Примечания транскрибатора:

За исключением нижеуказанных исправлений опечаток, текст данной книги сохранен в оригинальном виде: xolol → xylol, side → slide, overstraining → overstaining.

В данной электронной версии черное пунктирное подчеркивание указывает на ссылку на страницу, иллюстрацию или сноску — ссылки также подсвечиваются при наведении на них указателя мыши. Номера страниц указаны на правом поле. Сноски расположены в конце книги.

Там, где это уместно, иллюстрации и сноски расположены рядом с соответствующим текстом.

Текст содержит многочисленные таблицы, которые могут некорректно отображаться на портативных устройствах, а также архаичные символы, которые могут не отображаться вовсе при отсутствии подходящих шрифтов.

НАРЕЗКА СРЕЗОВ И ОКРАШИВАНИЕ. ПРАКТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕ В ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДЛЯ СТУДЕНТОВ И ПРАКТИКОВ

BY

W. S. COLMAN, M.D., M.R.C.P.

ASSISTANT PHYSICIAN (FORMERLY PATHOLOGIST) TO THE NATIONAL
HOSPITAL FOR THE PARALYSED AND EPILEPTIC; AND TO
THE HOSPITAL FOR SICK CHILDREN, GREAT
ORMOND STREET, ETC.

SECOND EDITION

ENLARGED AND IN MOST PART RE-WRITTEN

LONDON
H. K. LEWIS, 136 GOWER STREET, W.C.
1896

PRINTED BY
H. K. LEWIS, 136 GOWER STREET,
LONDON, W.C.

ПРЕДИСЛОВИЕ КО ВТОРОМУ ИЗДАНИЮ.

При подготовке этого издания я стремился удовлетворить потребности студентов и практиков, желающих поддерживать свои навыки в гистологической работе. Были отобраны те методы, которые хорошо зарекомендовали себя на практике, и я счел более правильным подробно описать несколько методов, нежели приводить краткий обзор множества схожих.

Я вновь должен выразить свою признательность различным производителям инструментов за иллюстрации микротомов и т. д.; доктору Фернли из Брэдфорда — за описание его метода инъекции кровеносных сосудов, а компании Macmillan and Co. — за разрешение скопировать рисунки 10 и 11.

У. С. КОЛМАН.

Уимпол-стрит, W. Сентябрь 1896 г.

СОДЕРЖАНИЕ.

CHAPTER I.
| PAGE
Apparatus Required | 1
CHAPTER II.
Hardening Processes | 15
CHAPTER III.
Section Cutting | 29
CHAPTER IV.
Section Mounting | 55
CHAPTER V.
General Staining Methods | 67
CHAPTER VI.
Special Methods for Staining the Nerve Centres | 87
CHAPTER VII.
Special Methods for Staining Micro-Organisms and Blood  | 103
CHAPTER VIII.
Injection of Blood Vessels | 120
CHAPTER IX.
Directions for Preparing Individual Tissues | 129
Index | 153

НАРЕЗКА СРЕЗОВ И ОКРАШИВАНИЕ.

ГЛАВА I.

Необходимое оборудование.

Вероятно, нет ничего более озадачивающего для начинающего, чем решение вопроса о том, какое оборудование требуется. Если он заглянет в прейскурант, ему будет трудно определить, какие предметы необходимы, а какие являются либо предметами роскоши, либо требуются только для специальных исследований.

В нижеследующем описании необходимых принадлежностей будут описаны только те, которые полезно всегда иметь под рукой. Их будет достаточно для обычной работы, но для специальных исследований потребуется более сложное оснащение.

Все окрашивающие и другие реагенты следует, насколько это возможно, изготавливать самостоятельно, согласно указаниям, приведенным в последующих главах. Во всяком случае, поначалу это следует делать обязательно, так как полученные таким образом знания окажутся бесценными. Также это позволит значительно сэкономить, если материалы, используемые в больших количествах, такие как метилированный спирт, дистиллированная вода и т. д., закупать галлонами, а не в малых количествах.

Почти все описанные здесь процессы можно выполнять без использования полностью оборудованной лаборатории, фактически — в обычной комнате. Единственная необходимая мебель — это прочный стол, а также шкаф и полки для хранения реагентов.

Также следует приобрести:

Банки или бутыли с плотно прилегающими пробками или крышками для содержания тканей во время фиксации. Они должны быть объемом не менее двух унций. Пустые аптечные бутылочки, которые обычно можно получить у фармацевтов за несколько пенсов, подходят очень хорошо.

Следует также приобрести бутылочки меньшего размера для хранения образцов в спирте после их фиксации до тех пор, пока вы не будете готовы к нарезке срезов. После того как из части образца были сделаны срезы, остальное следует сохранить на случай, если это потребуется для дальнейшего исследования. Каждый образец должен быть снабжен этикеткой с названием или номером, соответствующим записи в блокноте, и тогда в одной банке можно хранить большое количество образцов. Лучший способ маркировки — написать название или номер на кусочке растительного пергамента обычными «маркировочными чернилами» и нагреть его, пока надпись не станет черной. Затем маленькую этикетку следует прикрепить к углу кусочка ткани с помощью стежка или тонкой булавки, и ее можно будет идентифицировать даже спустя годы. Важность четкой маркировки тканей, срезов, предметных стекол и т. д. невозможно переоценить для начинающего. Название, дату и другие подробности следует неизменно записывать на этикетке в момент подготовки. Поначалу студент будет склонен пренебрегать этим, так как он будет легко узнавать свои кусочки ткани и срезы просто по их форме и общему виду. Но по прошествии времени, когда накопятся похожие образцы, ему будет крайне трудно или даже невозможно отличить один от другого.

Некоторое количество бутылей с притертыми пробками объемом 1 и 2 унции для окрашивающих реагентов.

Пробка этих бутылей должна быть снабжена стеклянной палочкой. Это делается путем простого нагревания нижнего конца пробки и верхнего конца стеклянной палочки подходящей длины в пламени горелки до пластичного состояния, а затем их прижимания друг к другу.

Часовые стекла. — По меньшей мере дюжина часовых стекол, в которых можно выполнять операции окрашивания, просветления и т. д. Следует использовать стекла с плоским дном, так как их труднее опрокинуть, чем другие.

Много фильтровальной бумаги.

Следует приобрести как грубую бумагу для использования при изготовлении реагентов, так и небольшие тонкие белые листы (2,5 дюйма) для фильтрации окрашивающих жидкостей непосредственно перед их использованием. Перед применением на них следует капнуть несколько капель спирта или дистиллированной воды, чтобы пропитать бумагу. Это не только позволяет жидкости проходить быстрее, но и предотвращает потерю части жидкости из-за впитывания порами бумаги.

Несколько препаровальных игл в ручках.

Они должны содержаться в чистоте и быть гладкими, и следует следить за тем, чтобы кончик не загнулся.

Большая и маленькая воронки.

Несколько пипеток, состоящих из кусочков стеклянной трубки с внутренним диаметром 1/8 дюйма и длиной около десяти дюймов, вытянутых почти до точки на одном конце.

Расправитель срезов. — Этот инструмент необходим для переноса срезов из одного реагента в другой или из масла гвоздики и т. д. на предметное стекло. Наиболее удобной формой является инструмент Вудхеда, изготовленный из тонкого листового меди, что позволяет изгибать лезвие под любым углом к стержню. Стержень или ручка имеют длину около шести дюймов, и с ними под углом соединено плоское лезвие размером около 3/4 дюйма с закругленными углами. Можно приобрести более крупные инструменты для монтажа срезов большого размера, например, почки, продолговатого мозга и т. д. Поверхность лезвия должна быть ярко отполирована и содержаться в безупречной чистоте.

Обычный анатомический пинцет.

Один или два скальпеля.

Пара тонких ножниц.

Бритва или другой инструмент для нарезки срезов.

Гладкий оселок для поддержания бритв и ножей в надлежащем состоянии заточки.

Спиртовая горелка для подогрева окрашивающих жидкостей.

Несколько пробирок.

Минимальная мерка.

Весы и небольшие гирьки.

Гросс (144 шт.) шлифованных предметных стекол размером 3 x 1 дюйм.

Полгосса шлифованных предметных стекол размером 3 x 1,5 дюйма.

Half an ounce of thinnest coverslips,  7/8 in. diameter.

Quarter of an ounce of thinnest coverslips, 1 1/4 in. diameter.

Микроскоп. — Здесь не место для описания микроскопа как оптического прибора, но некоторые советы по его выбору могут оказаться полезными.

Следует избегать вычурных микроскопов с большим количеством латунных деталей; простота конструкции является большим преимуществом. Микроскоп должен иметь большое тяжелое основание, подковообразное или штативное, достаточно большое, чтобы обеспечить устойчивость при наклоне микроскопа.

Механические предметные столики излишни, они значительно увеличивают стоимость и приносят мало пользы для обычной гистологической работы. Бинокулярные приспособления также малопригодны для этой цели.

Микроскоп должен быть снабжен грубой и тонкой фокусировкой, которые следует очень тщательно проверить перед покупкой прибора. Они должны работать свободно и плавно, и малейший поворот в любом направлении должен немедленно изменять фокус.

Должно быть реверсивное зеркало, одна сторона которого вогнутая, а другая плоская. Обычно используется вогнутая поверхность, плоская поверхность в основном применяется в сочетании с конденсором для исследования микроорганизмов. Должен быть окуляр с умеренным увеличением. Очень мощные окуляры не выявляют дополнительных деталей, а лишь увеличивают изображение, а вместе с ним и любые дефекты, которые могут быть вызваны ошибками в объективе. Окуляров II и IV большинства производителей будет вполне достаточно для большинства требований.

Объективы. — Это самые важные части микроскопа, и студенту будет полезно потратить немного лишних денег, чтобы приобрести хорошие линзы.

Большинство объективов и штативов сейчас изготавливаются с универсальной резьбой, поэтому любой объектив подойдет к любому штативу. Многие исследователи приобретают дешевый штатив, например, поставляемый компанией Leitz, а затем оснащают его линзами Zeiss или другого первоклассного производителя.

Наиболее полезными линзами являются 1-дюймовая линза малого увеличения и 1/5-дюймовая или 1/6-дюймовая линза большого увеличения, или № 3 и № 7 континентальных производителей, или A и D компании Zeiss. Линза 1/2 дюйма также окажется очень полезной.

Для детальной работы, такой как бактериология и исследования крови, потребуются более сильные увеличения — иммерсионные линзы 1/8 или 1/12. Эти объективы подходят чрезвычайно близко к объекту, и должны использоваться очень тонкие покровные стекла. Чтобы избежать преломления, вызванного прохождением лучей через воздух между покровным стеклом и линзой, между ними помещается иммерсионная жидкость. С некоторыми линзами используется вода, но обычно применяется масло, имеющее тот же показатель преломления, что и стекло, и наиболее часто используемым является кедровое масло (Zeiss предпочитает масло из вида Juniperus virginiana). Капля масла помещается палочкой прямо над исследуемым объектом, и объектив осторожно опускается с помощью грубой фокусировки, пока не придет в контакт с каплей масла. Фокусировку затем следует выполнять только с помощью тонкой настройки.

Когда срез исследован, масло необходимо удалить с линзы. Для этой цели можно использовать мягкий шелковый платок или специальный кусочек замши, действуя очень осторожно. Если все масло удалить не удается, платок можно смочить небольшим количеством абсолютного спирта и быстро протереть линзу. Спирт нельзя оставлять в контакте с линзой, так как он является растворителем канадского бальзама, которым линзы часто закрепляются на месте.

Рис. 1. — Двойной или тройной револьвер.

Двойной или тройной револьвер (рис. 1). — Это механическое приспособление размещается на нижнем конце тубуса. К нему крепятся два или три объектива с разным увеличением. Револьвер вращается вокруг центральной оси таким образом, что объективы могут последовательно точно устанавливаться в положение над объектом на предметном столике. Поэтому замена объектива с большим увеличением на объектив с малым увеличением и наоборот занимает мгновение. Это чрезвычайно удобное приспособление, экономящее время, и его использование позволяет избежать риска уронить и повредить объективы при частом их привинчивании и отвинчивании. Те, чьи микроскопы еще не оснащены этим приспособлением, могут легко установить его за стоимость около одного фунта стерлингов.

Конденсор. — Этот механизм для концентрации света на объекте является необходимостью для бактериологической работы. Наиболее удобной формой является осветительный аппарат Аббе (рис. 2).

Он состоит из системы короткофокусных линз, которые собирают свет, полученный от зеркала, и направляют его на объект. Количество света, получаемого от зеркала, регулируется «ирисовой диафрагмой», апертуру которой можно расширять или сужать, перемещая небольшой рычаг сбоку. Его можно установить на большинство штативов микроскопов, но лучше изначально приобрести штатив, сконструированный для его установки.

Стоимость микроскопа варьируется от двух гиней до двухсот. На рынке много отличных микроскопов, и из них можно упомянуть несколько, которые, по мнению автора, работают удовлетворительно.

Рис. 2. — Осветительный аппарат Аббе.

Из более дешевых студенческих микроскопов «Star», производимый Messrs. R. and J. Beck из Корнхилла, E.C., окажется надежным вложением средств. Его можно приобрести с грубой и тонкой фокусировкой, револьвером и 1-дюймовым и 1/4-дюймовым объективами примерно за 5 фунтов стерлингов. Те, кому нужен лучший инструмент, найдут, что микроскоп Beck «Pathological», оснащенный револьвером, осветителем Аббе и т. д. за 16 фунтов стерлингов, отвечает всем требованиям.

Leitz из Йены поставляет два хороших и дешевых микроскопа за 3 фунта 10 шиллингов и 5 фунтов стерлингов. Однако они не отличаются неизменным качеством, и их следует тщательно протестировать у компетентного эксперта до завершения покупки. Иммерсионные линзы Leitz дешевы и часто чрезвычайно хороши, но их следует заранее тщательно проверять, так как их качество не совсем однородно. Микроскопы можно приобрести у Mr. A. Frazer, Teviot Place, Эдинбург.

«Бактериологический» микроскоп, изготовленный Messrs. Swift с Тоттенхэм-Корт-роуд, — это прибор, которым никто не может быть разочарован. Он продается с конденсором Аббе, тройным револьвером, 1/6-дюймовым и 1/12-дюймовым иммерсионным объективом чуть менее чем за 20 фунтов стерлингов. И штатив, и линзы выполнены в первоклассном стиле Swift, и те, кто может позволить себе первоначальные затраты, не пожалеют об этом. Либо можно приобрести штатив, а объективы и аксессуары добавлять по отдельности со временем.

Среди континентальных производителей отличные микроскопы для гистологической работы выпускаются многими фирмами. Линзы Zeiss заслуженно пользуются высокой репутацией, так как ни одна бракованная линза Zeiss никогда не покидает завод, а их оптические свойства почти совершенны. Однако за эту гарантию покупателю приходится платить несколько более высокую цену, но деньги вложены не зря. Агентство Zeiss находится по адресу: 29 Margaret Street, Regent Street, W.

Reichert из Вены продает микроскопы и линзы, которые смоделированы по образцу Zeiss, и, хотя они дешевле, часто равны им по качеству, но качество не совсем однородно. Его инструменты можно приобрести через любого оптика, но его агентом в этой стране является Mr. A. Frazer, Teviot Place, Эдинбург.

Перед покупкой микроскопа студент должен получить иллюстрированный прейскурант от любой из вышеупомянутых фирм и, выбрав инструмент, должен очень тщательно протестировать его, или, что еще лучше, попросить опытного друга протестировать его для него, прежде чем решиться на покупку. Следует использовать деликатные тестовые объекты, такие как диатомовые водоросли, чешуйки крыльев бабочки или окрашенный препарат микроорганизмов. Следует опробовать грубую и тонкую фокусировку. Они должны работать свободно, плавно и без задержек. Четкость линзы должна быть проверена на упомянутых мелких объектах. Поле зрения должно быть совершенно плоским, т. е. каждая часть должна быть в фокусе одновременно, четкость должна быть идеально острой и точной, а тестовые объекты — без двойного контура. Поле зрения должно быть полностью свободно от призматических цветов. Если вокруг объектов есть цветной ореол, это указывает на дефект оптических свойств объектива, и следует выбрать другой.

С микроскопом всегда нужно обращаться с величайшей осторожностью. Удары и падения имеют тенденцию слегка ослаблять и смещать линзы, а также навсегда ухудшать его оптические свойства. Пыль должна быть максимально тщательно исключена. Лучше всего это достигается хранением инструмента под стеклянным колпаком, когда он не используется. Линзы следует протирать как можно реже, а когда это необходимо, следует использовать очень мягкую замшу. Микроскоп должен храниться в сухой комнате, иначе латунные детали вскоре потускнеют, а стальные части будут склонны к ржавлению.

ГЛАВА II.

