Оксфорду, 112 Устрицы, анализ, 463 Счетный диск Пейкса, 424 Фильтр-резервуар, 45 Papier chardin, 158 Окраска по Паппенгейму, 111 Параболоидный конденсор, 60 Парахромофорные бактерии, 144 Парафиновый метод для срезов, 117 срезы, монтировка, 119 окраска, 121 Паратрофные бактерии, 131 Бульон Париетти, 202 метод изоляции группы coli-typhoid, 437 Среда из пастернака, 200 Пассажи вируса, 320 Фильтр Пастера-Шамберлана, 42 Пипетки Пастера, 10 Раствор Пастера, 191 Патогенез, исследование, 315 Патогенные бактерии, 131 изучение, 408 Педиококки, морфология, 132 Penicillium, 128 Пептонная вода с розоловой кислотой, 186 вода (Данхэм), приготовление, 177 Процентная формула, 496 Сулема, 27 Perisporaceae, 127 Перитрихиальные бациллы, 136 Постоянные препараты бактерий, 407 тканей, 404 Чашки Петри, 6 Фагоцитарный индекс, 392 Фенольный коэффициент, 489 образование, тест, 287 Фотогенные бактерии, 131, 144 Физиологический фильтр, 156 Раствор пикриновой кислоты, 121 (Шпенглера), 112 Пикрокармин, 97 Пигментообразование, наблюдения, 288 Пипетки, автоматические, 13 кровяные, 11 капиллярные, 10 футляры, 7 градуированные, 6 капиллярные, 13 Пастера, 10 седиментационные, 16 стандартные градуированные, 7 с резиновой грушей, 10 дроссельные, 13 очистка зараженных, 20 новых, 18 стерилизация, 31 Пиридиновый метод окраски спирохет, 124 Окраска жгутиков по Питфилду, 103 Плазмолиз, 135 Гипсовые диски, 192 Ящик для чашек, 7 культуры в чашках, описание, 261 приготовление, 226 штатив для выравнивания, 228 Пластинки, чашки Петри, 6 очистка зараженных, 20 новых, 18 стерилизация, 31 Платиновые иглы, 71 метод монтировки, 71 Плеоморфизм, 133 Полярное прорастание, 140 гранулы, 136 Polkoerner, 136 Полихромные окраски крови, 97 Смешанная сыворотка, 379 Фарфоровый фильтр, 42 Беркефельда, 42 Шамберлана, 42 Доултона, 42 Вскрытие экспериментальных животных, 396 Картофельная желатина (Эйснер), 204 (Годби), 214 среда, приготовление, 174 Мясные консервы, анализ, 460 Заливка пластинок, 227 Подготовка экспериментальных животных, 335 Консерванты в молоке, 442 Таблица давления и температуры, 500 Действие первичных цветов, 309 Бульон, свободный от протеидов (Ушинский), 183 Протеолитические ферменты, тесты, 277 Прототрофные бактерии, 131 Психрофильные бактерии, 143 патогенные эффекты, 315 Гной, сбор, 373 Раствор пирогалловой кислоты, 293 Качественный анализ воздуха, 470 молока, 446 сточных вод, 467 почвы, 476 испорченного мяса, 462 воды, 426 Количественный анализ воздуха, 468 молока, 444 сточных вод, 466 почвы, 473 испорченного мяса, 460 Клетки для кроликов, 343 чесотка, лечение, 338 весы, 340 Повышение вирулентности организмов, 320 Микрометр Рамсдена, 66 Диапазон реакции среды, измерение, 305 температуры, измерение, 298 Клетки для крыс, 342 Сырое молоко, тест Сола, 442 Реакция среды, 305 оптимальная, 305 диапазон, 305 шкала, 153 Таблица пониженного давления и температуры, 501 Восстанавливающие агенты, продукция, 389 тесты, 289 Восстановление нитратов, 389 Терморегулятор Рейхерта, 218 Отношение бактерий к окружающей среде, 142 Извлечение материала из пробирок с культурой, 74 Ренниновые ферменты, тесты, 279 Размножение бактерий, 136 Резистентное стекло, 6 к летальным агентам, 306 Стадия покоя бактерий, 137 Ограничения на экспериментальные инокуляции, 334 Окраска капсул по Рибберту, 101 Культуры уколом, 226 Пептонный раствор с розоловой кислотой, 186 Розиндольная реакция, 286 Анаэробный метод культивирования Ру, 237 культуральный флакон, 5 Среда Сабуро, 193 Saccharomyces, морфология, 129 Сафранин, 94 Салициловая кислота в молоке, тест, 443 Сапрогенные бактерии, 131 Сарцины, морфология, 132 Тест Сола, 442 Весы, десятичные, 340 чашечные, 164 Скальпели, стерилизация, 32, 33 Раствор Шаллибаума, 121 Схема изучения бактерий, 259 Schizomycetes, классификация, 131 морфология, 131 Ножницы, стерилизация, 32 Герметизация музейных банок, 406 Прижигатель, 397 Срезы, специальные методы окраски, 121 Седиментационные пипетки, 16 пробирки, 9 Выбор объективов, 57 Сенсибилизация красных кровяных телец, 395 Серийные культивирования, 251 Серологическое исследование крови, 378 Сывороточный агар (Хейман), 210 (Кантака и Стивенса), 211 (Либмана), 212 пластинки, 250 (Вертхаймера), 211 бульон, 210 сбор, 379 Декстрозная сывороточная вода (Хисс), 188 Сгуститель сыворотки, 169 Сахарные сывороточные среды (Хисс), 188 сывороточная вода, приготовление, 170 Сточные воды, анализ, качественный, 467 количественный, 466 Культуры в толще агара, 225 описание, 271 Форма колоний, 262 Бритье экспериментальных животных, 349 Моллюски, анализ, 463 Силикатный гель (Виноградский), 198 Простая окраска спор, 106 Размер колоний, 262 Скошенные культуры в пробирках, 223 Предметные стекла, очистка новых, 22 использованных, 23 Культура мазком, 224 описание, 268 Жидкое мыло, 346 Раствор соды, хранение исходного, 154 Бикарбонат натрия в молоке, тест, 443 Почва, анализ, качественный, 476 количественный, 473 сбор проб, 471 Твердые среды, 147 Растворимые токсины, 144 Рисовое молоко Сойки, 189 Шпатель в форме копья, 402 Специальные среды, 182 Специфическая сыворотка, 379 разведение, 382 Сферическая аберрация, 55 Spirillum, морфология, 133 Spirochaeta, морфология, 133 Спирохеты в тканях, окраска, 124 Экстракт селезенки, 149 Спорангий, 127 Образование спор, артрогенное, 138 эндогенное, 138 метод, 138, 273 прорастание спор, метод, 140, 274 наблюдение, 140, 273 Споры, характеристики, 139 классификация, 139 двойная окраска, 106 окраска, 106 Культура уколом, 224 описание, 265 Предметный микрометр, 62