Процессы фиксации.

Для удовлетворительного исследования тканей необходимо, чтобы они были «зафиксированы» в определенных жидкостях. Цель этого — придать образцам большую консистенцию, чтобы можно было легче получать тонкие срезы и безопаснее с ними манипулировать, а также «зафиксировать» элементы ткани, насколько это возможно, в том же относительном положении, что и в живом организме. Процесс фиксации также воздействует на протоплазму клеток и предотвращает их набухание при помещении в воду и в различные окрашивающие жидкости.

Используемая жидкость должна быть такой, которая сама по себе не повредит образец и которую можно полностью удалить промыванием, чтобы она не мешала операциям окрашивания. Во время фиксации образцы следует хранить в широкогорлых бутылях, на дно которых положено немного ваты или пакли. Это позволяет фиксирующей жидкости свободно контактировать с нижней поверхностью кусочков ткани и предотвращает их прилипание к твердому стеклянному дну.

Фиксирующую жидкость необходимо периодически менять. Это всегда следует делать по истечении двадцати четырех часов, чтобы избавиться от любого осадка крови и т. д., который мог накопиться. Кроме того, ткань при помещении в жидкость содержала много воды, которая разбавила ее, и, следовательно, желательна ранняя замена. В дальнейшем жидкость требует замены только по мере того, как она становится мутной или появляется осадок, обычно примерно раз в неделю.

Во время фиксации образцы следует хранить в прохладном месте, так как тепло способствует изменениям в клетках и т. д.

При манипуляциях с частями органов всегда следует использовать пинцет, причем с большой осторожностью. Образцы никогда не следует протыкать иглами, иначе при исследовании среза под микроскопом появятся неприглядные отверстия, которые можно даже принять за патологические проявления.

Требуется некоторая практика, чтобы понять, когда ткань достаточно зафиксирована. Цель состоит в том, чтобы сделать их не по-настоящему твердыми, а жесткими. Почти излишне добавлять, что при проверке этого пальцами необходимо соблюдать величайшую осторожность, иначе ткани может быть нанесен серьезный ущерб.

Когда ткань достаточно зафиксирована, фиксирующую жидкость необходимо тщательно удалить. Быстрее всего это достигается путем помещения образца в емкость, в которую постоянно течет холодная вода из-под крана. Затем ткань можно извлечь (всегда используя пинцет и никогда не используя иглу) и поместить в среду для заливки, как указано далее; или, если ее не собираются резать сразу, в равные части метилированного спирта и воды, в которых она может храниться неопределенно долго, при этом жидкость следует менять, если она становится хоть сколько-нибудь мутной.

Для обычной работы нет необходимости иметь более чем следующие фиксирующие жидкости: — Жидкость Мюллера: —

Potassium Bichromate | 2 1/4 | grms. |  3 1/2 | drachms.
Sodium Sulphate | 1 | grm. | 1 1/2 | drachms.
Water to |  100 | c.c. | 1 | pint.

Иногда к каждой пинте жидкости добавляют две драхмы карболовой кислоты, но, как правило, это не требуется.

Жидкость Мюллера является наиболее полезной из различных используемых жидкостей по следующим причинам: —

1. Она вызывает очень незначительную усадку элементов ткани, и поэтому может использоваться для самых деликатных объектов, например, сетчатки и эмбрионов.

2. Вследствие того, что она не вызывает усадки тканей, она не выжимает кровь из сосудов, и там, где орган был переполнен кровью до смерти, мы можем, используя жидкость Мюллера, сохранить естественную инъекцию капилляров.

3. Существует сравнительно небольшая опасность перефиксации ткани и придания ей хрупкости.

4. Срезы органов, зафиксированных в жидкости Мюллера, обычно прочные и с ними легко работать. Они не стремятся скручиваться или прилипать друг к другу так сильно, как те, что зафиксированы в спирте.

5. Она легко проникает в ткани, и поэтому в ней можно удовлетворительно фиксировать большие части органов или даже весь орган целиком.

6. Она очень дешева. Галлон можно приготовить примерно за восемь пенсов.

Однако у жидкости есть некоторые незначительные недостатки: —

1. Процесс фиксации медленный, занимающий от четырех до восьми недель.

2. Жидкость придает ткани стойкий тусклый цвет. Это не вызывает никаких неудобств для микроскопических целей, но является недостатком, когда предполагается сохранить остальную часть образца в качестве макропрепарата. В таких случаях орган следует фиксировать в спирте, карболовой кислоте или формалине.

Жидкость Мюллера можно использовать практически для любой ткани. Она особенно полезна для тех, которые содержат большое количество жидкости или крови, и необходима для нервных тканей, которые предполагается окрашивать по методу Паля (стр. 89).

Для фиксации образца в ней необходимо использовать объем жидкости, по крайней мере в двадцать раз превышающий объем образца.

Жидкость необходимо менять на третий день, а затем примерно каждую неделю, по мере необходимости.

Метилированный спирт — очень полезный фиксирующий агент. Он фиксирует за одну-три недели в зависимости от размера ткани и количества используемого спирта. Его недостатки: —

1. Он более склонен к перефиксации, чем жидкость Мюллера.

2. Он вызывает сильную усадку ткани и, таким образом, выжимает много крови из сосудов.

Он наиболее полезен при фиксации тканей, содержащих много эпителия, например, почки, эпителиомы и т. д.

Спирт также часто используется для завершения фиксации жидкостью Мюллера и для сохранения тканей после того, как они были зафиксированы.

Следует использовать объем спирта примерно в десять или пятнадцать раз больше объема тканей. Жидкость следует менять на третий день, а затем по мере необходимости.

Жидкость Мюллера и спирт. — Это полезная комбинация для многих целей. Она готовится так: — жидкость Мюллера, три части; метилированный спирт, одна часть.

Жидкости после смешивания перед использованием нужно дать остыть, и при необходимости отфильтровать. Она удовлетворительно фиксирует образцы за три недели.

Жидкость Мюллера и формалин. — Чрезвычайно полезная смесь, приготовленная путем добавления одной части формалина к девяти частям жидкости Мюллера. Она фиксирует за гораздо более короткое время, чем жидкость Мюллера, и вызывает очень незначительную усадку.

Абсолютный спирт. — Используется как фиксирующий агент, когда ткани должны быть исследованы на наличие микроорганизмов, и для образцов, которые будут окрашены по методу Ниссля (стр. 101). Более дешевая и столь же эффективная фиксирующая среда изготавливается путем обезвоживания метилированного спирта добавлением одной унции плавленого карбоната калия на каждую пинту метилированного спирта с последующим декантированием.

Необходимо использовать маленькие кусочки. Глубина блока не должна превышать 3/8 дюйма. Жидкость следует менять на третий день. Фиксация будет завершена примерно через десять дней или даже раньше.

Осмия кислота. — По быстроте действия и для быстрой фиксации всех элементов ткани в их естественном положении осмия кислота является одним из лучших фиксирующих реагентов, которыми мы располагаем.

Ее недостатки как фиксирующего агента: —

1. Ее стоимость.

2. Ее раздражающие и коррозийные пары.

3. Тот факт, что в ней можно фиксировать только маленькие кусочки ткани, так как внешняя поверхность фиксируется очень быстро, и тем самым жидкость не может проникнуть в центр куска.

Чаще всего она используется как фиксирующий агент для очень деликатных структур, таких как сетчатка или эмбрионы, или для свежих срезов мозга (стр. 95).

Саму кислоту можно приобрести в запаянных ампулах, каждая из которых содержит один грамм. Их следует разбивать в бутылке с достаточным количеством дистиллированной воды для приготовления однопроцентного раствора. Бутылку, содержащую его, следует накрыть коричневой бумагой, чтобы исключить свет. Для целей фиксации маленькие кусочки ткани, не намного больше горошины, следует поместить в кислоту, разбавив однопроцентный раствор пятью-десятью объемами дистиллированной воды. Ткани можно оставить в этом растворе на срок от трех до пяти дней. Затем их необходимо тщательно промыть в дистиллированной воде, после чего их можно хранить в метилированном спирте.

Как фиксацию, так и последующее промывание необходимо проводить в темноте.

Осмия кислота также является ценнейшим окрашивающим реагентом (см. стр. 81).

Карболовая кислота (5%). — Может использоваться для фиксации практически любой ткани, но особенно полезна для фиксации нервных тканей, таких как мозг или спинной мозг, которые впоследствии будут сохранены в качестве музейных экспонатов. Она не обесцвечивает образец так быстро, как спирт.

Следует использовать объем жидкости в три или четыре раза больше объема образца. Она требует замены по истечении двадцати четырех часов и снова по истечении первой недели.

Насыщенный водный раствор сулемы — один из наиболее удобных фиксирующих реагентов для маленьких кусочков деликатной ткани, например, эмбрионов. Он фиксирует их за несколько дней. Когда они достаточно зафиксированы, ртутную соль следует удалить, промыв сначала в метилированном спирте в течение нескольких часов, а затем в проточной воде.

Формалин. — Водный раствор, содержащий около 35% формальдегида. Это быстрый фиксирующий агент, вызывающий очень незначительную усадку тканей и не обесцвечивающий образцы так сильно, как спирт. Для фиксации формалин следует использовать в виде двух-пятипроцентного раствора в дистиллированной воде. Его также можно использовать в виде десятипроцентного раствора для монтажа музейных препаратов, но через некоторое время на стекле может образоваться мутный осадок. Это наиболее подходящий фиксирующий агент, имеющийся в нашем распоряжении для глаз. Он быстро фиксирует элементы ткани, но не вызывает сильного сокращения. Его также можно использовать для фиксации мозга и спинного мозга. Для последней цели необходимо использовать большие количества жидкости, и ее нужно часто менять. Как только они достаточно зафиксированы, их следует перенести в метилированный спирт.

Жидкость Марки. — Она состоит из: —

Müller’s fluid |  2 | parts.
Osmic acid solution (one per cent.) | 1 | part.

Она используется для фиксации образцов в качестве предварительного этапа к методу Гольджи для окрашивания нервных клеток (стр. 97), а также для завершения фиксации срезов спинного мозга и т. д. перед применением модификации Шефера гематоксилинового метода Вейгерта-Паля (стр. 91).

Она также используется в качестве красителя для недавно дегенерировавших нервных трактов и волокон, особенно после экспериментальных поражений.

Жидкость обладает слабой проникающей способностью, поэтому ткани необходимо нарезать на маленькие кусочки, размером около 3/8 дюйма. Нет необходимости помещать их в эту жидкость сразу после извлечения из организма, но предварительная фиксация должна проводиться в жидкости Мюллера, а не в спирте и т. д.

Специальные фиксирующие реагенты для быстрой фиксации с целью изучения клеточной структуры.

1. Спирт.

2. Раствор Флемминга (модифицированный Фридманом): —

Osmic acid (one per cent.) | 3 | c.c. | (♏xxx.).
Glacial acetic acid | 2 | c.c. | (♏xx.).
Chromic acid (one per cent.) |  42 | c.c. | (℥j.)

Маленькие кусочки следует фиксировать в этой жидкости от двенадцати до двадцати четырех часов, а затем промыть и перенести в спирт на несколько дней перед окрашиванием.

3. Азотная кислота. — Десятипроцентный раствор в дистиллированной воде. Он фиксирует ткань за три-четыре часа, после чего следует использовать 70-процентный спирт, а фиксацию завершать в абсолютном спирте.

При использовании любого из этих методов необходимо, чтобы ткань была извлечена из организма при жизни или сразу после смерти. Они применяются для выявления изменений в клетках и их ядрах в быстрорастущей или воспаленной ткани, для изучения кариокинеза в раковых клетках и исследования внешнего вида нервных и железистых клеток в состоянии покоя, при активной работе и при утомлении; они также очень полезны при подготовке препаратов «паразитарных телец», которые были описаны во многих раковых клетках.

Декальцинирующие жидкости.

Используются при подготовке костей, зубов, костных опухолей и т. д. Две лучшие жидкости для общего использования: —

Хромово-азотная жидкость. — Она изготавливается следующим образом: —

Chromic acid | 1 | gramme |  45 | grains.
Nitric acid | 2 | grammes | 1 1/2 | drachms.
Water |  200 | c.c. | 1 | pint.

Если кость не очень плотная, жидкость можно использовать, разбавив равным количеством воды. Следует использовать большое количество жидкости, и, как и все декальцинирующие жидкости, ее следует часто менять.

Как только образец станет достаточно гибким, его следует тщательно промыть в проточной воде в течение нескольких часов, а затем перенести в спирт до тех пор, пока не будет удобно нарезать срезы.

Раствор фон Эбнера: —

Hydrochloric acid | 1 | gramme |  1 1/2 | drachms.
Common salt | 10 | grammes | 2 | ounces.
Water to |  100 | c.c. | 1 | pint.

Это очень полезный декальцинирующий агент, но он заставляет волокнистые элементы набухать несколько сильнее, чем хромово-азотная жидкость. Необходимо использовать большое количество жидкости, и ее следует менять ежедневно. После завершения декальцинации ее необходимо очень тщательно вымыть в проточной воде.

Отбеливающий раствор (eau de Javelle).

(1) | “Chloride of lime” (bleaching powder) | 20 |  1/2 | oz.
| Water |  100 |  2 1/2 | oz.

Хорошо взболтать.

(2) | Carbonate of potassium | 20 |  1/2 | oz.
| Water |  100 |  2 1/2 | oz.

Смешайте два раствора. Дайте им постоять час и отфильтруйте.

Он используется в основном для просветления растительных срезов, но может также использоваться для срезов, содержащих большое количество пигмента. Он особенно полезен при обесцвечивании срезов «мадурской стопы», вызванной присутствием черного грибка.

ГЛАВА III.

Нарезка срезов.

Заливка срезов. — Перед тем как делать срезы, ткани необходимо залить в какую-либо среду, которая проникнет в их промежутки и способна стать твердой, чтобы поддерживать самые деликатные части, когда нож проходит через ткань.

Наиболее полезными веществами являются: —

(1) гуммиарабик, (2) целлоидин, (3) парафин или воск.

Гуммиарабик. — Отборный бесцветный гуммиарабик 2 части, холодная вода 3 части.

Оставьте при частом помешивании до растворения. Добавьте десять капель карболовой кислоты на каждую унцию муцилажа.

Образцы тщательно освобождаются от всех следов фиксирующей жидкости путем промывания в воде, а затем ткань помещается в раствор гуммиарабика по крайней мере на двенадцать часов, или, если добавлено достаточно карболовой кислоты, ее можно оставить там на неопределенное время.

При замораживании гуммиарабик образует твердую некристаллическую массу, которая поддерживает ткань со всех сторон. Его нельзя замораживать слишком сильно, иначе он становится твердым и довольно хрупким и может повредить бритву. Если это произошло, поверхность можно достаточно размягчить, осторожно подышав на нее.

После нарезки в гуммиарабике срезы осторожно переносятся с ножа в дистиллированную воду с помощью мягкой кисточки из верблюжьей шерсти и оставляются там на час или два, пока среда полностью не растворится. Затем их можно окрасить и смонтировать, или их можно отложить в спирт на неопределенное время, а затем окрасить и смонтировать.

Целлоидин для многих целей является почти идеальной средой для заливки. (1) Он обладает большой проникающей способностью; (2) ему можно придать превосходную консистенцию для нарезки; (3) после того как срезы сделаны, он позволяет свободно манипулировать ими, не опасаясь их повредить; (4) будучи совершенно прозрачным и однородным в тонких срезах, его не нужно удалять со среза перед монтажом. Он нерастворим в воде и в слабом спирте; слабо растворим в спирте крепостью более 90% и очень легко растворим в эфире или в смеси спирта и эфира. Последний растворитель является наиболее часто используемым.

Раствор для заливки готовится так: —

Возьмите немного чистого целлоидина («Schering’s», продается в коробках, содержащих унцию стружки, очень хорош) и залейте его примерно восьмикратным объемом смеси равных частей абсолютного спирта и эфира. Дайте постоять всю ночь, пока целлоидин не растворится. Раствор должен быть примерно консистенции обычного муцилажа.

Также удобно иметь более жидкий раствор, приготовленный с использованием двойной пропорции спирта и эфира. Оба раствора следует хранить в широкогорлых бутылях с притертыми пробками, а пробку следует хорошо смазать вазелином в качестве дополнительного препятствия для испарения летучего эфира.