микроскопа, 52 Методы окраски, 90 парафиновых срезов, 121 реакции бактерий, 274 Окраски прижизненные, 77 негативные (Бурри), 77 штатив для окраски, 72 Стандартные градуированные пипетки, 7 содовый раствор, 154 Стандартизация сред, 154 Стандартизация бульона, 155 Стафилококки, морфология, 132 Staphylococcus в молоке, 456 Паровой стерилизатор, Арнольда, 35 Коха, 35 использование, 35 текучий, 35 Стеригма, 127 Стерилизация химическими веществами, 27 сухим жаром, 28 фильтрами, 40 влажным жаром, 32 текучим паром, 35 перегретым паром, 36 белковых жидкостей, 32 газов, 40 Стерилизующие агенты, 26 Stichcultur, 224 Исходные разведения, 497 питательные среды, 163 пластинка для изоляции, 253 Хранение сред в большом количестве, 159 сред в пробирках, 161 Ящики для хранения сред, 161 Культура штрихом, 224 описание, 268 Текучее движение, 80 пар, 35 Стрептобациллы, морфология, 133 Стрептококки в почве, 477 в воде, обнаружение, 432 морфология, 132 Streptococcus pyogenes longus в молоке, 455 Streptothrix, морфология, 133 Strichcultur, 223 Структура, внутренняя, колоний, 265 Изучение патогенных бактерий, 408 Подкожная инокуляция, 353 Субдуральная инокуляция, 361 Конденсор, 54 Сахарный агар, 185 декстрозный бульон, 184 желатина, 184 сахарные среды, приготовление, 177 Сульфиндиготатный агар, 181 бульон (Вейль), 181 желатина (Вейль), 181 Сероводород в культурах, тест, 290 Солнечный свет, действие, 309 Перегретый пар, 36 Высший летальный коэффициент, 310, 313 Организмы нагноения, 409 Поверхностные характеристики колоний, 264 пластинки, 230 Электрический хирургический мотор, 360 Роящиеся споры, 127 Шприц для подкожной инокуляции твердого материала, 354 подкожный, 344 Операционный стол Татена, 351 Таксономия, 262 Пипетки с резиновой грушей, 10 Температура, действие, 299 оптимальная, 298 таблица давления, 500 диапазон, 298 измерение, 340 Тестовые объекты для объективов, 57 Тестирование фильтров, 478 Пробирки, 3 очистка зараженных, 19 новых, 18 закрытие ватными пробками, 24 стерилизация, 31 Тетракокки, морфология, 132 Термическая точка гибели, 143 определение, 298 спор, 301, 304 вегетативных форм, 298, 303 Термофильные бактерии, 143 Терморегуляторы, капсульный Херсона, 218 Рейхерта, 218 Тиониновый синий, 92 Thiothrix, морфология, 133 Бутыль для сбора воды Треша, 418 Дроссельные пипетки, 13 Мясные консервы, анализ, 460 Тканевая среда (Ногучи), 214 окраски тканей, 95 Ткани для срезов, фиксация, 114 замораживание, 116 уплотнение, 114 заливка, 118 подготовка, 114 промывка, 115 Титрование сред, 150 Torulae, дифференциация от saccharomyces, 130 Общая кислотность, 280 Токсины, тестирование, 318 Трепаны, 360 Тройной револьвер, 58 Истинная подвижность, 80 Культуры в пробирках, приготовление, 222 длина тубуса, 50 Туберкулезная палочка в молоке, 453 окраска, 110, 124 Туберкулезная морская свинка, труп, 454 Розлив питательных сред, 160 Среды из репы, 200 Окраска срезов по Унна-Паппенгейму, 123 Испорченное мясо, анализ, 460 Мочевой агар, 188 желатина, 187 (Хеллер), 188 бульон, 187 Раствор Ушинского, 183 Валентность специфических сывороток, 386 Окраска жгутиков по Ван-Эрменгему, 104 Вегетативная стадия бактерий, 136 Везувин, 94 Vibrio cholerae в молоке, 452 в воде, 439 морфология, 133 Вирулентность, аттенуация, 321 организмов, 320 повышение, 320 Лицензия на вивисекцию, 334 Держатель Фогеса, 350 Летучие масла как дезинфицирующие средства, 27 Теплый столик, 58 Промывка красных кровяных телец, 388 тканей, 115 Вода, анализ, качественный, 426 количественный, 416 стерилизатор, 33 Взвешивание животных, 340 Окраска капсул по Уэлчу, 101 Сывороточный агар Вертхаймера, 211 Пшеничный бульон (Гасперини), 193 Сывороточный агар, 195 желатина, 195 Винное сусло, 192 Раствор Виноградского I, 198 II, 198 Проволочные корзины для пробирок, 31 Работа с пластинками, 252 Сусло-агар, 176 желатина, 176 Анаэробный метод Райта, 239 Дрожжевая вода (Пастер), 191 Окраска по Циль-Нильсену, 110 Zoogloea, 134 Зимогенные бактерии, 131