Перед заливкой образца необходимо тщательно обезвоживать его в течение двенадцати-двадцати четырех часов в абсолютном спирте. Затем его следует поместить в смесь, содержащую спирт и эфир, на час или два, а после этого перенести в жидкий раствор целлоидина на двадцать четыре часа, а затем в густой раствор на такой же период. Целлоидин проникает медленно, и в случае нервных тканей и других деликатных структур разумно дать полное время для различных этапов. Когда ткань была тщательно пропитана целлоидином, ее осторожно извлекают из целлоидина и помещают в нужное положение на кусочек пробки подходящего размера для зажима в держателе микротома. Целлоидин наносится вокруг объекта, чтобы он поддерживался со всех сторон. Затем его оставляют на воздухе, пока поверхность не станет твердой, после чего пробку помещают тканью вниз в метилированный спирт. Пробка плавает, но ткань и целлоидин остаются погруженными. По истечении двадцати четырех часов целлоидин станет полупрозрачным и опалесцирующим, и такой же консистенции, как сваренный вкрутую яичный белок. Когда невозможно ждать так долго, быструю фиксацию целлоидина можно обеспечить путем погружения его в метилированный хлороформ вместо спирта, но более медленный метод дает более стабильно удовлетворительные результаты.

Кусочки ткани, залитые в целлоидин, также можно резать на замораживающем микротоме. После того как целлоидин станет твердым в результате погружения в метилированный спирт, ткань с целлоидином вокруг нее можно срезать с пробки, промыть в воде для удаления спирта, а затем выдержать час или два в гуммиарабике, поместить на пластину эфирного микротома, заморозить и нарезать обычным способом.

Последующие операции окрашивания проводятся так же, как и для срезов, сделанных вручную или в гуммиарабике. Поскольку целлоидин лишь слегка окрашивается гематоксилином, квасцовым кармином, бура-кармином и т. д., нет необходимости удалять его со срезов, но он проявляет столь интенсивную реакцию окрашивания с анилиновыми красителями, что его необходимо удалять обработкой спиртом и эфиром либо до, либо после операции окрашивания.

Срезы после окрашивания можно монтировать в растворе Фарранта (стр. 59) или в канадском бальзаме (стр. 61). Если используется последняя среда, срез следует просветлить после обезвоживания в спирте с помощью масла бергамота или масла душицы вместо масла гвоздики, так как последнее растворяет целлоидин и заставляет срез разрушаться.

Целлоидин наиболее полезен для нарезки срезов оболочек глаза, внутреннего уха и костного мозга. Его всегда следует использовать для гематоксилинового метода Вейгерта-Паля при окрашивании нервных центров, так как он защищает срез от повреждения при переносе из одной жидкости в другую, что неоднократно требуется в процессе. Краситель полностью вымывается из целлоидина используемым обесцвечивающим раствором (стр. 90).

Парафин. — Парафин — очень удобная среда для заливки деликатных структур, так как можно получить очень тонкие срезы, и парафин не нужно удалять со среза, пока последний не окажется надежно закрепленным на предметном стекле. Он непригоден для больших срезов. Операции окрашивания нелегко выполнять после нарезки в парафине, и лучше окрашивать блоки ткани целиком перед заливкой. Лучшими красителями для проникновения являются бура-кармин (стр. 75), квасцовый кармин (стр. 76) и гематоксилин Клейненберга (стр. 70). Ткань должна оставаться в них от четырех до десяти дней.

Используются различные виды парафина. Обычно держат два вида: один «мягкий», плавящийся при 110° F, и другой «твердый», плавящийся при 140° F. Смесь двух частей твердого и одной части мягкого окажется наиболее полезной. Зимой может потребоваться большая доля мягкого сорта, а в жаркую погоду — большая доля твердого. Парафиновую массу, которая всегда доступна, недавно предложил доктор Ф. Э. Баттен, который использует обычную белую свечу, состоящую из парафина и воска. Если масса оказывается слишком твердой, ей легко можно придать подходящую консистенцию, добавив немного парафина с низкой температурой плавления.

Чтобы подготовить кусочек ткани для заливки в парафин, его следует окрасить, промыть в дистиллированной воде и удалить как можно больше влаги с помощью промокательной бумаги. Затем блок обезвоживают, сначала в метилированном спирте в течение нескольких часов, наконец в абсолютном спирте. Его осторожно берут пинцетом из спирта и помещают в ксилол на час или два в зависимости от размера. Излишки ксилола удаляются с поверхности, и ткань помещается в расплавленный парафин. Он сразу застынет вокруг холодной ткани, но вскоре снова расплавится, и его необходимо поддерживать при температуре чуть выше точки плавления в течение одного-четырех часов, в зависимости от размера. Затем ткань переносят в форму (которую легко сделать из бумаги), размером около половины дюйма, и заливают расплавленным парафином, пока форма не заполнится. Форму можно сделать, сложив кусочек бумаги в коробочку размером около половины дюйма, или можно использовать маленькую коробочку из-под таблеток. Другой удобный метод — поместить два L-образных кусочка свинца в контакт друг с другом так, чтобы они ограничивали пространство подходящего размера, как на диаграмме (рис. 3). Ткань теперь герметично запечатана и может храниться неопределенно долго, если ее неудобно резать в данный момент. Чтобы подготовить ее к нарезке, весь лишний парафин обрезают теплым ножом, а блок закрепляют на кусочке дерева, вырезанном так, чтобы он подходил к зажиму микротома, расплавив нижний конец парафинового блока горячей иглой или проволокой и прижав его к дереву.

Рис. 3.

Когда срезы нарезаны, их можно переносить по одному на предметное стекло (которое следует заранее слегка смазать насыщенным раствором целлоидина в масле гвоздики), или их можно нарезать так, чтобы задняя сторона одного среза парафинового блока прилипала к передней стороне следующего, и таким образом получается непрерывная тонкая лента серийных срезов. Ленту разбивают на отрезки длиной около двух с половиной дюймов и переносят на предметное стекло, на котором можно разместить несколько лент рядом, и таким образом сохранить большое количество срезов в том порядке, в котором они были нарезаны. На предметном стекле следует сделать отметку, указывающую, где начинается серия, и каждое стекло должно быть пронумеровано, чтобы можно было сразу определить точное положение каждого среза в серии.

Перед монтажом парафин необходимо удалить со срезов. Это легко сделать на предметном стекле в случае отдельных срезов и лент. Если срезы скручены, небольшое тепло заставит их распрямиться и лечь плоско. Стекло подогревают над спиртовой горелкой, пока парафин не расплавится. Срезы сохранят свое место благодаря целлоидину под ними. Затем ксилолу дают стечь по стеклу из пипетки, пока парафин не будет полностью растворен, что можно определить, взглянув на срезы под малым увеличением микроскопа. Стекло помещают в почти вертикальное положение, чтобы дать ксилолу стечь, излишки вытирают с края стекла промокательной бумагой, на стекло наносят каплю раствора канадского бальзама (стр. 61) и накладывают покровное стекло подходящего размера.

Микротомы. — После длительной практики лица, обладающие достаточной ловкостью рук, могут приобрести навык, позволяющий изготавливать вполне удовлетворительные срезы образцов, залитых в парафин и т. д., вручную. В патологической лаборатории одного крупного немецкого университета еще совсем недавно использование микротома было запрещено профессором, который сам является выдающимся гистологом. Количество времени, затрачиваемого на приобретение необходимого навыка, а также дешевизна и большое удобство современных микротомов привели к тому, что ручная нарезка отошла на второй план, и в настоящее время повсеместно приняты те или иные формы микротомов.

Рис. 4. — Эфирный микротом Кэткарта.

A, B. Деревянная рама и опоры. C. Стеклянные направляющие. G. Винт для подъема цинковой пластины H. J. Флакон с эфиром. L. Трубка от воздушных мехов.

На рынке представлено огромное количество таких приборов, каждый из которых обладает особыми преимуществами и зачастую особыми недостатками. Будут описаны лишь некоторые из наиболее часто используемых. Существуют микротомы для нарезки в гуммиарабике, замороженном эфирным спреем или льдом, а также предназначенные для нарезки в парафине или целлоидине.

Эфирный микротом Кэткарта (рис. 4). — Этот прибор или его более поздние модификации (см. далее) являются, пожалуй, наиболее полезным и экономичным микротомом для нужд студента. Его первоначальная стоимость невелика, он компактен и портативен, а также прост и недорог в эксплуатации.

Он состоит из дубовой рамы, которая может быть прочно закреплена на столе. На этой раме расположены две узкие параллельные опоры высотой около двух дюймов, покрытые полосками листового стекла и служащие гладкими направляющими, по которым скользит бритва при изготовлении срезов. Между ними находится латунный колодец, в котором прочно закреплена в горизонтальном положении цинковая пластина, находящаяся почти на уровне стеклянных направляющих. Она может подниматься или опускаться примерно на 3/8 дюйма с помощью винта с очень мелкой и точной резьбой. Этот винт приводится в движение большим рифленым колесом под микротомом. Прямо под цинковой пластиной расположены две небольшие трубки: одна соединена с резиновыми мехами, другая — с флаконом сбоку, содержащим эфир. Когда воздух выходит из первой трубки, он проходит над открытым концом второй, тем самым вытягивая эфир и заставляя его распыляться на цинковую пластину, одновременно вызывая его быстрое испарение, что снижает температуру цинковой пластины.

При нарезке срезов на этом микротоме ткань извлекают из гуммиарабика и помещают на цинковую пластину. Затем работают мехами до тех пор, пока гуммиарабик на цинковой пластине полностью не замерзнет. Пластину следует опустить с помощью винта так, чтобы поверхность кусочка ткани оказалась на уровне стеклянных направляющих. Их, как и бритву, следует смочить водой. Бритву, крепко удерживаемую в руке, продвигают вдоль стеклянных направляющих в довольно косом направлении. Затем пластину следует поднять, повернув винт внизу на очень малый угол, снять еще один срез и так далее. Срезы осторожно переносят с бритвы в сосуд с водой с помощью мягкой влажной кисточки из верблюжьего волоса. Иглу для этой цели использовать не следует.

Если образец очень нежный и может испортиться от скручивания на ноже, последний следует охлаждать, часто погружая его в сосуд с кусочками льда в воде. Тогда гуммиарабик останется замороженным после нарезки и будет лучше поддерживать ткань. Каждый срез следует немедленно переносить с ножа на предметное стекло, смывая его струей ледяной воды из пипетки.

В качестве ножа можно использовать обычную бритву с прямо заточенным лезвием. Ее необходимо крепко держать обеими руками. Поскольку это довольно неудобно, доктор Шеридан Делепин предложил использовать обычный нож от столярного рубанка. Для него требуется только одна рука, а другая может оставаться на головке винта внизу, чтобы поднимать пластину сразу после каждого движения ножа. Его недостатки заключаются в том, что он довольно тяжел для длительной работы и его труднее «править», чем бритву.

А. Фрейзер недавно представил ценное усовершенствование микротома Кэткарта (рис. 5).

В нем латунная рама, несущая цинковую пластину и трубки эфирного спрея, окружена латунным цилиндром, в который она точно входит и поднимается по мере необходимости при вращении винта под прибором. Эта латунная рама, а вместе с ней и цинковая пластина и т. д., могут быть легко извлечены из внешней трубки и заменены вторым латунным колодцем, который точно подходит на свое место и может подниматься винтом по мере необходимости. В нем находится небольшой зубчатый зажим, который можно затянуть, чтобы удерживать деревянный брусок с кусочком ткани, залитой в парафин. С помощью этого прибора можно также делать срезы из целлоидина, но поскольку косые движения ножом выполнить невозможно, получить очень тонкие срезы не удастся. Комбинированный микротом можно приобрести за гинею у Фрейзера, 22 Teviot Row, Эдинбург.

Рис. 5. — Модификация микротома Кэткарта по Фрейзеру.

A. Микротом, подготовленный для эфирного спрея. B. Цилиндр с зажимом для фиксации объекта, залитого в целлоидин и т. д., для замены аппарата эфирного спрея.

Существует еще одна модификация, которая более универсальна и в то же время дороже оригинальной модели. В ней вместо стеклянных направляющих для поддержки ножа используется плоская стеклянная пластина размером около восьми дюймов, достаточно большая, чтобы можно было использовать «плуг Свифта» (рис. 6) для нарезки срезов. Этот инструмент состоит из треугольной латунной рамы, опирающейся на три ножки, каждая из которых представляет собой винт с наконечником из слоновой кости. Один винт находится спереди, два — сзади. Под пластиной, удерживаемая на месте передними винтами и небольшим зажимом сзади, находится бритва лезвием вперед. Лезвие можно поднимать или опускать, вращая передний винт, на который опирается рама. Перед нарезкой срезов лезвие бритвы следует опустить до уровня ткани, следя за тем, чтобы все ножки были одинаковой длины. Плуг следует крепко взять обеими руками (указательный палец одной руки остается свободным для вращения переднего винта) и продвинуть довольно косо через ткань. Затем лезвие бритвы слегка опускают, поворачивая винт на очень малый угол, делают еще один срез и так далее. При небольшой практике можно очень быстро получать очень тонкие равномерные срезы.

Еще один полезный эфирный микротом — это микротом производства Юнга из Гейдельберга. Нож вращается вокруг оси, и имеется остроумное храповое устройство, которое работает синхронно с каждым взмахом ножа, автоматически поднимая ткань на необходимое расстояние для следующего среза. Точную толщину срезов можно регулировать с большой точностью с помощью простого приспособления. Инструмент можно приобрести в этой стране примерно за 2 фунта стерлингов. Он работает удовлетворительно, но при наличии практики студент получит столь же хорошие результаты с более дешевым «Кэткартом».

Микротом для замораживания льдом Уильямса (рис. 6).

Он состоит из круглого водонепроницаемого ящика из красного дерева, снабженного выходной трубкой внизу и покрытого прочной крышкой из листового стекла. В центре дна ящика прочно закреплена толстая латунная стойка, увенчанная латунным диском, который входит в отверстие в центре стеклянной крышки так, что его поверхность находится на одном уровне с поверхностью крышки.

Рис. 6. — Микротом для замораживания льдом Уильямса с плугом Свифта.

Для использования ящик заполняют чередующимися слоями толченого льда и соли; затем надевают крышку и закрепляют ее с помощью бокового винта. Ткань, подлежащую замораживанию, осторожно извлекают из гуммиарабика, помещают на латунный диск и обильно обмазывают гуммиарабиком вокруг. Затем ее следует накрыть оловянным колпачком на несколько минут до замерзания. Срезы изготавливаются с помощью плуга Свифта (стр. 44).

Рис. 7. — Микротом Шанце (см. текст).

Микротом Шанце (рис. 7) — это модель, используемая в лабораториях Лейпцига. Он состоит из тяжелой железной рамы с большим основанием. Нож закреплен в зажиме, который скользит по всей длине инструмента, перемещаясь по двум гладким железным пластинам, расположенным под углом друг к другу. Нож нужно перемещать очень ровно и осторожно, так как при использовании длинного лезвия легко возникают вибрации, препятствующие получению хороших срезов. Контактные поверхности должны содержаться в безупречной чистоте от пыли и смазываться равными частями оливкового и касторового масел. Имеется несколько держателей объектов, которые можно снимать и заменять: один соединен с аппаратом эфирного спрея, другой подходит для фиксации объекта, залитого в парафин, а третий — для захвата объекта, залитого в целлоидин. При использовании целлоидина необходимо применять специально длинный нож, который должен быть закреплен в зажиме очень косо. Держатель объекта поднимается с помощью точного винта, приводимого в действие большим латунным зубчатым колесом. Имеется храповое устройство, с помощью которого объект может автоматически подниматься на любое желаемое расстояние после каждого движения ножа. Он дает наиболее удовлетворительные результаты при работе с целлоидином и парафином. (Агентами являются господа Р. и Дж. Бек). Его стоимость составляет около 5 фунтов стерлингов.

Микротом Беккера изготовлен по тем же принципам, что и Шанце. Модификации заключаются в том, что каретка скользит по стеклянным пластинам вместо железных, и вместо того, чтобы вся поверхность каретки контактировала с пластинами, имеются лишь несколько гладких кнопок из слоновой кости. Таким образом, трение сводится к минимуму, и можно получить очень равномерные срезы. Цена такая же, как у Шанце.

Фрейзер представил «студенческий санный микротом» по тому же принципу, что и Шанце, который стоит около 3 фунтов стерлингов.