КНИГИ ИЗДАТЕЛЬСТВА СОНДЕРСА

по
Патологии, Физиологии

Гистологии, Эмбриологии

Бактериологии, Биологии

W. B. SAUNDERS COMPANY

WEST WASHINGTON SQUARE PHILADELPHIA

9, HENRIETTA STREET COVENT GARDEN, LONDON

ЛИТЕРАТУРНОЕ ПРЕВОСХОДСТВО

Превосходное суждение, проявленное в публикациях издательства в самом начале его деятельности, и успех применяемых им современных методов ведения бизнеса сразу привлекли внимание ведущих специалистов в этой области, и многие из наиболее выдающихся авторов Америки предложили свои книги для публикации. Таким образом, был выпущен ряд работ, которые сразу же поставили издательство в первый ряд медицинских издательств. Достаточно привести такие примеры, как «Лечение» Массера и Келли, «Хирургия» Кина, «Гинекология и абдоминальная хирургия» Келли и Нобла, «Дифференциальная диагностика» Кэбота, «Акушерство» Де Ли, «Хирургия» Мамфорда, «Вывихи и переломы суставов» Коттона, «Хирургическое послеоперационное лечение» Крэндона и Эренфрида, «Ветеринарная анатомия» Сиссона, «Медицинская диагностика» Андерса и Бостона, «Запор и непроходимость» Гэнта, «Бактериология» Джордана и «Желудок, кишечник и поджелудочная железа» Кемпа. Эти книги заняли достойное место среди лучших работ по своим соответствующим темам.

Полный каталог наших публикаций будет выслан по запросу

Мэллори

Патологическая гистология

Патологическая гистология. Фрэнк Б. Мэллори, доктор медицины, адъюнкт-профессор патологии Гарвардской медицинской школы. Формат октаво, 677 страниц, 497 рисунков, содержащих 683 оригинальные иллюстрации, 124 из них цветные. Тканевый переплет, 5,50 долл. нетто; полукожаный переплет, 7,00 долл. нетто.

ПЕРЕИЗДАНО ЧЕРЕЗ ТРИ МЕСЯЦА

Д-р Мэллори представляет здесь патологию с морфологической точки зрения. Он излагает свой предмет биологически: сначала путем установления клеточных элементов, из которых строятся различные поражения, а затем прослеживает развитие поражений от простейших к наиболее сложным. Он представляет патологию так, что вы можете проследить в обратном порядке от любого заданного конечного результата, такого как склероз органа (например, цирроз печени), через все различные острые поражения, которые могут привести к этому конкретному конечному результату, к первопричине поражения. Иллюстрации выполнены великолепно.

Д-р У. Г. МакКаллум, Колумбийский университет

«Я просмотрел книгу и считаю, что план изложен превосходно и что книга восполняет потребность, которую мы очень остро ощущали. Я буду очень рад рекомендовать ее».

Физиология Хауэлла

Учебник физиологии. Уильям Х. Хауэлл, доктор философии, доктор медицины, профессор физиологии в Университете Джонса Хопкинса, Балтимор, Мэриленд. Формат октаво, 1020 страниц, 306 иллюстраций. Тканевый переплет, 4,00 долл. нетто.

НОВОЕ (5-Е) ИЗДАНИЕ

Д-р Хауэлл имеет многолетний опыт преподавания физиологии в нескольких ведущих медицинских школах и поэтому чрезвычайно хорошо подготовлен для написания учебника по этому предмету. Основной упор сделан на те факты и взгляды, которые будут непосредственно полезны в практических отраслях медицины. В то же время, однако, достаточное внимание уделено экспериментальной стороне науки. Вся литература по физиологии была тщательно изучена д-ром Хауэллом, а важные взгляды и выводы включены в его работу. Иллюстрации использовались очень широко.

The Lancet, Лондон

«Это один из лучших недавних учебников по физиологии, и мы горячо рекомендуем его вниманию студентов, которые желают получить путем чтения общий, всесторонний, но краткий обзор сферы, фактов, теорий и предположений, составляющих его предметную область».

Патологическая техника Мэллори и Райта

Пятое издание

Патологическая техника. Практическое руководство для работников в области патологической гистологии, включая указания по проведению вскрытий и клинической диагностике лабораторными методами. Фрэнк Б. Мэллори, доктор медицины, адъюнкт-профессор патологии Гарвардского университета; и Джеймс Х. Райт, доктор медицины, директор патологической лаборатории Массачусетской больницы общего профиля. Формат октаво, 500 страниц, 152 иллюстрации. Тканевый переплет, 3,00 долл. нетто.

При переработке книги для нового издания авторы учитывали потребности лабораторного работника, будь то студент, практикующий врач или патолог, в практическом руководстве по гистологическим и бактериологическим методам при изучении патологического материала. Многие части были переписаны, добавлено много новых методов, а количество иллюстраций значительно увеличено.

Бостонский медицинский и хирургический журнал

«Это руководство с момента своего первого появления было признано стандартным пособием по патологической технике и стало практически незаменимым для лабораторного работника».

Бактериологическая техника Эйра

Бактериологическая техника. Лабораторное руководство для студентов-медиков, стоматологов и технических специалистов. Дж. У. Х. Эйр, доктор медицины, член Королевского общества (Эдинбург), директор бактериологического отделения Больницы Гая, Лондон. Формат октаво, 520 страниц, 219 иллюстраций. Тканевый переплет, 3,00 долл. нетто.

ТОЛЬКО ЧТО ВЫШЛО — НОВОЕ (2-Е) ИЗДАНИЕ, ПЕРЕРАБОТАННОЕ

Д-р Эйр подверг свою работу самому тщательному пересмотру. Действительно, его переработка была настолько глубокой, что вся книга, увеличенная примерно на 150 страниц и 50 иллюстраций, была полностью перенабрана. Он включил всю новейшую технику по каждому разделу предмета. Его тщательность, точность и внимание к деталям делают его работу важной. Он четко излагает технику бактериологического исследования воды, сточных вод, воздуха, почвы, молока и продуктов его переработки, мяса и т. д. И он дает вам хорошую технику — методы, подтвержденные его собственным обширным опытом. Для любого, кто интересуется этой областью деятельности, новое издание работы д-ра Эйра является незаменимым. Иллюстрации так же практичны, как и текст.

Патология Макфарланда

Учебник патологии. Джозеф Макфарланд, доктор медицины, профессор патологии и бактериологии в Медико-хирургическом колледже Филадельфии. Формат октаво, 856 страниц, 437 иллюстраций, многие из них цветные. Тканевый переплет, 5,00 долл. нетто; полукожаный переплет, 6,50 долл. нетто.