Кембриджский качающийся микротом. — Этот инструмент, изготовленный Кембриджской компанией научных инструментов или в слегка модифицированной форме господами Свифт (рис. 8), является лучшим прибором для нарезки срезов мелких объектов, залитых в парафин. С его помощью можно получать ленты серийных срезов с большей легкостью и уверенностью, чем с другими микротомами. Этот микротом отличается от ранее описанных тем, что нож неподвижен, а объект подвижен. Микротом состоит из продолговатой тяжелой металлической подставки. Длинный рычаг устроен так, что он качается на двух прочных вертикальных стойках, поднимающихся из рамы. Один конец этого рычага полый и принимает деревянный брусок с тканью, залитой в парафин, который прочно зажимается на месте. Этот конец опускается с помощью сильной спиральной пружины. Чтобы поднять его, предусмотрено устройство, с помощью которого другой конец рычага опускается шнуром, вращающимся вокруг шкива. Когда ручка поворачивается, ткань поднимается, а когда шнур ослабляется, пружина тянет ткань прочно и ровно вниз. Бритва, которая должна иметь прямое лезвие, прочно закрепляется винтами лезвием вверх на конце микротома. Затем объект регулируется так, чтобы при его опускании бритва срезала тонкий слой. Существует остроумное устройство, с помощью которого опускание рычага для подъема среза продвигает его немного дальше в направлении бритвы. Расстояние можно регулировать от 1/500 до 1/3000 дюйма. Таким образом, фактическая работа машины очень проста. После того как положение блока с тканью, подлежащей нарезке, отрегулировано так, чтобы бритва едва касалась ее, свободный конец опускается с помощью шкива. Это также продвигает срез немного дальше бритвы. Затем сильная пружина ровно тянет ткань мимо лезвия бритвы, и тонкий срез остается на лезвии. Его можно сразу перенести на предметное стекло, или, если парафин имеет надлежащую консистенцию, можно сделать еще один срез, при этом два среза должны слипнуться краями, и таким образом, повторяя движение, можно получить непрерывную ленту. Если возникают трудности с получением хорошей ленты, их обычно можно преодолеть, взяв немного мягкого парафина и прикрепив его с помощью горячей иглы к нижнему концу парафинового блока. Стоимость инструмента составляет около 5 фунтов стерлингов.

Рис. 8. — Модификация кембриджского качающегося микротома по Свифту.

Свежие срезы. — Хотя они не столь удовлетворительны, как фиксированные образцы для точной гистологической работы, их часто очень полезно изготавливать как в секционной, где требуется немедленное заключение о природе опухоли или больного органа, так и в операционной. При небольшой практике срезы можно нарезать, окрасить и смонтировать в течение десяти минут после извлечения образца из организма. Таким образом, оперирующему хирургу может быть предоставлена важная информация, и нередко это приводило к полному изменению предполагаемого лечения. Так, в одном случае предполагаемый хронический периостит оказался саркомой, и конечность была ампутирована. В другом случае предполагаемая саркома бедра оказалась гуммой, когда часть ее была удалена и исследована микроскопически.

Часть образца следует поместить без какой-либо подготовки на цинковую пластину микротома для замораживания и обмазать вокруг гуммиарабиком. Затем его замораживают. Сыворотка в тканях не находится в достаточном количестве, чтобы повредить нож при замораживании. Нож следует смочить, а срезы переносить либо в перикардиальную сыворотку, либо в 3/4-процентный раствор (70 гран на пинту) поваренной соли, ни один из которых не вызывает набухания клеток, как это делает обычная вода. Их следует осторожно расправить на предметном стекле — операция, требующая гораздо большего терпения, чем в случае с фиксированными срезами, так как свежие срезы менее когерентны, а также более липкие, из-за чего края стремятся свернуться на ноже и т. д. Затем их следует исследовать: один неокрашенным, просто смонтированным в солевом растворе; другой окрашенным пикрокармином и исследованным в солевом растворе; и третий окрашенным пикрокармином, смонтированным в растворе Фарранта и законсервированным. Последний обычно дает наилучшие результаты, окрашивание пикрокармином становится совершенно ярким через неделю. Глицерин, однако, имеет тенденцию вызывать значительную усадку срезов, а вес покровного стекла стремится разрушить нефиксированный срез.

ГЛАВА IV.

Монтаж срезов.

1. Методом флотации.

При этом методе срез, окрашенный или неокрашенный, помещают в чашку с водой или нормальным солевым раствором (стр. 53). Затем чистое предметное стекло вводят в воду под углом около 60°, при этом чуть более половины его длины погружается. Затем срез подносят иглой и максимально расправляют на стекле. Один угол фиксируют иглой, и при осторожном извлечении стекла срез должен лежать ровно. Если остались складки, не следует пытаться разгладить их иглой, а стекло нужно снова погрузить в воду до тех пор, пока сложенная часть среза не окажется под водой. Затем его следует осторожно извлечь, после чего складка исчезнет. Этот маневр необходимо повторять в разных направлениях, пока срез не ляжет на стекло совершенно ровно. Окрашенные и неокрашенные срезы расправляют таким образом перед монтажом в среде Фарранта, а неокрашенные срезы — перед окрашиванием пикрокармином.

2. Переносом с помощью расправляющего шпателя.

Этот метод применяется при монтаже в канадском бальзаме для переноса среза из просветляющего агента (стр. 63) на предметное стекло. Шпатель полируют и подсовывают под срез. Срез, удерживаемый на месте иглой, теперь поднимают из жидкости, излишки которой удаляют, удерживая срез на месте препаровальной иглой и наклоняя шпатель, чтобы дать ей стечь.

Удаление пузырьков воздуха из срезов. — Когда срезы содержат много пузырьков воздуха, лучше всего оставить их на некоторое время в метилированном спирте. Тогда пузырьки сливаются и выходят из среза.

Для нежных структур и свежих срезов перенос в спирт и последующее расправление среза при возвращении в воду рискованны, и лучший метод обработки в таких случаях — поместить сосуд с ними под колпак воздушного насоса, если таковой имеется, и слегка откачать воздух.

Однако наиболее частой причиной появления пузырьков воздуха в смонтированных препаратах является использование покровных стекол, которые не были тщательно очищены. Правильную очистку лучше всего проводить, помещая стекла после покупки в широкогорлый флакон с притертой пробкой, содержащий концентрированную азотную кислоту, и оставляя их в этой жидкости на двадцать четыре часа. Затем кислоту следует слить, а через сосуд пропускать воду из-под крана до тех пор, пока промывные воды перестанут давать кислую реакцию с лакмусовой бумагой. Затем воду следует слить, а стекла залить абсолютным спиртом. Их можно извлекать по одному и быстро высушивать по мере необходимости. При использовании покровных стекол, правильно очищенных таким образом, не только удастся избежать пузырьков воздуха, но и стекла будет гораздо легче высушить тканью, и меньше их будет разбиваться в процессе.

Другой очень частой причиной является перенос пузырьков воздуха вместе с монтажной средой на стеклянной палочке. Это происходит особенно часто, если палочка вплавлена в пробку. Правильные флаконы для использования как для среды Фарранта, так и для бальзама — это «бальзамные флаконы», у которых нет пробки, а горлышко закрывается стеклянным колпачком, который точно прилегает (рис. 9). Короткая стеклянная палочка прикреплена к колпачку и используется для переноса среды на предметное стекло.

Fig. 9.—Balsam bottle.

Обработка сложенных срезов. — Складывание может быть вызвано:

(1.) Тем, что срез смялся из-за того, что его резали ножом, поверхность которого была не идеально гладкой. Это лучше всего исправить, поместив срез на минуту в метилированный спирт, а затем перенеся его в чашку с чистой водой, когда срез быстро поднимется на поверхность и расправится на поверхности воды вследствие быстрой диффузии спирта из краев в окружающую воду.

(2) Тем, что срез содержит большое количество жира, как в срезах кожи и подкожной клетчатки. Жир можно удалить из жировых клеток, не меняя существенно внешний вид среза. Это делается путем обезвоживания среза в спирте, а затем переноса в часовое стекло, содержащее эфир или хлороформ, для экстракции жира. Ткань следует промыть от эфира в спирте, а затем перенести в чашку с водой и дать расправиться. Этот процесс не мешает последующим операциям окрашивания.

Монтажные среды.

Раствор Фарранта:—

Gum Arabic (picked, colourless) | [picture] | equal parts.

Glycerine

Water

При изготовлении этого раствора необходимо использовать лучший гуммиарабик, причем только самые прозрачные его кусочки. Следует избегать «порошкообразной камеди акации», так как, хотя она выглядит белой, она часто дает коричневую слизь, а кроме того, часто фальсифицируется крахмалом и т. д.

Глицерин и воду следует смешать и добавить гуммиарабик. Смесь следует оставить на несколько недель, часто помешивая, пока весь гуммиарабик не растворится. Затем дайте ей постоять еще неделю или две, чтобы грязь осела, а пузырьки поднялись наверх. Пленку следует удалить, а прозрачную жидкость слить с осадка в «бальзамный флакон» (стр. 58), содержащий несколько капель насыщенного раствора арсената натрия и небольшой кусочек камфоры.

При правильном изготовлении это чрезвычайно полезный монтажный реагент. Он не слишком сильно просветляет ткани, и благодаря содержанию гуммиарабика он высыхает по краям и более или менее прочно цементирует покровное стекло через неделю или две. Если этого не происходит, значит, среда содержит слишком много глицерина, и необходимо добавить больше гуммиарабика, чтобы компенсировать это. Такое высыхание по краям предотвращает дальнейшее испарение, в то время как глицерин поддерживает срез постоянно влажным.

Камфора и арсенат натрия предотвращают образование грибков. Срезы сохраняют свой первоначальный вид в этой среде в течение многих лет. Через долгое время они склонны становиться немного мутными и зернистыми.

Неокрашенные срезы всегда следует монтировать в среде Фарранта, так как процесс с канадским бальзамом делает их совершенно прозрачными. Она подходит практически для любой ткани, окрашенной или неокрашенной, но срезы нервных центров требуют монтажа в канадском бальзаме из-за непрозрачности миелина при монтаже в глицерине.

Раствор канадского бальзама:— Среда изготавливается так:—

Обычный канадский бальзам, имеющий консистенцию патоки, осторожно нагревают на водяной бане в течение нескольких часов, чтобы удалить скипидар и другие летучие масла. Затем его оставляют остывать до желтой стекловидной массы. Возьмите:

Dried Canada balsam | [picture] | equal parts.

Xylol

Оставьте до растворения, периодически помешивая.

Если раствор не является совершенно прозрачным, его необходимо профильтровать через очень тонкую бумагу, предварительно смоченную ксилолом. Если среда слишком густая, следует добавить больше ксилола; если слишком жидкая, ксилолу следует дать испариться, пока среда не приобретет консистенцию жидкого сиропа.

Если среда сделана слишком жидкой, возникнет много неприятностей из-за ее испарения по краю покровного стекла, оставляя воздушное пространство, которое будет увеличиваться ежедневно, пока срез не останется совсем сухим. Это следует исправить, нанеся еще одну каплю бальзама на край покровного стекла и позволив ей затечь внутрь и вытеснить воздух. Вскоре после этого следует нанести кольцо цемента.

Флакон, в котором хранится бальзам, должен быть очень тщательно высушен перед наполнением, а затем ополоснут абсолютным спиртом, а впоследствии ксилолом. Скипидар или бензол часто используются вместо ксилола при приготовлении среды и в той же пропорции, но последний менее склонен вымывать анилиновые красители из срезов.

Для монтажа срезов в канадском бальзаме их необходимо сначала перенести в часовое стекло, содержащее абсолютный спирт или спиртовой раствор какого-либо окрашивающего реагента, например, эозина (стр. 72), и оставить в нем, не пытаясь расправить, до полного обезвоживания, т. е. примерно на две минуты. Затем его следует перенести в просветляющее масло на препаровальной игле или на расправляющем шпателе, который должен быть совершенно сухим, так как любая капля влаги, попавшая на срез, будет препятствовать просветляющему действию масла и вызовет неприглядные непрозрачные участки при монтаже среза. Даже дыхание на срез по пути к просветляющему агенту предотвратит равномерность просветления. Если в срезе во время пребывания в масле появляются белые пятна, его необходимо извлечь с как можно меньшим количеством масла и снова обезвожить в абсолютном спирте.

Процесс просветления должен выполняться в какой-либо среде, в которой канадский бальзам легко растворим и которая также легко смешивается со спиртом. Наиболее часто используемые — это гвоздичное масло, ксилол, бергамотовое масло, кедровое масло и масло душицы. Первое из названных всегда широко использовалось из-за приятного запаха, дешевизны и легкости, с которой его можно получить. Но оно имеет недостаток: растворяет многие важные окрашивающие реагенты, особенно эозин и различные анилиновые красители. Кроме того, поскольку оно растворяет целлоидин, срезы, сделанные в этой среде, имеют тенденцию распадаться при переносе в гвоздичное масло, поэтому для целлоидиновых срезов всегда следует использовать одно из других масел (которые не обладают растворяющим действием на целлоидин). Бергамотовое масло наиболее универсально, но довольно дорогое. Там, где есть особые причины для использования других обезвоживающих агентов, они будут указаны в специальных инструкциях для конкретных методов окрашивания в главах VI и VII.

Как только срез погружается в масло, спирт быстро диффундирует наружу, так что края среза расправляются вместе с ним, и срез плавает совершенно ровно на поверхности масла. Когда он полностью просветлен (примерно через минуту), о чем свидетельствует его погружение в масло, его следует перенести на предметное стекло с помощью расправляющего шпателя, а масло слить. Излишки масла можно удалить, осторожно прижимая срез плоским куском фильтровальной бумаги, сложенным в несколько раз. Если выполнять это осторожно, маневр не повредит срез, но он требует практики.

Если ткань очень нежная и может быть повреждена при перемещении из одного сосуда в другой, или если она больше, чем может удобно перенести расправляющий шпатель, ее следует расправить на предметном стекле и, удалив как можно больше воды фильтровальной бумагой, обезвожить, добавив немного спирта из пипетки один или два раза. Затем большую часть спирта следует удалить, наклонив стекло, и до того, как остаток испарится, добавить немного гвоздичного или бергамотового масла из другой пипетки. Сначала срез будет плавать на масле, но последнее постепенно пройдет сквозь него и появится на поверхности среза. Когда это произойдет, просветление завершено, и масло можно слить, наклонив стекло, а срез смонтировать в канадском бальзаме.

Цементирование покровных стекол. — Покровные стекла можно приклеивать, чтобы предотвратить их смещение и порчу препарата. Если покровное стекло круглое, следует использовать вращающийся столик Шадболта. Он состоит просто из горизонтального тяжелого латунного диска, легко вращающегося на оси. На диске концентрически начерчено несколько кругов. Затем стекло закрепляют на диске с помощью зажимов так, чтобы окружность покровного стекла соответствовала одному из кругов. Затем диск вращают, а цемент наносят на край покровного стекла кисточкой.

Используется много материалов. Наиболее подходящие: (1) Канадский бальзам, который почти бесцветен и прозрачен и выглядит очень аккуратно. (2) Золотой лак. (3) Морской клей.

Когда они высохнут, законченный вид стеклу можно придать, нанеся кольцо цинковых белил. Оно изготавливается следующим образом:—

Oxide of zinc |  1/2 drachm.
Benzole | [picture] | half an ounce  of each.
Gum dammar

Сохранение срезов. — Их следует хранить в плоском виде и оберегать как от света, так и от пыли. Очень полезные картонные лотки сейчас продаются почти всеми дилерами в коробках, рассчитанных на двадцать четыре дюжины стекол, примерно за восемь шиллингов, или подходящие шкафчики может изготовить столяр.

ГЛАВА V.

Общие методы окрашивания.

Много информации можно получить из неокрашенных срезов, и в большинстве случаев один срез следует исследовать неокрашенным, но препараты, смонтированные таким образом, настолько прозрачны, что изучать детали ткани затруднительно. Поэтому их обычно готовят, обрабатывая каким-либо окрашивающим реагентом, не только для того, чтобы сделать их менее прозрачными, но и для «дифференцировки» элементов среза путем окрашивания одной части более интенсивно, чем другой, или в другой цвет. Так, гематоксилин окрашивает ядра и быстро растущие части ткани, оставляя сформированный материал, как правило, гораздо более слабо окрашенным. Метиловый фиолетовый, в свою очередь, окрашивает здоровые ткани в синий цвет, а части, пораженные восковидной дегенерацией, — в красно-фиолетовый. Комбинируя красители, также можно добиться значительной дифференцировки элементов ткани. Срезы следует окрашивать несколькими реагентами, так как их действие на отдельные образцы сильно варьируется.

Ниже приведены наиболее полезные красители для общих целей:—

Кампеш (Logwood). — Этот краситель или его очищенный принцип гематоксилин — наиболее полезный общий краситель. Сам гематоксилин предпочтительнее, так как дает более постоянные результаты и менее диффузное окрашивание.

Для общих целей окрашивания следующая формула даст отличные результаты:— Гематоксилин. Формула Шухардта. —

(a) | Hæmatoxyline | 3 | grms. |  30 | grs.
| Absolute alcohol | 16 | c.c. | 2 1/2 | drms.
(b) | Pure alum | 3 | grms. | 30 | grs.
| Distilled water |  100 | c.c. | 2 | ozs.