НОВОЕ (2-Е) ИЗДАНИЕ

Вы не сможете успешно лечить болезнь, если у вас нет практических, клинических знаний о патологических изменениях, вызванных болезнью. Для этой цели работа д-ра Макфарланда подходит как нельзя лучше. Она была написана именно с такой целью — предоставить готовое средство для получения тщательной подготовки по предмету, подготовки, которая будет ежедневно помогать в вашей практике. Для этого издания каждая страница была просмотрена очень внимательно, исправляя ошибки, исключая устаревшие данные и добавляя новые. Некоторые разделы были полностью переписаны. Вы найдете эту книгу достойной того, чтобы к ней обращаться, поскольку это работа авторитетного специалиста.

Медицинский журнал Сент-Пола

«Можно с уверенностью сказать, что найдется немного людей, более квалифицированных для того, чтобы дать резюме современных взглядов на этот предмет, чем Макфарланд. Содержание книги полностью соответствует современному уровню».

Бостонский медицинский и хирургический журнал

«Она содержит огромную массу хорошо классифицированных фактов. Одним из лучших разделов является раздел по частной патологии крови».

Биология Макфарланда: медицинская и общая

Биология: медицинская и общая. Джозеф Макфарланд, доктор медицины, профессор патологии и бактериологии в Медико-хирургическом колледже Филадельфии. 12-й формат, 457 страниц, 160 иллюстраций. Тканевый переплет, 1,75 долл. нетто.

ТОЛЬКО ЧТО ВЫШЛО — НОВОЕ (2-Е) ИЗДАНИЕ

Эта работа является одновременно общей и медицинской биологией. Общей — потому что она обсуждает специфическую природу и реакции живой субстанции в целом; медицинской — потому что особый акцент сделан на тех предметах, которые представляют особый интерес и ценность при изучении и практике медицины. Иллюстрации окажутся большим подспорьем.

Фредерик П. Горхэм, магистр искусств, Брауновский университет.

«Я очень доволен ею. Пожалуй, самая высокая похвала, которую я могу дать книге, — это сказать, что она ближе всего подходит к курсу, который я сейчас читаю по общей биологии, чем любая другая работа».

Патогенные бактерии и простейшие Макфарланда

Патогенные бактерии и простейшие. Джозеф Макфарланд, доктор медицины, профессор патологии и бактериологии в Медико-хирургическом колледже Филадельфии. Формат октаво, 878 страниц, с прекрасными иллюстрациями. Тканевый переплет, 3,50 долл. нетто.

НОВОЕ (7-Е) ИЗДАНИЕ, РАСШИРЕННОЕ

Д-р Макфарланд подверг свою книгу самому энергичному пересмотру, доведя это издание до самого современного уровня. Важные новые дополнения увеличили ее объем примерно на 180 страниц. Безусловно, самым важным дополнением является включение совершенно нового раздела о патогенных простейших. В этом разделе рассматривается каждое простейшее, патогенное для человека; и в той же четкой, определенной манере, которая завоевала работе Макфарланда место в самом первом ряду медицинских бактериологий. Иллюстрации — лучшие из тех, что может предложить мир, и они прекрасно выполнены.

Г. Б. Андерсон, доктор медицины, профессор патологии и бактериологии, Тринити-колледж, Торонто.

«Книга удовлетворительная, и я с удовольствием буду рекомендовать ее студентам Тринити-колледжа».

The Lancet, Лондон

«Книга прекрасно адаптирована для студентов-медиков и практикующих врачей, для которых она, как заявлено, и была написана... Приведенные описания точны и легко читаются».

«Гистология и органография» Хилла

Руководство по гистологии и органографии. Автор: Чарльз Хилл, доктор медицины, бывший доцент гистологии и эмбриологии Северо-Западного университета, Чикаго. Формат 12mo, 468 страниц, 337 иллюстраций. Гибкий кожаный переплет, цена 2,00 доллара нетто.

НОВОЕ (2-Е) ИЗДАНИЕ

Труд доктора Хилла отличается полнотой изложения, редко встречающейся в книгах такого объема. Особое внимание уделено полости рта и зубам.

Pennsylvania Medical Journal

«Материал изложен таким образом, что он легко доступен и понятен. Мы рекомендуем этот труд всем, кто планирует изучать гистологию и органографию».

GETTHE NEW
THE BESTSTANDARD
American
Illustrated Dictionary

Новое (7-е) издание — продано 5000 экземпляров за два месяца

Американский иллюстрированный медицинский словарь. Новый и полный словарь терминов, используемых в медицине, хирургии, стоматологии, фармации, химии, ветеринарии, сестринском деле и смежных областях; содержит более 100 новых подробных таблиц и множество качественных иллюстраций. Автор: У. А. Ньюман Дорланд, доктор медицины, редактор «Американского карманного медицинского словаря». Большой формат октаво, 1107 страниц, полный гибкий кожаный переплет. Цена 4,50 доллара нетто; с алфавитным указателем — 5,00 долларов нетто.

ОН СОДЕРЖИТ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВСЕХ НОВЫХ СЛОВ — ОН АКТУАЛЕН

«Американский иллюстрированный медицинский словарь» содержит определения сотен новейших терминов, которые не определены ни в одном другом словаре — без исключения. Эти новые термины являются живыми, активно используемыми словами, взятыми непосредственно из современной медицинской литературы.

В нем указаны написание с заглавной буквы и произношение всех слов. Особенностью словаря является приведение происхождения или этимологии слов. В некоторых словарях этимология занимает лишь второстепенное место, а во многих случаях происхождение слов вообще не приводится. В «Американском иллюстрированном» практически для каждого слова указана его этимология.

Каждое слово вынесено в отдельный абзац, что позволяет легко и быстро найти нужное слово.

Таблицы артерий, мышц, нервов, вен и т. д. являются огромным подспорьем в систематизации анатомических фактов. В них для быстрого изучения классифицирована вся необходимая информация о различных структурах.

Для каждого слова дано определение — определение, которое разъясняет суть в минимально возможном количестве слов. В некоторых словарях сотни слов вообще не определены, отсылая читателя к другим источникам для получения информации, которая нужна ему немедленно.

Говард А. Келли, доктор медицины, Университет Джонса Хопкинса, Балтимор.

«Американский иллюстрированный словарь восхитителен. Он так хорошо составлен и имеет такой удобный размер. За время использования я не нашел в нем никаких ошибок».

Дж. Коллинз Уоррен, доктор медицины, доктор права, почетный член Королевской коллегии хирургов, Гарвардская медицинская школа

«Я считаю его ценным подспорьем в своей медицинской литературной работе. Он очень полон и имеет удобный размер, позволяющий комфортно с ним работать. Я использую его чаще, чем любой другой».

«Учебник патологии» Стенгела

Пятое издание

Учебник патологии. Автор: Альфред Стенгел, доктор медицины, профессор медицины Пенсильванского университета. Том формата октаво, 979 страниц, с 400 иллюстрациями в тексте, многие из которых цветные, и 7 полностраничными цветными таблицами. Тканевый переплет, 5,00 долларов нетто; переплет из овечьей кожи или полумарокен, 6,50 долларов нетто.

С 400 ИЛЛЮСТРАЦИЯМИ В ТЕКСТЕ, МНОГИЕ ИЗ КОТОРЫХ ЦВЕТНЫЕ, И 7 ЦВЕТНЫМИ ТАБЛИЦАМИ

В этой работе практическое применение патологических фактов в клинической медицине рассматривается более полно, чем это принято в трудах по патологии. Хотя предмет патологии рассматривается максимально широко, насколько это позволяет объем книги, были предприняты усилия представить материал с точки зрения клинициста. Во второй части работы патология отдельных органов и тканей рассматривается систематически и достаточно полно под подзаголовками, которые четко указывают на содержание каждой страницы. В этом издании раздел, посвященный общей патологии, был существенно переработан, причем несколько важных глав были практически написаны заново.

The Lancet, Лондон

«Этот том призван представить предмет патологии в максимально практической форме, особенно с точки зрения "клинического патолога". Эти цели были добросовестно выполнены, и результатом стал ценный учебник. Мы можем самым благоприятным образом рекомендовать его нашим читателям как всесторонне практический труд по клинической патологии».

«Физиология питания» Стайлза

Физиология питания. Автор: Перси Голдтуэйт Стайлз, доцент физиологии в Симмонс-колледже, Бостон. Формат 12mo, 295 страниц, с иллюстрациями. Тканевый переплет, 1,25 доллара нетто.

С ИЛЛЮСТРАЦИЯМИ

Эта новая работа выражает самые передовые взгляды на данный важный предмет. В ней кратко обсуждаются процессы пищеварения и метаболизма. Ключевым словом всей книги является «энергия» — ее источник и ее сохранение.

«Она примечательна изяществом своего слога и ясностью изложения предмета, местами оживленного причудливо-юмористическим оборотом речи, что доставляет истинное удовольствие». — Колин К. Стюарт, доктор философии, Дартмутский колледж.

«Общая бактериология» Джордана

Учебник общей бактериологии. Автор: Эдвин О. Джордан, доктор философии, профессор бактериологии Чикагского университета и Медицинского колледжа Раш. Формат октаво, 623 страницы, с иллюстрациями. Тканевый переплет, 3,00 доллара нетто.

НОВОЕ (3-Е) ИЗДАНИЕ

Труд профессора Джордана охватывает всю область бактериологии, рассматривая как непатогенные, так и патогенные бактерии, при этом, разумеется, делая больший акцент на последних. В книге представлены обширные главы по методам изучения бактерий, включая окрашивание, биохимические тесты, культуры и т. д.; по развитию и составу бактерий; по ферментам и продуктам брожения; по бактериальному производству пигмента, кислоты и щелочи; а также по птомаинам и токсинам. Особенно полно представлено лечение сыворотками при гонорее, дифтерии, дизентерии и столбняке. Обширно рассматривается связь между бычьим и человеческим туберкулезом, а также глазная туберкулиновая реакция.

Эта работа также будет интересна академическим и научным работникам. Она содержит главы по бактериологии растений, молока и молочных продуктов, воздуха, сельского хозяйства, воды, пищевых консервантов, процессам дубления кожи, сушки табака и производства уксуса; связи бактериологии с ведением домашнего хозяйства, санитарной техникой и т. д.

Проф. Северанс Беррадж, доцент санитарной науки, Университет Пердью.

«Я очень впечатлен полнотой и точностью книги. Она, безусловно, охватывает материал более полно, чем любая другая американская книга, которую я видел».

«Ветеринарная бактериология» Бьюкенена

Ветеринарная бактериология. Автор: Роберт Э. Бьюкенен, доктор философии, профессор бактериологии в Колледже сельского хозяйства и механики штата Айова. Формат октаво, 516 страниц, 214 иллюстраций. Тканевый переплет, 3,00 доллара нетто.

ЛУЧШАЯ ИЗ ОПУБЛИКОВАННЫХ

Профессор Бьюкенен подробно рассматривает все бактерии, вызывающие заболевания у домашних животных. Он детально останавливается на вопросах иммунитета, опсонического индекса, размножения, стерилизации, антисептиков, биохимических тестов, питательных сред, выделения культур, производства различных токсинов, антитоксинов, туберкулинов и вакцин, которые доказали свою диагностическую или терапевтическую ценность. Кроме того, помимо собственно бактерий и простейших, он рассматривает плесневые грибы, мучнистую росу, головневые и ржавчинные грибы, грибы-дождевики и другие грибы, патогенные для животных.

Б. Ф. Каупп, доктор ветеринарной медицины, Сельскохозяйственный колледж штата, Форт-Коллинс.

«Это лучшая книга по данной теме из имеющихся в печати. Больше всего меня радует то, что она содержит все последние результаты исследований. Она восполняет давно ощущавшийся пробел».

«Эмбриология» Хайслера

Учебник эмбриологии. Автор: Джон К. Хайслер, доктор медицины, профессор анатомии в Медико-хирургическом колледже, Филадельфия. Том формата октаво, 435 страниц, с 212 иллюстрациями, 32 из которых цветные. Тканевый переплет, 3,00 доллара нетто.