Добавляйте (a) к (b) по каплям при постоянном перемешивании. Храните несколько дней на рассеянном дневном свету, пока цвет не станет настолько глубоким, что не будет пропускать свет. Затем его следует профильтровать и добавить кристалл тимола. Сначала он не даст очень удовлетворительных реакций окрашивания, и ему следует дать созреть не менее месяца или шести недель перед использованием. Он улучшается как краситель с каждым месяцем хранения. Всякий раз, когда гематоксилин был приготовлен с квасцами, как в приведенной выше формуле, через некоторое время образуется обильный красно-коричневый осадок. Это никак не мешает активности раствора, но перед использованием его всегда необходимо фильтровать.

Формула Барретта. — Представлена доктором У. Х. Барреттом из Белфаста. Она дает почти такие же хорошие результаты, как и вышеуказанная. Она изготавливается из обычного английского экстракта кампеша и значительно дешевле.

Экстракт следует высушить, мелко истолочь, а затем экстрагировать абсолютным спиртом в течение нескольких дней.

Powdered extract of logwood | 2 | grms. |  1 1/2 | drms.
Absolute alcohol |  10 | c.c. | 1 | oz.

Профильтруйте и медленно добавьте к

Benzoate of sodium | 1 | grm. |  36 | grs.
Alum | 1 | grm. | 36 | grs.
Distilled water |  100 | c.c. | 10 | ozs.

Сила раствора будет варьироваться в зависимости от разных образцов кампеша и должна оцениваться опытным путем. Этот раствор сравнительно дешев и полезен для учебных целей.

Гематоксилин Эрлиха. — Этот очень полезный ядерный краситель изготавливается следующим образом:—

(a) | Hæmatoxyline | 2 | grms. | 9 | grs.
| Absolute alcohol | 100 | c.c. | 2 | ozs.
(b) | Glycerine | 100 | c.c. | 2 | ozs.
| Distilled water | 100 | c.c. | 2 | ozs.
| Alum |  120 | grms. | 2 1/2 | ozs.
| Glacial acetic acid | 5 | c.c. |  24 | mins.

Медленно добавляйте (a) к (b) при постоянном перемешивании.

Дайте созреть на солнечном свету в течение двух месяцев перед использованием. Его можно использовать как быстрый краситель в неразбавленном виде, но гораздо лучшие результаты получаются при использовании слабого раствора: несколько капель на часовое стекло с дистиллированной водой, окрашивая медленно от получаса до двух часов. Раствор улучшается при хранении. Если через некоторое время окрашивание становится диффузным, это указывает на то, что уксусная кислота испарилась, и следует добавить еще несколько капель.

Гематоксилин Клейненберга. — Эта формула отличается от предыдущей тем, что является спиртовым раствором. Хлорид кальция добавляется, потому что он «создает диффузионные токи между спиртом в материале, подлежащем окрашиванию, и спиртовым окрашивающим раствором, тем самым позволяя последнему проникать быстрее» (Сквайр). Он широко используется при окрашивании эмбриональных образцов целиком перед заливкой в парафин и был настоятельно рекомендован для этой цели Фостером и Мейтлендом Бальфуром.

Время от времени предлагались различные формулы. Ту, что рекомендована Сквайром (Methods and Formulae, стр. 25), можно точно приготовить без особых трудностей.

(a) | Crystallised calcium chloride |  20 | grs. |  1/2 | oz.
| Distilled water | 10 | c.c. | 2 | drms.
(b) | Alum | 3 | grms. | 32 | grs.
| Distilled water | 16 | c.c. |  170 | mins.

Смешайте и добавьте

Rectified spirit |  240 | c.c. |  8 | ozs.

Дайте постоять, чтобы отделился избыток сульфата кальция и т. д. Профильтруйте и добавьте

Hæmatoxyline |  2 1/2 | grms. |  25 | grs.

В качестве консерванта следует добавить немного тимола.

При приготовлении этих растворов необходимо следить за тем, чтобы использовалась только дистиллированная вода и чтобы все используемые сосуды были предварительно ополоснуты ею, иначе произойдет осаждение гематоксилина.

Если срезы были перекрашены гематоксилином, это можно исправить, промыв их в полупроцентном растворе уксусной кислоты до тех пор, пока не вымоется достаточное количество красителя, но окрашивание будет более диффузным, чем если бы в первом случае была достигнута золотая середина.

Гематоксилин окрашивает ядра клеток в красивый фиолетовый цвет, а также более или менее слабо окрашивает клеточную протоплазму и волокнистые элементы. Он также окрашивает осевые цилиндры нервов и широко используется при специальном окрашивании нервных центров, как будет описано далее (стр. 88–91).

Краситель стойкий. Срезы можно монтировать либо в растворе Фарранта, либо в канадском бальзаме, причем последний предпочтительнее.

Эозин. — Гораздо более удовлетворительные результаты получаются от коммерческого эозина (аморфный оранжевый порошок, используемый в крашении и производстве красных чернил), чем от чистой кристаллической формы.

Его можно использовать в виде водного раствора (1/30 процента) или в виде раствора в абсолютном спирте (1/15 процента). Срезы, окрашенные первым, следует быстро пропустить через однопроцентный раствор уксусной кислоты, чтобы «зафиксировать» краситель, а затем промыть в дистиллированной воде.

Это очень прозрачный краситель, и самые тонкие детали среза, окрашенного им, прекрасно видны.

Он лишь слегка окрашивает ядро, в то время как клеточную протоплазму, волокнистые ткани и особенно мышечные ткани окрашивает в красивый розовый цвет.

Таким образом, видно, что он окрашивает те части, которые остаются неокрашенными гематоксилином, и наоборот. Это комплементарное действие применяется в следующем методе.

Двойное окрашивание эозином и гематоксилином. — Срезы, окрашенные гематоксилином обычным способом, промывают в дистиллированной воде и обезвоживают в растворе (около 1 к 1500) эозина в абсолютном спирте. Они должны оставаться в нем около двух минут, а затем их следует пропустить через гвоздичное масло и смонтировать в канадском бальзаме обычным способом.

Этот метод дает чрезвычайно полезные и красивые результаты почти со всеми тканями и превосходит пикрокармин для дифференцировки элементов ткани. Так, ядра окрашиваются в фиолетовый цвет, клеточная протоплазма — в гораздо более бледный и теплый фиолетовый, волокнистые ткани — в розовый, а эритроциты — в оранжевый или кирпично-красный.

Спиртовой раствор эозина также используется в качестве контрастного красителя после окрашивания на микроорганизмы синими или фиолетовыми красителями.

Кармин. — Он изготавливается следующим образом:—

Carmine (best) | 2 | 1 | drachm.
Strong ammonia | 2 | 1 | drachm.
Distilled water |  100 |  6 | ounces.

Разотрите кармин с небольшим количеством воды в ступке, добавьте аммиак, после чего жидкость почернеет. Постепенно добавляйте остальную воду, все время растирая. Его следует разлить по флаконам, дать постоять несколько дней, а затем профильтровать и положить во флакон кусочек камфоры.

Литиевый кармин тесно связан с аммиачным кармином по своему окрашивающему эффекту. Обычно это вопрос индивидуальных предпочтений, какой из них использовать.

Carmine | 2 1/2 | grms. |  10 1/2 | grs.
Saturated aqueous solution of lithium carbonate |  100 | c.c. | 2 | ozs.

Растворите и профильтруйте.

Срезы могут быть достаточно окрашены в любой из этих жидкостей за три-пять минут, но более удовлетворительные результаты можно получить, разбавив их в двадцать раз большим объемом дистиллированной воды и оставив срезы окрашиваться на двадцать четыре часа.

После окрашивания кармином срезы необходимо пропустить через полупроцентный раствор уксусной кислоты, чтобы зафиксировать кармин в тканях, иначе вода вымоет краситель.

Бура-кармин —

(a) | Borax | 4 | grms. | 3 | drachms.
| Carmine | 2 | grms. |  1 1/2 | drachms.
| Distilled water |  100 | c.c. | 5 | ounces.

Растворите с помощью нагревания и медленно добавьте к (b).

(b) | Alcohol | 70 | c.c. |  3 1/2 | ounces.
| Distilled water |  30 | c.c. | 1 1/2 | ounce.

Дайте постоять две недели. Профильтруйте и добавьте кусочек камфоры.

Для использования поместите срезы или ткань целиком в него на срок от четырех до двадцати четырех часов, в зависимости от размера, а затем перенесите в спирт (семьдесят процентов), содержащий каплю соляной кислоты на унцию, на двадцать четыре часа, а затем тщательно промойте в воде. Затем ткань можно поместить в гуммиарабик, если ее нужно заморозить, или обезвожить в спирте, если будут использоваться парафин или целлоидин.

Его преимущество в том, что он очень диффузен, поэтому его можно использовать для окрашивания тканей целиком. Требуется значительное время для достаточно глубокого окрашивания, но мало опасений перекрашивания.

Он ярко окрашивает нервные клетки и осевые цилиндры, а также соединительную ткань, делая склерозированный участок очень заметным.

Квасцовый кармин:—

Alum five per cent. solution in distilled water |  100 | c.c. | 1 | oz.
Pure carmine | 1 | grm. |  4 1/2 | grs.

Кипятите в течение двадцати минут. Профильтруйте. Добавьте несколько капель карболовой кислоты.

При использовании этого реагента его следует профильтровать в часовое стекло и поместить в него срезы не менее чем на час. Нет опасений перекрашивания, и их можно оставить на всю ночь. После окрашивания их необходимо тщательно промыть в воде, чтобы удалить квасцы, иначе при монтаже среза в поле зрения будут видны многочисленные кристаллы. Срезы можно монтировать в растворе Фарранта или в канадском бальзаме. Окрашивающий эффект значительно улучшается после того, как срез постоит несколько дней.

При желании его окрашивающее действие можно дополнить обезвоживанием в спиртовом растворе либо эозина (1 к 1500), либо пикриновой кислоты, а затем просветлением в гвоздичном масле и монтажом в канадском бальзаме.

Сам по себе он дает окраску, очень похожую на гематоксилиновую, только теплее. Он выделяет ядра и осевые цилиндры нервов, слегка окрашивает клеточную протоплазму, а волокнистые элементы почти не окрашивает.

Его можно использовать для тех же целей, что и гематоксилин. Цвет менее привлекателен и не такой глубокий, как у последнего, но поскольку он не перекрашивает срезы, даже если оставить их в нем на неделю, это очень удобный краситель для общих целей.

Он особенно полезен в качестве контрастного красителя для срезов головного и спинного мозга после гематоксилинового метода Вейгерта-Паля (стр. 88).

Аммиачный пикрокармин ранее очень широко использовался в качестве окрашивающего реагента. Его место теперь в значительной степени занял литиевый пикрокармин.

При его приготовлении необходимо использовать лучший кармин.

Он изготавливается следующим образом:—

Carmine | 1 | part.
Liq. ammon. fort. | 3 | parts.
Distilled water |  3 | parts.

Растворите при слабом нагревании и добавьте

Cold saturated aqueous solution of picric acid |  200 | parts.

Доведите смесь до точки кипения, а затем поместите в неглубокий сосуд, накрытый стеклянной пластиной, и оставьте на ярком солнечном свету на месяц или более. Профильтруйте, разлейте по флаконам и добавьте шесть капель карболовой кислоты на каждую унцию смеси. Он будет храниться бесконечно долго и улучшается с возрастом. Его требуется время от времени фильтровать, так как из раствора имеет тенденцию выпадать студенистая малиновая муть.

Литиевый пикрокармин. — Приготовлен следующим образом:—

Carmine | 2·5 | grms. |  10 | grs.
Saturated solution lithium carbonate |  100 | c.c. | 1 | oz.

Растворите и добавьте

Saturated solution picric acid |  250 | c.c. |  2 1/2 | oz.

Добавьте несколько капель карболовой кислоты на каждую унцию.

Он должен постоять день или два на солнечном свету, а затем быть профильтрованным. Он улучшается при хранении.

Его следует хранить во флаконе с притертой пробкой, в которую вплавлена стеклянная палочка.

Когда срезы подлежат окрашиванию, их следует расправить на чистом предметном стекле, как описано на странице 55. Затем стекло следует наклонить, чтобы дать воде стечь, а излишки влаги вокруг среза удалить мягкой тряпкой или фильтровальной бумагой. Затем на стекло следует перенести каплю или две красителя, и оставить стекло лежать совершенно ровно примерно на десять минут. Если в комнате не очень тепло, рекомендуется очень осторожно нагреть стекло над спиртовкой, так как это заставляет ткани окрашиваться ярче и быстрее.

Излишки пикрокармина следует слить со стекла, а само стекло протереть. Однако часть красителя следует оставить на срезе, так как его действие продолжает усиливаться и часто полностью проявляется только через несколько недель. Их следует монтировать в среде Фарранта. Как правило, те, что смонтированы в канадском бальзаме, не дают таких хороших результатов. Если есть особые причины для использования этой среды, как при монтаже срезов спинного мозга и т. д., их следует обезвоживать после окрашивания пикрокармином в спиртовом растворе пикриновой кислоты (одна часть насыщенного спиртового раствора на пять частей спирта) перед просветлением в гвоздичном масле, иначе спирт вымоет пикриновую кислоту, и большая часть дифференциального окрашивающего эффекта будет потеряна. Ядра должны быть окрашены в ярко-малиновый цвет, протоплазма клеток — в желтый или тускло-розовый, волокнистые элементы — в ярко-розовый, эритроциты — в зеленый, а весь мертвый материал, например, казеозные массы, — в ярко-желтый. Он также очень ярко окрашивает нервные клетки и осевые цилиндры нервных волокон. Однако это довольно ненадежный краситель. Результаты наиболее блестящие в случае свежих срезов.

Осмия кислота бесценна для окрашивания жировых частиц в клетках.

Для обычного использования однопроцентный исходный раствор (стр. 21) следует разбавить в десять раз большим объемом дистиллированной воды, а срезы окрашивать в нем всю ночь в темном шкафу, или часовое стекло, содержащее их, можно поместить внутрь небольшой коробки.

Срезы необходимо тщательно промыть в большом количестве воды. При желании их можно впоследствии окрасить пикрокармином или метиловым фиолетовым, если также присутствует восковидная дегенерация. Срезы следует монтировать в среде Фарранта, так как канадский бальзам обычно дает разочаровывающие результаты.

Он позволяет выявить мельчайшие жировые частицы в перерождающихся клетках и т. д., окрашивая их в черный цвет. Его можно использовать для демонстрации жировых глобул, закупоривающих сосуды при жировой эмболии.

Он окрашивает миелиновые оболочки нервов в черный цвет; к нему мы еще вернемся при описании методов окрашивания спинного мозга.

Нитрат серебра используется для окрашивания межклеточного цемента эпителиальных клеток. Он окрашивает это вещество в глубокий черный цвет, в то время как остальная ткань приобретает коричневый оттенок. Его применяют в виде полупроцентного раствора на дистиллированной воде, который хранят в склянке с притертой пробкой, тщательно обернутой коричневой бумагой. Для использования возьмите немного эпителиальной ткани, например, сальник недавно убитого животного или срез какой-либо эпителиальной опухоли, сразу после иссечения. Тщательно промойте в дистиллированной воде, чтобы удалить все хлориды, а затем поместите в часовое стекло, содержащее раствор серебра. Держите его в темноте в течение получаса, а затем тщательно промойте большим количеством воды. Срез следует заключить в глицерин или среду Фарранта и беречь от света, иначе он окрасится слишком сильно.

Хлорид золота используется для демонстрации периферических окончаний нервов. Его можно применять только в течение первых получаса после извлечения ткани из живого организма. Кусочки ткани должны быть небольшими; их можно окрашивать целиком, а срезы изготавливать впоследствии.

Используется полупроцентный раствор на дистиллированной воде. Ткань переносят в него сразу после извлечения из организма и выдерживают до тех пор, пока она не приобретет лимонный цвет. Затем ее подвергают воздействию однопроцентного раствора уксусной кислоты при ярком освещении, пока она не приобретет пурпурный оттенок, что занимает от двух часов до двух суток. Срезы следует заключать в среду Фарранта. Он окрашивает клетки ткани и нервные клетки в красновато-пурпурный цвет, а нервные фибриллы, особенно терминальные, — в более фиолетовый. Это очень хорошо видно на роговице.

Иногда для клинических целей бывает полезно иссечь кусочек мышечной ткани и исследовать нервные окончания этим методом. К сожалению, действие этого красителя несколько ненадежно. Лучшие результаты достигаются с помощью хлораль-гематоксилинового метода Зилера (стр. 92).

Метиловый фиолетовый. — Очень удовлетворительный раствор можно получить в готовом виде в составе «telegraphen tinte» (телеграфных чернил), изготовляемых Леонхарди в Дрездене, как рекомендовал Вудхед. Его также можно использовать в виде однопроцентного раствора на дистиллированной воде с добавлением нескольких капель карболовой кислоты для предотвращения роста грибков.