THIRD EDITION—WITH 212 ILLUSTRATIONS, 32 IN COLORS

Это издание отражает все достижения, недавно сделанные в науке эмбриологии. Многие части были полностью переписаны, добавлено много нового и важного материала. Также было введено несколько новых иллюстраций, которые окажутся весьма ценными. «Эмбриология» Хайслера стала стандартным трудом.

Г. Карл Хубер, доктор медицины, профессор эмбриологии в Институте Вистар, Пенсильванский университет.

«Я нахожу это издание "Учебника эмбриологии" доктора Хайслера улучшенным по сравнению с предыдущим. Добавленные рисунки значительно повышают ценность работы. Я снова рекомендую его нашим студентам».

«Гистология» Бёма, Давидова и Хубера

Учебник гистологии человека. Включая микроскопическую технику. Авторы: доктор А. А. Бём и доктор М. фон Давидов из Мюнхена, а также Г. Карл Хубер, доктор медицины, профессор эмбриологии в Институте Вистар, Пенсильванский университет. Красивый том формата октаво, 528 страниц, с 361 прекрасной оригинальной иллюстрацией. Гибкий тканевый переплет, 3,50 доллара нетто.

ВТОРОЕ ИЗДАНИЕ, ДОПОЛНЕННОЕ

Труд докторов Бёма и Давидова хорошо известен по немецкому изданию и считается одной из наиболее практически полезных книг по гистологии человека. Это второе издание было в значительной степени переписано и существенно дополнено доктором Хубером, который также добавил более ста оригинальных иллюстраций. Обширные дополнения доктора Хубера сделали эту работу самым полным студенческим учебником по гистологии из существующих.

Boston Medical and Surgical Journal

«Бесспорно, это учебник первого ранга, тщательно написанный глубокими знатоками предмета, и в некоторых отношениях он значительно превосходит любое другое гистологическое руководство».

«Химическая патология» Уэллса

Химическая патология. — Обсуждение общей патологии с точки зрения вовлеченных химических процессов. Автор: Г. Гидеон Уэллс, доктор философии, доктор медицины, доцент патологии в Чикагском университете. Формат октаво, 616 страниц. Тканевый переплет, 3,25 доллара нетто.

ТОЛЬКО ЧТО ВЫШЛО — НОВОЕ (2-Е) ИЗДАНИЕ

Труд доктора Уэллса написан для врача, для тех, кто занимается исследованиями в области патологии и физиологической химии, а также для студентов-медиков. Во вступительной главе обсуждаются химия и физика животной клетки, приводятся основные факты ионизации, диффузии, осмотического давления и т. д., а также связь этих фактов с клеточной деятельностью. Специальные главы посвящены диабету, а также метаболизму мочевой кислоты и подагре.

Уильям Г. Уэлч, доктор медицины, профессор патологии, Университет Джонса Хопкинса.

«Эта работа восполняет реальную потребность в английской литературе по очень важному предмету, и я буду рад рекомендовать ее своим студентам».

«Элементы питания» Ласка

Элементы науки о питании. Автор: Грэм Ласк, доктор философии, профессор физиологии в Медицинской школе Корнелла. Том формата октаво, 302 страницы. Тканевый переплет, 3,00 доллара нетто.

НОВОЕ (2-Е) ИЗДАНИЕ — ПЕРЕВЕДЕНО НА НЕМЕЦКИЙ ЯЗЫК

Проф. Ласк представляет научные основы, на которых покоятся наши знания о питании и метаболизме, как в здоровом состоянии, так и при болезнях. Имеются специальные главы по метаболизму при диабете и лихорадке, а также по пуриновому обмену. Работа также окажется ценной для студентов, изучающих диетологию животных на сельскохозяйственных станциях.

Левеллис Ф. Баркер, доктор медицины, профессор принципов и практики медицины, Университет Джонса Хопкинса.

«Я буду настоятельно рекомендовать ее своим студентам. Отрадно иметь такое обсуждение предмета на английском языке».

«Экономическая зоология» Догерти

Экономическая зоология. Авторы: Л. С. Догерти, магистр наук, доктор философии, профессор зоологии, Государственный педагогический колледж, Керксвилл, Миссури, и М. К. Догерти, соавтор Джексона по книге «Сельское хозяйство через лабораторию и школьный сад». Часть I: Полевое и лабораторное руководство. Формат 12mo, 237 страниц, с вставками. Тканевый переплет, 1,25 доллара нетто. Часть II: Принципы. Формат 12mo, 406 страниц, с иллюстрациями. Тканевый переплет, 2,00 доллара нетто.

С ИЛЛЮСТРАЦИЯМИ

Другой такой книги нет. Она не только дает основные факты структурной зоологии и развития различных ветвей животных, но и естественную историю — жизнь и повадки, тем самым показывая взаимосвязь структуры, привычек и среды обитания. Одним словом, она дает принципы зоологии и их практическое применение. Подчеркивается экономический аспект.

Часть I — «Полевое и лабораторное руководство» — предназначена для практического обучения в полевых и лабораторных условиях. Чтобы повысить ее ценность для этой цели, вставлены пустые страницы для заметок.

«Зоология беспозвоночных» Дрю

Лабораторное руководство по зоологии беспозвоночных. Автор: Гилман А. Дрю, доктор философии, заместитель директора Морской биологической лаборатории, Вудс-Хол, Массачусетс. При содействии бывших и нынешних членов преподавательского состава кафедры зоологии. Формат 12mo, 213 страниц. Тканевый переплет, 1,25 доллара нетто.

ТОЛЬКО ЧТО ВЫШЛО — НОВОЕ (2-Е) ИЗДАНИЕ

Предмет представлен логично, и был использован метод изучения по типам, поскольку этот метод является преобладающим уже много лет.

Проф. Эллисон А. Смит-младший, Виргинский политехнический институт

«Я считаю, что это лучшее лабораторное руководство по зоологии, которое я видел. Большое количество рассматриваемых форм делает работу применимой практически в любой местности».

«Кардиальная патология» Норриса

Исследования по кардиальной патологии. Автор: Джордж У. Норрис, доктор медицины, ассистент по медицине в Пенсильванском университете. Большой формат октаво, 235 страниц, с 85 превосходными иллюстрациями. Тканевый переплет, 5,00 долларов нетто.

ПРЕВОСХОДНЫЕ ИЛЛЮСТРАЦИИ

Широкий интерес, проявляемый к поражениям сердца, делает эту книгу особенно своевременной. Иллюстрации превосходны и являются точными репродукциями сфотографированных образцов. Каждая иллюстрация сопровождается подробным описанием; кроме того, имеется обширный текст, дополняющий изображения. Включено значительное количество материала диагностического и терапевтического характера.

Boston Medical and Surgical Journal

«Иллюстрации расположены таким образом, чтобы показать все распространенные и многие редкие поражения сердца, а сопровождающий описательный текст представляет собой довольно последовательный дидактический трактат».

«Патология» Макконнелла

Руководство по патологии. Автор: Гатри Макконнелл, доктор медицины, профессор бактериологии и патологии в Университете Темпл, Филадельфия. Формат 12mo, 523 страницы, со 170 иллюстрациями. Гибкий кожаный переплет, 2,50 доллара нетто.

НОВОЕ (2-Е) ИЗДАНИЕ

Доктор Макконнелл обсудил свой предмет с ясностью и точностью стиля, что делает работу большим подспорьем как для студента, так и для практикующего врача. Иллюстрации были введены благодаря их практической ценности.

New York State Journal of Medicine

«Книга рассматривает предмет патологии с тщательностью, отсутствующей во многих более претенциозных трудах. Иллюстрации — многие из них оригинальные — многочисленны и исключительны по качеству».

«Патология» Хектоена и Рисмана

Американский учебник патологии. Под редакцией Людвига Хектоена, доктора медицины, профессора патологии, Медицинский колледж Раш, Чикаго; и Дэвида Рисмана, доктора медицины, профессора клинической медицины, Филадельфийская поликлиника. Формат октаво, 1245 страниц, 443 иллюстрации, 66 в цвете. Тканевый переплет, 7,50 долларов нетто; полумарокен, 9,00 долларов нетто.

«Специальная патологическая гистология» Дюрка и Хектоена

Атлас и эпитома специальной патологической гистологии. Автор: доктор Г. Дюрк, Мюнхен. Под редакцией, с дополнениями, Людвига Хектоена, доктора медицины, профессора патологии, Медицинский колледж Раш, Чикаго. В двух частях. Часть I. — Кровеносная, дыхательная и желудочно-кишечная системы. 120 цветных рисунков на 62 таблицах и 158 страниц текста. Часть II. — Печень, мочеполовые органы, нервная система, кожа, мышцы и кости. 123 цветных рисунка на 60 таблицах и 192 страницы текста. Цена за часть: тканевый переплет, 3,00 доллара нетто. В серии «Ручных атласов Сондерса».

Большая ценность этих таблиц заключается в том, что они в точных цветах передают эффект окрашивания, что имеет огромное значение для дифференциации тканей. Текстовая часть книги восхитительна, и, хотя она кратка, она вполне удовлетворительна, поскольку основные факты изложены так, что читатель чувствует, что он глубоко освоил предмет.

Уильям Г. Уэлч, доктор медицины, профессор патологии, Университет Джонса Хопкинса, Балтимор.

«Я считаю "Атлас специальной патологической гистологии" Дюрка под редакцией Хектоена очень полезной книгой для студентов и других лиц. Таблицы восхитительны».

«Гистология человека» Соботты и Хубера

Атлас и эпитома гистологии человека. Автор: приват-доцент доктор Й. Соботта, Вюрцбург. Под редакцией, с дополнениями, Г. Карла Хубера, доктора медицины, профессора гистологии и эмбриологии в Мичиганском университете, Анн-Арбор. С 214 цветными рисунками на 80 таблицах, 68 иллюстрациями в тексте и 248 страницами текста. Тканевый переплет, 4,50 доллара нетто. В серии «Ручных атласов Сондерса».

ВКЛЮЧАЯ МИКРОСКОПИЧЕСКУЮ АНАТОМИЮ

Работа сочетает в себе обилие хорошо подобранных и максимально точных иллюстраций с кратким текстом, причем таким образом, что она является одновременно и атласом, и учебником. Подавляющее большинство иллюстраций было сделано с препаратов, приготовленных из тканей человека, и всегда из свежих и во всех отношениях нормальных образцов. Цветные литографические таблицы были созданы с помощью более чем тридцати цветов.

Boston Medical and Surgical Journal

«По цвету и пропорциям они отличаются приятной точностью и литографической красотой».

Бозанке о спирохетах

Спирохеты: Обзор недавних работ с некоторыми оригинальными наблюдениями. Автор: У. Сесил Бозанке, доктор медицины, член Королевской коллегии врачей, Лондон. Формат октаво, 152 страницы, с иллюстрациями. 2,50 доллара нетто.

С ИЛЛЮСТРАЦИЯМИ

Это полная и авторитетная монография о спирохетах, дающая морфологию, патогенез, классификацию, окрашивание и т. д. Также рассматриваются псевдоспирохеты, и весь текст хорошо иллюстрирован. Высокий авторитет доктора Бозанке в этой области исследований делает эту новую работу особенно ценной.

«Клиническая бактериология» Леви и Клемперера

Элементы клинической бактериологии. Авторы: доктора Эрнст Леви и Феликс Клемперер, Страсбургский университет. Перевод и редакция Августуса А. Эшнера, доктора медицины, профессора клинической медицины, Филадельфийская поликлиника. Том формата октаво, 440 страниц, полностью иллюстрирован. Тканевый переплет, 2,50 доллара нетто.

С. Солис-Коэн, доктор медицины, профессор клинической медицины, Джефферсоновский медицинский колледж, Филадельфия.

«Я считаю ее отличной книгой. Я рекомендовал ее, выступая перед своими студентами».

«Бактериология» Лемана, Неймана и Уивера

Атлас и эпитома бактериологии: включая учебник специальной бактериологической диагностики. Авторы: проф. д-р К. Б. Леман и д-р Р. О. Нейман, Вюрцбург. Из второго переработанного и дополненного немецкого издания. Под редакцией, с дополнениями, Г. Х. Уивера, доктора медицины, доцента патологии и бактериологии, Медицинский колледж Раш, Чикаго. В двух частях. Часть I. — 632 цветных рисунка на 69 литографических таблицах. Часть II. — 511 страниц текста, с иллюстрациями. Цена за часть: тканевый переплет, 2,50 доллара нетто. В серии «Ручных атласов Сондерса».