Это очень полезный избирательный краситель. Он дает две реакции: красно-фиолетовую и сине-фиолетовую. Так, он окрашивает матрикс гиалинового хряща в сине-фиолетовый цвет, а клетки — в красно-фиолетовый. Он также имеет важнейшее патологическое применение, поскольку выявляет любые участки, подвергшиеся «восковому» или «амилоидному» перерождению, окрашивая их в красно-фиолетовый цвет, а остальную часть среза — в сине-фиолетовый.

Около десяти капель однопроцентного раствора следует отфильтровать в часовое стекло с водой и окрашивать срезы в течение примерно пяти минут. Затем их необходимо провести через полупроцентный раствор уксусной кислоты и тщательно промывать в течение некоторого времени в большом количестве воды, пока краситель не перестанет вымываться.

Если эти этапы не выполнять тщательно, краситель будет диффундировать после заключения среза, размывая все детали и портя внешний вид препарата.

Срезы можно заключать в раствор Фарранта (в который можно добавить каплю муравьиной кислоты): при заключении в канадский бальзам срезы необходимо перекрашивать, так как и спирт, и гвоздичное масло быстро растворяют краситель.

Сафранин. — Используется в виде свежеприготовленного насыщенного раствора в анилиново-масляной воде, подогретого до 60° C (140° F). Отфильтруйте в часовое стекло. Окрашивайте не более минуты. Обезвоживайте в спирте, который удалит большую часть красителя, просветляйте в гвоздичном или душицевом масле. Заключайте в бальзам.

Другой метод заключается в окрашивании в течение примерно десяти минут с последующим выдерживанием в течение минуты в йодном растворе Грама. Затем срезы промывают в спирте, обезвоживают, просветляют в гвоздичном масле и заключают в бальзам. При использовании этих методов краситель вымывается отовсюду, кроме определенных элементов, например, подвергающихся коллоидному или известковому перерождению.

Иногда используют четвертьпроцентный водный раствор, так как он очень ярко окрашивает ядрышки и активно делящиеся ядра, в то время как остальная часть клетки окрашивается слабо. Его можно использовать для изучения кариокинеза в клетках быстрорастущего рака.

Краситель Эрлиха-Бионди. — Этот краситель широко применяется для окрашивания препаратов крови, изучения кариокинеза и исследований предполагаемых паразитарных тел, обнаруживаемых в раковых клетках.

Его готовят путем медленного смешивания насыщенных водных растворов следующих анилиновых красителей при постоянном помешивании:

Solution of Orange G |  100 | parts
   "    Rubin S | 20 |  "
   "    Methyl Green OO | 50 |  "

наконец добавьте

Distilled water |         70 |  "

Отфильтруйте обильный осадок, который образуется. Раствор необходимо готовить часто, так как он плохо хранится.

Срезы можно окрашивать быстро, в течение получаса или часа, но лучшие результаты достигаются при разведении жидкости двадцатью объемами воды и окрашивании в течение всей ночи. Срезы следует промыть в воде, затем быстро провести через абсолютный спирт и ксилол и заключить в канадский бальзам.

ГЛАВА VI.

Специальные методы окрашивания. — Специальные методы окрашивания нервных центров.

1. Для окрашивания нервных волокон.

Три метода (два из которых являются модификациями первого) используются гораздо чаще всех остальных. С помощью этих методов окрашивается миелиновая оболочка. Ткани должны быть предварительно зафиксированы в течение многих недель в жидкости Мюллера или другом растворе бихромата. Затем их перекрашивают в растворе гематоксилина, а срез обрабатывают подходящим обесцвечивающим реагентом, после чего цвет вымывается из всех элементов ткани, кроме нервных волокон. Этот метод позволяет выявить не только нервные волокна в белом веществе, но и тонкую сеть в сером веществе головного и спинного мозга. Дегенерировавшие волокна остаются неокрашенными, поэтому дегенерировавшие тракты выглядят как неокрашенные пятна на темном фоне. Впоследствии срезы можно окрасить квасцовым кармином или эозином для выявления клеток и нейроглии.

Метод Вейгерта. — Кусочек спинного мозга, предназначенный для нарезки после длительной фиксации в жидкости Мюллера, переносят без промывки в абсолютный спирт и обезвоживают перед заливкой в целлоидин (стр. 30). После нарезки срезы сразу переносят в гематоксилиновый раствор Вейгерта:

Hæmatoxyline | 1 | 4 | grains.
Alcohol | 10 |  45 | minims.
Distilled water |  100 | 1 | ounce.

Их окрашивают в нем в течение двадцати четырех часов или дольше, пока они не станут совершенно черными.

Окрашивание происходит гораздо быстрее, если жидкость держать при температуре 100° F в термостате. После окрашивания их переносят в дифференцирующий раствор Вейгерта:

Borax | 2 | 160 | grs.
Potassium ferricyanide | 2·5 |  200 | grs.
Distilled water |  100 | 1 | pint.

Их оставляют в этом растворе на несколько часов, пока основной фон не станет почти обесцвеченным.

Иногда срезы окрашиваются более удовлетворительно, если их обработать, согласно первоначальным указаниям Вейгерта, в течение нескольких часов полунасыщенным раствором ацетата меди. Если фиксация в жидкости Мюллера была достаточно длительной, этот этап обычно излишен.

Модификация метода Вейгерта по Палю. — Этот метод позволяет получить более быстрое и полное обесцвечивание нейроглии, нервных клеток и т. д. Срезы готовят точно так же, как в методе Вейгерта, а затем переносят в гематоксилин Вейгерта. Паль рекомендует разбавлять этот раствор вдвое и добавлять несколько капель насыщенного раствора карбоната лития. Автор находит результаты одинаково хорошими и при использовании обычного раствора Вейгерта.

Когда срезы будут тщательно окрашены, их промывают в дистиллированной воде и помещают в трехчетвертьпроцентный раствор перманганата калия. Время, необходимое в этом растворе, зависит от того, сколько времени препарат находился в жидкости Мюллера. Оно должно составлять не менее полуминуты, а для очень хорошо зафиксированных препаратов можно с пользой увеличить его до пяти минут. В этом растворе срезы приобретают непрозрачный коричневый цвет. Их промывают в дистиллированной воде и переносят в:

Дифференцирующий раствор Паля.

Potassium sulphite | 1 | grm. | 40 | gr.
Oxalic acid | 1 | grm. |  40 | gr.
Distilled water |  200 | cc. | 1 | pint.

Их держат в нем от одной до пяти минут, в зависимости от интенсивности окрашивания, пока белое и серое вещество не станут четко определенными, а коричневый цвет полностью не исчезнет. Если коричневый краситель не удаляется легко, срез следует вернуть в раствор перманганата примерно на полминуты и снова обработать «раствором Паля». Этот маневр можно повторить несколько раз. Как только срезы будут полностью дифференцированы, их переносят по одному в большой сосуд с водой и тщательно промывают. Синий цвет гематоксилина становится ярче в процессе промывки. Срезы можно заключать сразу, но более красивые результаты будут получены, если их окрасить квасцовым кармином в течение 24 часов. Затем их следует промыть, обезвожить в спирте, просветлить в бергамотовом масле и заключить в канадский бальзам.

Очень длительная фиксация в жидкости Мюллера, которая является необходимым предварительным условием для этого метода, привела к появлению:

Модификации метода Паля по Шеферу. — В этом методе достаточно фиксации в жидкости Мюллера в течение трех или четырех недель. Срезы изготавливают точно так же, как в предыдущем методе, и переносят в жидкость Марки (стр. 24) на шесть часов. Их промывают и окрашивают всю ночь в следующем растворе:

Hæmatoxylin | 1 | 4 | grs.
Alcohol | 10 |  45 | min.
Acetic acid (2 per cent. aqueous solution) |  100 | 1 | oz.

Последующие процессы дифференцировки, обесцвечивания и т. д. точно такие же, как в методе Паля.

Осмия кислота. — Используется как со свежими, так и с зафиксированными препаратами для демонстрации медуллярной оболочки. Гораздо лучшие результаты получаются с первыми. Нервы или небольшие кусочки центральной нервной системы помещают в полупроцентный или однопроцентный раствор осмиевой кислоты как можно скорее после смерти и держат в темноте около недели. Ткань необходимо очень тщательно промыть в проточной воде, чтобы удалить все следы осмиевой кислоты, а затем окрасить в течение пары дней в бура-кармине для демонстрации ядер и осевых цилиндров. Срезы можно изготавливать в гуммиарабике или ткань можно расщеплять иглами, а затем заключать в среду Фарранта. Заливка в целлоидин и заключение в бальзам не рекомендуются, так как эфир имеет тенденцию растворять миелин, а просветляющее масло делает его слишком прозрачным.

2. Внутримышечные разветвления нервов:

Хлораль-гематоксилиновый метод Зилера. — Этот метод выявляет внутримышечные нервные окончания, а также подчеркивает любопытные «мышечные веретена», которые, как показал Шеррингтон, связаны с задними нервными корешками и которые, по мнению некоторых, являются конечными органами, обеспечивающими мышечное чувство.

Кусочек мышцы берут как можно скорее после смерти или от ампутированной конечности и нарезают на замораживающем микротоме ломтиками толщиной около одной десятой дюйма. Перенесите на двадцать четыре часа в следующий раствор:

Acetic acid | 1 | part.
Glycerine | 1 |   "
One per cent. aqueous solution of chloral hydrate |  6 | parts.

Ткани набухают в этой жидкости и становятся полупрозрачными и студенистыми на вид. Теперь их помещают в чистый глицерин до насыщения, о чем свидетельствует их погружение на дно сосуда. Обычно это занимает несколько дней. Теперь их можно окрасить в следующем растворе:

Ehrlich’s hæmatoxyline (p. 70) | 1 | part.
Glycerine | 1 |   "
One per cent. aqueous solution of chloral hydrate |  6 | parts.

Их можно оставить в нем на срок от трех дней до недели, почти не опасаясь перекрашивания. Затем кусочки можно расщепить иглами и заключить в глицерин, либо окрашенную ткань можно спрессовать в достаточно тонкий слой, сильно сдавив ее между двумя предметными стеклами.

Двигательные и чувствительные нервные окончания. — Их лучше всего окрашивать методом хлорида золота (стр. 82).

Препараты должны быть взяты из организма сразу после смерти. Поэтому метод бесполезен для секционного зала, но может быть использован для тканей, удаленных при операции. Необходимо использовать небольшие кусочки ткани, которые должны быть окрашены целиком, а срезы изготовлены впоследствии.

Для двигательных нервных окончаний можно взять мышцу лягушки или мышцу человека из только что ампутированной конечности. Препараты после окрашивания следует готовить путем расщепления, а не изготовления срезов. Заключайте в среду Фарранта.

Чувствительные нервные окончания удобно изучать на роговице недавно убитой лягушки или кролика, либо на свежеудаленном глазу человека. Осязательные конечные органы можно изучать на губах или кончиках пальцев, вкусовые почки — в листовидных сосочках языка кролика, а тельца Пачини хорошо видны в брыжейке худой кошки.

3. Окрашивание нервных клеток.

Метод анилинового сине-черного красителя Бевана Льюиса: — Этот метод является лучшим для демонстрации богатства нервных клеток в свежей коре головного мозга. Раствор анилинового сине-черного красителя должен иметь концентрацию 1 к 400, около грана на унцию. Кусочек коры головного мозга с прикрепленной мягкой мозговой оболочкой следует извлечь как можно скорее после смерти параллельными разрезами на расстоянии около 1/8 дюйма друг от друга, перпендикулярно поверхности извилины, поместить на пластину замораживающего микротома и слегка заморозить — не слишком сильно, иначе ткань станет хрупкой и повредит лезвие бритвы. Как только получен хороший срез, бритву следует погрузить в большую чашу с холодной водой, чтобы отделить срез, который сразу же переносят на предметное стекло, и поливают из пипетки раствором осмиевой кислоты (1/4 процента). Это зафиксирует элементы ткани примерно за две минуты. Срез снова переносят в чашу с водой и тщательно промывают, чтобы очистить от осмиевой кислоты. Затем его окрашивают либо на предметном стекле, либо в часовом стекле раствором анилинового сине-черного красителя в течение часа в холоде или полчаса, если раствор слегка подогрет. Краситель тщательно вымывают дистиллированной водой, излишек влаги удаляют с предметного стекла фильтровальной бумагой, а срез оставляют сохнуть под стеклянным колпаком. Обезвоживание с помощью спирта нецелесообразно, так как это вызовет внезапное сморщивание тканей. Когда срез высохнет, наносят каплю канадского бальзама и накрывают покровным стеклом обычным способом. Нервные клетки и их отростки окрашиваются в глубокий грифельный цвет, как и ядра клеток соединительной ткани, в то время как основной фон нейроглии окрашивается слабо и имеет нейтральный серый оттенок. Этот метод дает прекрасные результаты как с нормальными, так и с патологическими препаратами.

Различные другие анилиновые красители, индулин, метиленовый синий, генцианвиолет, использовались таким же образом, но ни один из них не дает таких хороших или стабильных результатов, как анилиновый сине-черный.

Зафиксированные препараты также можно окрашивать анилиновым сине-черным, но результаты не идут ни в какое сравнение с теми, что получены методом на свежем материале. Окрашивание обычно диффузное, но его можно улучшить, поместив срезы на 1/2–2 минуты в 2-процентный раствор хлоралгидрата на дистиллированной воде после окрашивания.

Металлические красители Гольджи для нервных клеток.

Гольджи ввел методы создания металлического осадка ртути или серебра в нервной клетке, выявляя как саму клетку, так и ее отростки. Этот метод был очень плодотворным для открытий, особенно в руках Рамон-и-Кахаля, Кёлликера, Ван Гехуктена и других. Лучшие результаты он дает с эмбриональными тканями. Для обеспечения хороших результатов важно, чтобы ткань была извлечена сразу после смерти. Срезы мозга, извлеченного через несколько часов после смерти, обычно дают разочаровывающие результаты.

Сейчас существует несколько методов, все они являются небольшими модификациями оригинальных методов Гольджи.

Метод нитрата серебра. — Небольшие кусочки размером не более четверти дюйма переносят прямо из организма в большое количество жидкости Марки (стр. 24) и держат в ней около недели или дольше в случае взрослых препаратов. После извлечения из раствора Марки ткань следует промыть в течение нескольких секунд в дистиллированной воде, а затем поместить в большое количество 3/4-процентного раствора нитрата серебра на дистиллированной воде по крайней мере на неделю. Кусочек ткани приобретает кирпично-красный цвет из-за покрытия хроматом серебра. После извлечения из раствора серебра ткань следует промыть в метилированном спирте в течение нескольких минут, а корку хромата серебра счистить. Срезы можно нарезать в гуммиарабике и целлоидине; или их можно закрепить на пробке с помощью целлоидина или спиртового лака и нарезать без заливки: очень тонкие срезы не требуются. Обезвоживайте в спирте, просветляйте в ксилоле и заключайте в бальзам. Гудолл советует смесь пиридина и ксилола для просветления и заключает в крепкий ксилол-даммарный раствор без покровного стекла.

Требуется очень внимательное отношение к деталям и большая практика, прежде чем можно будет получить стабильно хорошие результаты. Результаты чрезвычайно красивы и вполне оправдывают затраченный на них труд. Клетки и их отростки выглядят черными на желтоватом фоне.

Использовался метод для углубления цвета окрашивания, но автор не имеет опыта его применения. Каллус (Zeitsch. f. Wiss. Mikr., 1893, 477) разбавляет обычный гидрохиноновый проявитель (приготовленный как для проявления обычной фотопластинки) примерно десятикратным объемом дистиллированной воды. Непосредственно перед использованием добавляется третья часть абсолютного спирта. Срезы, прошедшие процесс серебрения, при помещении в него становятся серыми или черными через несколько минут, а после промывки в метилированном спирте их переносят в 20-процентный водный раствор гипосульфита натрия на пару минут, а затем очень тщательно промывают в дистиллированной воде в течение двадцати четырех часов. Затем их обезвоживают и заключают в бальзам.

Модификация серебряного метода по Бакли. — Описана в Brain, зимний выпуск, 1895 г.

Метод применим к препаратам, которые были зафиксированы в жидкости Мюллера. Тонкие ломтики нарезают обычным способом, а затем погружают в

Bichromate of potassium, 3 per cent. solution |  5 | parts
Osmic acid, 1 per cent. solution | 1 | part

на три-пять дней. Излишек бихромата удаляют со срезов фильтровальной бумагой, и их переносят в свежеприготовленную окрашивающую смесь:

Phospho-molybdic acid (10 per cent.) | 1 | minim | 2 | drops.
Nitrate of silver (1 per cent.) |  1 | ounce |  60 | c.c.

которую нельзя фильтровать. Окрашивайте несколько дней.