«Общая патологическая гистология» Дюрка и Хектоена

Атлас и эпитома общей патологической гистологии. Автор: пр. д-р Г. Дюрк, Мюнхен. Под редакцией, с дополнениями, Людвига Хектоена, доктора медицины, профессора патологии в Медицинском колледже Раш, Чикаго. 172 цветных рисунка на 77 литографических таблицах, 36 иллюстраций в тексте, многие в цвете, и 353 страницы. Тканевый переплет, 5,00 долларов нетто. В серии «Ручных атласов Сондерса».

Американский учебник физиологии Второе издание

Американский учебник физиологии. В двух томах. Под редакцией Уильяма Г. Хауэлла, доктора философии, доктора медицины, профессора физиологии в Университете Джонса Хопкинса, Балтимор, Мэриленд. Два тома формата королевский октаво, около 600 страниц каждый, с иллюстрациями. Цена за том: тканевый переплет, 3,00 доллара нетто; полумарокен, 4,25 доллара нетто.

«Этот труд останется справочным пособием по физиологии. Тому, кто желает знать состояние современной физиологии, кто рассчитывает получить предложения для дальнейших физиологических исследований, мы не знаем другого труда на английском языке, который бы так выдающимся образом отвечал такому запросу». — The Medical News.

«Патология и терапия» Уоррена Второе издание

Хирургическая патология и терапия. Автор: Джон Коллинз Уоррен, доктор медицины, доктор права, почетный член Королевской коллегии хирургов, профессор хирургии, Гарвардская медицинская школа. Октаво, 873 страницы, 136 рельефных и литографических иллюстраций, 33 в цвете. С приложением о научных методах хирургической диагностики и серией статей по региональной бактериологии. Тканевый переплет, 5,00 долларов нетто; полумарокен, 6,50 долларов нетто.

«Бактериология» Горэма

Лабораторный курс бактериологии. Для использования студентами медицинских, сельскохозяйственных и промышленных специальностей. Автор: Фредерик П. Горэм, магистр искусств, доцент биологии в Брауновском университете, Провиденс, Род-Айленд, и др. Формат 12mo, 192 страницы, с 97 иллюстрациями. Тканевый переплет, 1,25 доллара нетто.

«Одно из лучших студенческих лабораторных руководств по изучению бактериологии на рынке... Техника полностью современная и вполне достаточная для всех практических целей». — American Journal of the Medical Sciences.

«Физиология» Реймонда Новое (3-е) издание

Физиология человека. Автор: Джозеф Х. Реймонд, магистр искусств, доктор медицины, профессор физиологии и гигиены, Больница колледжа Лонг-Айленда, Нью-Йорк. Формат октаво, 685 страниц, с 444 иллюстрациями. Тканевый переплет, 3,50 доллара нетто.

«Книга хорошо составлена и хорошо напечатана, и ее можно рассматривать как надежное руководство для студента и полезное справочное пособие для врача общей практики. Иллюстрации многочисленны и хорошо выполнены». — The Lancet, Лондон.

«Бактериология» Болла Седьмое издание, переработанное

Основы бактериологии: краткое и систематическое введение в изучение микроорганизмов. Автор: М. В. Болл, доктор медицины, бывший бактериолог больницы Св. Агнес, Филадельфия. Формат 12mo, 289 страниц, со 135 иллюстрациями, некоторые в цвете. Тканевый переплет, 1,00 доллар нетто. В серии «Вопросников-компендиумов Сондерса».

«Техника в отношении сред, окрашивания, монтирования и тому подобного почерпнута из новейших авторитетных работ». — The Medical Times, Нью-Йорк.

«Физиология» Баджета Новое (3-е) издание

Основы физиологии. Подготовлено специально для студентов-медиков и составлено с вопросами после каждой главы. Автор: Сидни П. Баджет, доктор медицины, бывший профессор физиологии, Вашингтонский университет, Сент-Луис. Переработано Хаваном Эмерсоном, доктором медицины, демонстратором физиологии, Колумбийский университет. Том формата 12mo, 250 страниц, с иллюстрациями. Тканевый переплет, 1,00 доллар нетто. Серия «Вопросников-компендиумов Сондерса».

«Он имеет отличное представление о своем предмете... Это одна из самых удовлетворительных книг этого класса». — University of Pennsylvania Medical Bulletin.

«Гистология» Лероя Новое (4-е) издание

Основы гистологии. Автор: Луи Лерой, доктор медицины, профессор гистологии и патологии, Университет Вандербильта, Нэшвилл, Теннесси. Формат 12mo, 263 страницы, с 92 оригинальными иллюстрациями. Тканевый переплет, 1,00 доллар нетто. В серии «Вопросников-компендиумов Сондерса».

«Работа в своем нынешнем виде является моделью того, каким должно быть пособие для студента; и мы без колебаний скажем, что практикующий врач также найдет беглый просмотр этой книги длительной пользой». — The Medical World, Филадельфия.

«Медицинский тезаурус» Бартона и Уэллса

Тезаурус медицинских слов и фраз. Авторы: Уилфред М. Бартон, доктор медицины, доцент фармакологии и терапии, и Уолтер А. Уэллс, доктор медицины, демонстратор ларингологии, Джорджтаунский университет, Вашингтон, округ Колумбия. Формат 12mo, 534 страницы. Гибкий кожаный переплет, 2,50 доллара нетто; с алфавитным указателем — 3,00 доллара нетто.

«Американский карманный словарь» Новое (8-е) издание

Карманный медицинский словарь Дорланда. Под редакцией У. А. Ньюмана Дорланда, доктора медицины, редактора «Американского иллюстрированного медицинского словаря». Содержит произношение и определение основных слов, используемых в медицине и смежных науках, с 64 обширными таблицами. 677 страниц. Гибкий кожаный переплет, с золотым обрезом, 1,00 доллар нетто; с патентным алфавитным указателем — 1,25 доллара нетто.

«Я могу рекомендовать его нашим студентам без всяких оговорок». — Дж. Х. Холланд, доктор медицины, Джефферсоновский медицинский колледж, Филадельфия.