Срезы следует нарезать сразу после извлечения из окрашивающего раствора. Утверждается, что мельчайшие детали структуры клеточных отростков лучше видны при этом методе.

Метод сулемы. — Этот метод по своему действию похож на предыдущий, при этом в клетке вместо серебра осаждается ртуть. Он несколько менее надежен и требует больше практики. Он редко окрашивает равномерно. Одна клетка может оказаться прекрасно окрашенной, в то время как соседние останутся незатронутыми.

Небольшие кусочки коры фиксируют в течение нескольких недель в жидкости Мюллера или другом растворе бихромата, а затем переносят прямо в полупроцентный водный раствор сулемы, в котором их следует оставить на срок от трех до шести недель. Более короткие периоды дадут лишь разочаровывающие и непостоянные результаты. Срезы следует нарезать, если возможно, в гуммиарабике. Их можно заключать в среду Фарранта или обезвоживать и заключать в бальзам. Таль предложил сделать эффект более резким, превращая осадок ртути в сульфид ртути путем обработки срезов раствором сульфида натрия, который он готовит путем насыщения десятипроцентного раствора каустической соды сероводородом с последующим добавлением равного количества свежего раствора соды. Их окрашивают в нем несколько минут, а затем тщательно промывают.

При этом методе пирамидальные клетки и их тонкие отростки выглядят как черные непрозрачные объекты на светлом фоне. Клетки нейроглии с их тонкими нежными отростками также часто бывают красиво окрашены.

Анилиновый метод Ниссля. — Этот метод дополняет метод Гольджи. Последний пропитывает клетку, делая ее непрозрачной и показывая ее форму с большой определенностью.

Метод Ниссля окрашивает протоплазму, не сильно снижая ее прозрачность, и позволяет нам изучать детали клеточной структуры. Небольшие кусочки ткани, извлеченные как можно скорее после смерти, фиксируют в спирте. Затем нарезают срезы, предпочтительно в гуммиарабике, так как целлоидин неудобен из-за того, что слишком сильно окрашивается анилиновыми красителями.

Срезы переносят из спирта в полупроцентный водный раствор метиленового синего, который нагревают в часовом стекле до появления пара, но не доводя до кипения. Окрашивайте около четверти часа и дайте остыть. Перенесите срезы в смесь, содержащую одну часть анилинового масла и десять частей абсолютного спирта, и перемещайте их, пока краситель не перестанет вымываться. Перенесите срез на предметное стекло с помощью подъемника для срезов, слейте жидкость и хорошо высушите, осторожно прижимая сложенную фильтровальную бумагу к срезу. Дайте душицевому маслу стечь по срезу и удалите его излишки, прижимая фильтровальную бумагу. Увлажните бензином и добавьте каплю канифольной смолы, растворенной в бензине. Предметное стекло осторожно подогревают, пока бензин не испарится, а канифоль не разжижится только под действием тепла, после чего накладывают покровное стекло.

Маджента и другие анилиновые красители также могут быть использованы аналогичным образом.

ГЛАВА VII.

Специальные методы окрашивания микроорганизмов и крови.

В рамках данной работы невозможно предпринять сколько-нибудь адекватное описание современных методов бактериологического исследования. Некоторые из них очень длительны и сложны и требуют большого мастерства и практики, прежде чем можно будет рассчитывать на хорошие результаты. Но тем, кто не желает специально изучать бактериологию, часто может потребоваться исследовать наличие организмов в срезах или в различных выделениях, и есть надежда, что они найдут следующее краткое описание специальных методов достаточным для своих целей. Для более тщательной работы им следует обратиться к одному из многих отличных учебников по этому предмету.

Студент должен обеспечить себя следующими красителями в порошке:

Метиленовый синий.

Генцианвиолет.

Метиловый фиолетовый.

Фуксин.

Бисмарк коричневый.

Используются следующие растворы этих красителей:

1. Насыщенные спиртовые растворы, которые можно хранить в склянках с притертыми пробками.

2. Однопроцентные водные растворы. Их необходимо готовить свежими каждый раз перед использованием.

При фильтровании спиртовых или водных растворов полезно предварительно смочить фильтровальную бумагу спиртом или водой, в зависимости от случая.

Также потребуются следующие специальные растворы:

Метиленовый синий Леффлера. — В этом растворе в качестве протравы используется слабый раствор каустической поташи:

Saturated alcoholic solution of methylene blue | 3 | volumes.
Caustic potash, aqueous solution 1 : 10,000 |  10 | volumes.

Отфильтруйте.

Этот раствор, пожалуй, является наиболее универсально полезным красителем. Он окрашивает большинство бацилл и микрококков, и, будучи быстрым в действии, редко перекрашивает. Его необходимо готовить свежим каждый раз. Это лучший контрастный краситель после окрашивания бацилл туберкулеза и т. д. фуксином.

Карбол-фуксин Циля.

Carbolic acid (5 per cent. aqueous solution) |  100 | volumes.
Fuchsine (saturated alcoholic solution) | 11 | volumes.

Раствор необходимо фильтровать непосредственно перед использованием.

Йодный раствор Грама. — Срезы помещают в этот раствор после окрашивания анилиновыми красителями. Йод в некотором роде фиксирует краситель в организмах, так что они не обесцвечиваются вместе с остальными тканями.

Его готовят так:

Iodine | 1 | grm. |  1 1/2 | grains.
Iodide of potassium | 2 | grms. | 3 | grains.
Distilled water |  300 | c.c. | 1 | ounce.

Следует приготовить десятипроцентные водные растворы азотной и серной кислот, которые могут храниться неопределенно долго.

Ниже приведены общие методы использования этих реагентов для окрашивания организмов в срезах. Для специальных организмов требуются специальные методы, но можно привести лишь один или два.

Метод Вейгерта. — Срезы необходимо поместить в свежеприготовленный однопроцентный водный раствор метилового фиолетового, генцианвиолета, фуксина и т. д. Раствор можно держать при температуре тела в термостате. Организмы часто окрашиваются легче, если срез провести через раствор сулемы 1 к 2000 перед помещением в окрашивающую жидкость. После окрашивания срез промывают в дистиллированной воде, а затем в метилированном спирте, пока он не станет почти обесцвеченным. Некоторые предпочитают обесцвечивать ткани промыванием в полупроцентном растворе уксусной кислоты вместо метилированного спирта. Требуется практика, прежде чем можно будет точно оценить правильное время для обесцвечивания. Новичку следует время от времени быстро переносить срез на предметное стекло, накладывать покровное стекло и рассматривать его под малым увеличением, чтобы увидеть, достаточно ли далеко зашло обесцвечивание. Затем можно использовать контрастный краситель, такой как пикрокармин, после чего срез можно заключить в среду Фарранта: или можно использовать слабый раствор другого анилинового красителя в качестве контрастного, после чего срез просветляют в ксилоле и заключают в бальзам, растворенный в ксилоле.

Метод Грама. — Налейте немного анилинового масла в пробирку и добавьте десятикратный объем дистиллированной воды. Закройте конец большим пальцем и очень тщательно встряхните. Отфильтруйте девяносто капель в другую чистую пробирку и добавьте десять капель насыщенного раствора генцианвиолета или какого-либо аналогичного красителя. Отфильтруйте смесь в часовое стекло. Окрашивайте срезы в нем от трех минут до получаса в зависимости от температуры — меньшее время для термостата при 100°, большее, когда срезы окрашиваются при обычной комнатной температуре. Промойте в дистиллированной воде и перенесите в йодный раствор Грама, пока они не станут черными, обычно через несколько минут. Затем их обесцвечивают в абсолютном спирте. Это часто занимает некоторое время. Его можно ускорить, как предлагает Крукшенк, поместив срез в гвоздичное масло, вернув в спирт и так далее.

Модификация метода Грама по Эрлиху. Здесь контрастный краситель используется первым.

Окрасьте срез (например, митрального клапана при язвенном эндокардите) в спиртовом растворе эозина (1 к 1500). Перенесите в раствор какого-либо анилинового красителя, такого как генцианвиолет, растворенный в анилиново-масляной воде, точно так же, как в методе Грама. Срез плавает на поверхности и расправляется из-за диффузии спирта. Окрашивайте около двадцати минут. Промойте срез в воде и перенесите (стр. 55) на предметное стекло. Дайте воде стечь и медленно добавьте йод Грама из пипетки, чтобы не нарушить срез. Когда срез станет совершенно черным, слейте раствор Грама. Удалите всю лишнюю жидкость с предметного стекла фильтровальной бумагой и высушите срез, осторожно и сильно прижимая к нему сложенный кусочек фильтровальной бумаги. Если это делать осторожно, срез не будет поврежден ни в малейшей степени. Обесцвечивание осуществляется на предметном стекле анилиновым маслом, а не спиртом, как в предыдущем методе. Предметное стекло покачивают, чтобы цвет равномерно вымывался анилином. Когда краситель перестанет выходить, анилиновое масло сливают, срез просветляют в ксилоле и заключают в канадский бальзам.

Как только срез обесцвечен, его можно обработать контрастным красителем, наиболее подходящими из которых являются спиртовые растворы эозина или Бисмарк коричневого, если использовался синий краситель, или метиленовый синий, если первым использовался фуксин.

Ниже приведены наиболее полезные красители и контрастные красители:

Stains. |  Contrast Stains.

Gentian violet.
Methyl violet.
Methylene blue.

Picrocarmine.
Eosine.
Bismarck brown.
Safranine.

Magenta. Fuchsine. | [picture] |  | Methylene blue.

And vice versâ.

Требуется большая практика в использовании любого из этих методов, прежде чем можно будет точно судить, как долго оставлять срезы в окрашивающих или обесцвечивающих реагентах, и новичок не должен расстраиваться, если поначалу он не может получить хорошие результаты, хотя и следует указаниям книги самым тщательным образом.

Метод Эрлиха для бацилл туберкулеза. — Срезы окрашивают в течение шести-двадцати четырех часов в однопроцентном растворе генцианвиолета, метилового фиолетового, метилового синего или фуксина. Они окрасятся быстрее, если окрашивающую жидкость держать в термостате при температуре тела. Их следует извлечь из окрашивающей жидкости, промыть в дистиллированной воде, а затем перенести (предпочтительно на подъемнике для срезов) в десятипроцентный раствор азотной кислоты на дистиллированной воде, пока они почти не обесцветятся. Затем их следует очень тщательно промыть в дистиллированной воде. После этого их можно обработать подходящим контрастным красителем и заключить в канадский бальзам.

Краситель Нильсена для бацилл туберкулеза. — Срезы помещают в раствор карбол-фуксина Циля (стр. 103), который следует подогревать от десяти минут до получаса. Затем их обесцвечивают в растворе серной кислоты. Двадцатипятипроцентный раствор — это концентрация, рекомендованная изначально, но десятипроцентный раствор действует так же хорошо и меньше повреждает срез. Затем их очень тщательно промывают в большом количестве воды, а после этого могут быть обработаны контрастным красителем.

Двойной краситель Гиббса для бацилл туберкулеза. —

(1) | Rosaniline hydrochlorate |  2 | grms. |  25 | grs.
| Methyl blue | 1 | grm. | 12·5 | grs.

Разотрите в стеклянной ступке,

(2) | Aniline oil | 3 | c.c. |  37·5 | grs.
| Rectified spirit |  15 | c.c. | 3 1/2 | drms.

Растворите и медленно добавьте к (1).

(3) | Lastly add slowly to the mixture
| Distilled water |  15 | c.c. |  3 1/2 | drms.

Часть раствора отфильтровывают в часовое стекло и подогревают. Срезы помещают в него и оставляют на несколько часов. Затем их промывают в метилированном спирте, пока они не будут достаточно обесцвечены, а затем быстро проводят через абсолютный спирт и гвоздичное масло и заключают в бальзам и ксилол. Это очень полезный краситель для исследования мокроты на бациллы туберкулеза.

Для окрашивания жидкостей, таких как кровь, гной или мокрота, на наличие организмов следует получить очень тонкий слой, поместив немного жидкости между двумя чистыми покровными стеклами и прижав их друг к другу. Затем их разделяют и дают высохнуть. Пленку фиксируют, удерживая покровное стекло пинцетом и медленно проводя его через пламя спиртовки два или три раза. Пленки гноя после фиксации следует «просветлить», поместив их в двадцатипроцентный раствор уксусной кислоты на три минуты.

Для клинических целей часто необходимо исследовать мочу, кал или рвотные массы на наличие бацилл. Пленки готовят обычным способом и дают медленно испариться, затем фиксируют, проводя через пламя, и перед окрашиванием промывают в дистиллированной воде. В случае рвотных масс и кала это обычно делается без труда. Однако в случае мочи часто бывает трудно добиться полного испарения. Остается сиропообразный слой, и если применить больше тепла, он разлагается и обугливается, а продукты вызывают осаждение анилина во время последующих процессов окрашивания. Этого можно частично избежать, осторожно промыв пленку в дистиллированной воде перед окрашиванием.

Другой план состоит в том, чтобы смешать мочевой осадок с небольшим количеством желатина, свободного от организмов, например, такого, как в неиспользованных культуральных пробирках. Желатин разжижают нагреванием и смешивают с осадком. Из этой смеси делают пленки, дают им застыть, а затем тщательно промывают в дистиллированной воде. Затем пленку тщательно высушивают, покровное стекло кладут плашмя пленкой вверх и фильтруют на него несколько капель окрашивающей жидкости. После того как она достаточно окрасится, краситель сливают, а стекло осторожно промывают. Затем пленку можно окрасить контрастным красителем точно так же, как срезы, снова промыть, высушить между слоями фильтровальной бумаги и заключить в бальзам.

Иногда трудно определить, на какой стороне покровного стекла находится пленка. Это легко сделать, удерживая стекло под углом так, чтобы свет из окна отражался от его поверхности. Сторона, покрытая пленкой, кажется тусклой, в то время как другая — гладкой и блестящей.

Методы исследования крови.

Во всех этих методах кровь получают путем укола кожи одного из пальцев или мочки уха, предпочтительно последней. Кожу предварительно необходимо промыть водой с мылом или эфиром, чтобы удалить жир или эпителиальные чешуйки. Прокол следует делать твердо, чтобы кровь могла свободно вытекать. Палец или ухо нельзя сжимать. Препараты должны быть сделаны быстро, прежде чем красные кровяные тельца соберутся в «монетные столбики». Используемые предметные и покровные стекла должны быть безупречно чистыми, иначе невозможно получить действительно хорошие пленки. Их следует очищать азотной кислотой и спиртом в соответствии с указаниями на странице 57.

Следует исследовать свежие препараты. Покровное стекло подводят так, чтобы оно лишь коснулось капли крови одним краем, чтобы перенести лишь небольшое количество, и сразу же опускают на предметное стекло с помощью препаровальной иглы. Если предметное и покровное стекла идеально чисты, кровь растечется в тонкую пленку, а тельца будут лежать совершенно плоско. Если будет какая-либо задержка или если покровное стекло будет не совсем чистым, красные тельца соберутся в массы, и препарат будет бесполезен для детального исследования. Другой препарат можно смешать с небольшим количеством раствора Феррье (стр. 129) перед заключением. Также можно приготовить постоянные пленки на покровных стеклах.

Здесь опять же необходимо использование абсолютно чистых покровных стекол, и кровь должна быть взята сразу же, как только она выйдет из прокола. Немного крови берут на покровное стекло, которое держат горизонтально. Другое покровное стекло опускают на него, и под действием собственного веса и капиллярного притяжения капля крови быстро превращается в тонкую пленку. Два покровных стекла разделяют, как только пленка сформировалась, быстро сдвигая их друг с друга. Этот маневр требует некоторой практики и ловкости. Движение стекол должно быть в строго параллельном направлении, иначе покрытие будет неравномерным, точно так же, как когда разрывают два куска хлеба с маслом. Даже с практикой трудно получить более одной хорошей пленки, нижняя обычно лучше. Существует четыре способа фиксации пленки.

1. Воздействие пара осмиевой кислоты.

Пленку, пока она еще влажная, держат над горлышком бутылки, содержащей по крайней мере однопроцентный раствор осмиевой кислоты. Через минуту или две фиксация будет завершена, и пленка приобретет грязно-коричневый цвет. Затем ее оставляют на воздухе, чтобы избавиться от всех следов осмиевой кислоты, и впоследствии можно окрасить, как описано ниже.

2. Обработка насыщенным водным раствором сулемы (метод Мьюира).

Покровное стекло, на которое была нанесена пленка, плавают, пока она не успела высохнуть, пленкой вниз на насыщенном растворе сулемы в часовом стекле в течение получаса. Покровное стекло помещают в дистиллированную воду, а затем в спирт, чтобы удалить излишки сулемы, после чего окрашивают. При промывке пленки требуется некоторая осторожность, чтобы она не соскользнула с покровного стекла целиком.

3. Путем высушивания и быстрого проведения через пламя горелки Бунзена, точно так же, как при подготовке препаратов мокроты и т. д. (стр. 111). Этот метод удобен для обычных клинических целей.

4. Путем выдерживания покровных стекол при температуре около 200° F (метод Эрлиха).

Эрлих использует для этой цели полоску меди шириной около двух дюймов и длиной в фут, которая поддерживается на штативе в горизонтальном положении. Один конец нагревается горелкой Бунзена снизу. Точка на медной полоске, в которой температура достигает точки кипения, легко определяется путем падения на нее небольшого количества воды. Точка, в которой капля воды принимает сферическое состояние, указывает на температуру в 212° F. Покровные стекла помещают на дюйм или два дальше этой точки и держат там при температуре около 200° F в течение нескольких часов.

Методы окрашивания.

Свежую кровь можно окрасить, смешав с раствором фуксина Феррье:

Fuchsine | 1 | grm.
Distilled water |  150 | c.c.

Растворите и добавьте

Alcohol (80 per cent.) | 50 | c.c.
Neutral glycerine |  200 | c.c.

Каплю этого раствора смешивают с кровью на предметном стекле с помощью препаровальной иглы и накрывают чистым покровным стеклом. Красные кровяные тельца слегка окрашиваются, в то время как ядра белых кровяных телец окрашиваются в ярко-малиновый цвет, а «кровяные пластинки» — в глубокий розовый цвет.

Окрашенные препараты также можно получить с помощью жидкости Туазона, которая также служит для разведения крови с целью определения точного количества красных и белых кровяных телец с помощью гемоцитометра Говерса или Тома-Цейса. Ее готовят так:

Glycerine | 30 | c.c. | 1 | oz.
Sodium sulphate | 8 | grms. | 2 | drms.
Sodium chloride | 1 | grm. |  15 | grs.
Methyl violet | ·25 | grm. | 4 | grs.
Distilled water |  160 | c.c. | 5 | oz.

Она окрашивает ядра и кровяные пластинки, но не изменяет форму красных клеток. Ее необходимо время от времени готовить свежей, так как в ней склонны образовываться и размножаться торулы.

Высушенные пленки можно окрашивать гематоксилином, пикрокармином или любыми общими красителями. Ядра лейкоцитов можно быстро окрасить за пару минут в однопроцентном растворе метилового фиолетового, промыв в воде, высушив между листами фильтровальной бумаги и заключив в бальзам. Лучший метод для общих целей — окрашивание насыщенным водным раствором метилового синего в течение получаса или дольше. Промойте в воде, а затем окрашивайте в течение десяти минут в полунасыщенном водном растворе эозина. Таким образом, эозинофильные гранулы лейкоцитов и красные кровяные тельца окрашиваются эозином, в то время как ядра лейкоцитов окрашиваются метиловым синим.

Кантхак и Дрисдейл рекомендуют сначала окрасить пленку полупроцентным раствором эозина в 50-процентном спирте, затем промыть, высушить и зафиксировать в пламени, а затем окрасить в течение короткого времени раствором метиленового синего Леффлера (стр. 104).

Эти пленки можно окрашивать на микроорганизмы способом, описанным для препаратов на покровных стеклах (стр. 112).

ГЛАВА VIII.

Инъекция кровеносных сосудов.

Инъекцию кровеносных сосудов можно проводить на мелких животных или на отдельных органах человека после их извлечения из организма. Цель состоит в том, чтобы заполнить сосуды окрашенной жидкостью, которая впоследствии затвердеет. В одном и том же органе можно инъецировать артерии красной средой, вены — синей, а секреторные протоки, такие как желчные протоки, — желтой или синей.

Наиболее удобной основой для инъекционной массы является желатин, так как его растворы разжижаются при температуре около 100° F и затвердевают чуть ниже этой точки, а после затвердевания легко режутся и не имеют тенденции становиться хрупкими. Различные массы готовят следующим образом:

Красная инъекционная масса (формула Вудхеда) состоит из желатина, размягченного путем смешивания с водой и окрашенного кармином.

(1) | Carmine | 4 | grms.
| Liq. ammoniæ B.P. | 8 | grms.
| Distilled water |  150 | c.c.

Растворите кармин в аммиаке в ступке. Влейте воду. Тщательно перемешайте и отфильтруйте.

(2) | Gelatine | 10 | grms.
| Distilled water |  50 | c.c.

Дайте постоять в холодной воде, пока вода не впитается и желатин не станет мягким.

Нагрейте (1) почти до точки кипения над горелкой Бунзена и медленно добавьте желатин. Тщательно перемешайте и добавьте десятипроцентный раствор уксусной кислоты, пока раствор не станет слегка кислым. Это будет видно по тому, что масса приобретет более темный и тусклый цвет. Можно добавить немного салициловой кислоты для консервации.

Синяя инъекционная масса. — К желатиновой массе (2), приготовленной как указано выше и разжиженной нагреванием, добавьте вместо кармина

Soluble Prussian blue | 5 | grms.
Distilled water |  60 | c.c.

Любые следы щелочи должны быть удалены от массы во время и после приготовления. Срезы инъецированных органов следует заключать в среду Фарранта, слегка подкисленную муравьиной или уксусной кислотой. Однако, несмотря на всю осторожность, синий цвет имеет тенденцию со временем выцветать.

Зеленая инъекционная масса. Формула Робина (модифицированная).

(1) | Arseniate of soda (sat. sol.) |  80 | c.c.
| Glycerine | 50 |  "
(2) | Sulphate of copper (sat. sol.) | 40 |  "
| Glycerine | 50 |  "

Смешайте и добавьте одну часть к трем частям желатиновой массы, приготовленной как для красных и синих инъекций.

Метод инъекции. — При инъекции сосудов тканей необходимо, чтобы орган или все животное, в зависимости от случая, во время инъекции поддерживались при температуре значительно выше той, при которой желатиновая масса расплавится, иначе желатин «застынет» в артериях и никогда не достигнет капилляров. Это нагревание осуществляется путем погружения животного в водяную баню. Разжиженный желатин нагнетается в артерию с помощью шприца или под давлением воздуха. Важно, чтобы давление было равномерным и устойчивым. Это гораздо легче достигается при давлении воздуха, поэтому данный метод настоятельно рекомендуется новичку. Но какой бы метод ни был принят, идеальные результаты могут быть получены с уверенностью только после долгой практики. Иногда применяется слишком высокое давление, и сосуды лопаются, в других случаях инъекция может вообще не достичь капилляров. Самое тщательное внимание к деталям является обязательным.

Безусловно, самым эффективным аппаратом для инъекций является модификация аппарата постоянного давления Людвига, разработанная Фернли. Хотя аппарат кажется сложным, его различные части легко приобрести, а водяную баню можно без труда заменить импровизированным устройством.

Аппарат, показанный на рисунках 10 и 11, состоит из бани, достаточно глубокой, чтобы вместить животное, и сосуда с инъекционной жидкостью. Баня поддерживается при температуре около 110° с помощью обычной горелки Бунзена. Большая трехгорлая склянка Вульфа (емкостью 20–40 унций) снабжена тремя резиновыми пробками, через которые проходят стеклянные трубки. Через центральную пробку почти до дна склянки проходит стеклянная трубка, соединенная резиновым шлангом с обычным шприцем Хиггинсона. Из одного из других горлышек резиновая трубка идет к обычному ртутному манометру, а из третьего — трубка к колбе с разжиженной инъекционной массой, погруженной в водяную баню. Эта колба также плотно закрыта пробкой и должна быть заполнена инъекционным материалом примерно наполовину. Подающая трубка из большой склянки Вульфа должна лишь слегка выступать через пробку. Другая стеклянная трубка проходит почти до дна колбы и соединяется резиновой трубкой с канюлей, вставленной в артерию. Из рисунка 11 очевидно, что при нагнетании воды шприцем Хиггинсона в склянку Вульфа давление в ней будет повышаться (как показывает манометр). Это повышение давления будет в равной степени воздействовать на воздух внутри склянки, содержащей инъекционную жидкость, и жидкость будет вытесняться по трубке через канюлю в артерию.

Fig. 10.—Fearnley’s arrangement for injecting blood vessels. (Reproduced by permission of Messrs. Macmillan, from Fearnley’s Practical Histology).

Fig. 11.—Scheme shewing distribution of pressure in Fearnley’s Injection Apparatus (from Fearnley’s Practical Histology).

Перед использованием аппарата на выходную трубку сосуда с инъекционной жидкостью следует наложить зажим и повысить давление, чтобы убедиться в герметичности всей системы. Любые утечки должны быть устранены до начала собственно инъекции.

Если необходимо инъецировать изолированный орган, сначала следует ввести в артерию стеклянную или латунную канюлю и надежно закрепить ее лигатурой. Органы, если они холодные, необходимо выдержать в воде при температуре 120° F в течение примерно получаса, а затем перенести в водяную баню.

При инъекции целого животного, такого как кролик, крыса или морская свинка, лучше всего проводить процедуру через несколько минут после смерти. Животное можно усыпить хлороформом, а затем обескровить, вскрыв крупную вену. Как только наступит смерть, сделайте разрез кожи над грудной клеткой по средней линии. Перережьте реберные хрящи справа от грудины, а также место соединения рукоятки и тела грудины. Поскольку эти разрезы проходят по большей части через неваскуляризированные участки, они не приведут к вытеканию жидкости во время инъекции. При насильственном отведении грудины влево обнажится перикард, который необходимо осторожно вскрыть. Необходимо сделать разрез в левом желудочке, ввести канюлю в аорту и прочно закрепить ее лигатурой, проведенной вокруг аорты с помощью пинцета или аневризматической иглы. Кровь удаляют, после чего животное помещают в водяную баню примерно на десять минут. Трубку от склянки с инъекционной жидкостью заполняют путем осторожного нажатия на шприц и зажимают, когда она наполнится. Затем ее конец надевают на канюлю и закрепляют лигатурой. Давление следует повышать, сжимая шприц, пока манометр не покажет один дюйм. После этого зажим следует снять и начать инъекцию. Давление нужно повышать очень осторожно и постоянно, работая шприцем, и наблюдать за состоянием десен, губ и глаз животного. Десны вскоре приобретут розовый оттенок. Лучшие показатели получают, наблюдая за состоянием мелких сосудов склеры. Когда они полностью заполнятся, что произойдет примерно через пять-десять минут в зависимости от скорости повышения давления воздуха, инъекцию можно прекратить. При благоприятных условиях этот результат будет достигнут до того, как манометр покажет давление в пять дюймов. Теперь аорту следует перевязать, а животное поместить в холодную воду, которую часто меняют, до полного охлаждения. Затем органы можно извлечь, поместить в метилированный спирт и подвергнуть фиксации. Впоследствии срезы нарезают и монтируют обычным способом.

ГЛАВА IX.

Указания по подготовке отдельных тканей.

Нормальная гистология. — Начинающему исследователю следует со всей серьезностью внушить, что тщательное освоение нормального вида тканей и органов абсолютно необходимо, прежде чем приступать к точному изучению патологических изменений в них. Ему не следует ограничиваться исследованием одного образца органа, а нужно изучить как можно больше, чтобы быть полностью знакомым со многими отклонениями от нормы, которые могут существовать без наличия заболевания. Поэтому ему следует приобрести несколько животных, таких как небольшие собаки, кошки, кролики, лягушки и т. д., и со всей осторожностью извлечь их органы, зафиксировав их в соответствующих жидкостях. Ему также следует получать образцы нормальных человеческих органов из секционного зала. Многие нормальные ткани (кожа, мышцы, сухожилия, кости и т. д.) также можно подготовить из конечности, ампутированной в результате несчастного случая у здорового пациента. Подготавливая препараты таким образом, он не только станет обладателем набора стекол, иллюстрирующих нормальную гистологию, но и обнаружит, что приобрел тот навык фиксации и окрашивания препаратов, который дает только практика.

Приведенное ниже описание метода подготовки различных тканей предназначено лишь для того, чтобы указать направления, по которым следует двигаться начинающему. После некоторой практики он вполне сможет выбирать способы фиксации и окрашивания, которые могут потребоваться в особых обстоятельствах или случаях.

Первая часть этих указаний будет касаться подготовки нормальных тканей, вторая часть — патологической гистологии.

Кровь. — Специальные методы исследования см. в главе VII.

Кристаллы крови — кристаллы гемоглобина, полученные из крови животного, или их можно собрать в достаточном количестве при любой операции. К крови добавляют немного воды или эфира, дают постоять полчаса, после чего каплю медленно выпаривают на чистом предметном стекле.

Кристаллы гематина. — Студент должен досконально ознакомиться с ними, так как их присутствие служит неопровержимым доказательством наличия красящего вещества крови в пятне.

Чтобы получить их, каплю крови следует высушить на предметном стекле. Высушенную кровь соскабливают в небольшую кучку с помощью кусочка чистого стекла и добавляют каплю ледяной уксусной кислоты. По мере испарения появятся крошечные красновато-коричневые игольчатые кристаллы.

Кристаллы гематоидина. — Получают из места ушиба или старого кровоизлияния, например, при мозговой апоплексии или гематоцеле.

Простой плоский эпителий. — (Эндотелий). Осторожно снимите выстилку париетального перикарда или париетальной плевры недавно убитого животного или расправьте его сальник на кусочке пробки и (1) окрасьте межклеточный цемент нитратом серебра (стр. 82), чтобы выявить контуры клеток. (2) Окрасьте другие препараты гематоксилином или квасцовым кармином для выявления ядер.

Многослойный плоский эпителий. — Следует подготовить образцы кожи различных частей тела: пальца, паха, губы, языка. Фиксировать в жидкости Мюллера.

Переходный эпителий. — Встречается в почечной лоханке, мочеточнике и мочевом пузыре. Он очень легко отслаивается, особенно если его не зафиксировать сразу после смерти. Извлекайте как можно быстрее. Если берется мочевой пузырь, его следует разрезать и расправить как можно ровнее. Фиксировать в осмиевой кислоте или жидкости Мюллера со спиртом. Заливать предпочтительно в целлоидин.

Простой цилиндрический эпителий. — Встречается во многих частях тела. Его можно изучать в слюнных протоках, кишечнике, почках и т. д. любого млекопитающего.

Бокаловидные клетки. — В изобилии встречаются среди цилиндрических клеток кишечных желез, а также в слизистых железах полости рта и шейки матки.

Многослойный цилиндрический эпителий. — Встречается только в уретре. Зафиксируйте пенис кошки в жидкости Мюллера и сделайте поперечные срезы.

Мерцательный эпителий. — Зафиксируйте трахею недавно убитой кошки в осмиевой кислоте или жидкости Мюллера. Прекрасные препараты можно также получить из обычного носового полипа, который следует поместить в фиксирующую жидкость сразу после удаления.

Все срезы эпителия окрашивайте пикрокармином, а также эозином и гематоксилином.

Обычная рыхлая соединительная ткань. — Трудно получить без примеси жира. Ее можно изучать в подкожной ткани уже сделанного среза пениса кошки. Фрагмент ткани также следует извлечь и осторожно расщипать в капле пикрокармина. Рыхлую соединительную ткань можно также изучать на срезах кожи и в капсулах различных внутренних органов.

Эластическая ткань. — Также может быть изучена на большинстве срезов кожи. Если имеется выйная связка крупного четвероногого (лошади, быка) и т. д., она дает лучшие образцы; можно также исследовать желтые связки человека. Растяните кусочек на дереве или воске. Фиксируйте в жидкости Мюллера. Окрашивайте пикрокармином. Следует подготовить как срезы, так и расщипанные препараты.

Сухожилие. — Легко получить из ампутированной конечности. Фиксируйте в жидкости Мюллера. Сделайте поперечные и продольные срезы. Окрасьте эозином и гематоксилином.

Следует также сделать препарат, расщипав немного свежего сухожилия в физиологическом растворе и окрасив пикрокармином.

Ретикулярная или лимфоидная ткань. — Встречается в лимфатических узлах и лимфоидных фолликулах, разбросанных вдоль подслизистого слоя пищеварительного канала.

Подготовьте срезы обычным способом. Окрасьте эозином и гематоксилином или пикрокармином.

Некоторые срезы следует также подготовить путем «промакивания» (т. е. постукивания кисточкой из верблюжьего волоса) или путем встряхивания срезов в пробирке с водой или физиологическим раствором. Благодаря этому лейкоциты удаляются, и структура самой аденоидной ткани становится более заметной.

Жир. — Лучше всего изучать на срезах кожи и подкожной клетчатки или на брыжейке кошки. Один образец следует окрасить осмиевой кислотой и пикрокармином и смонтировать в среде Фарранта, а другой — эозином и гематоксилином и смонтировать в канадском бальзаме.

Пигментные клетки. — Разветвленные клетки лучше всего изучать в живой лапке лягушки, где в них можно наблюдать амебоидные движения при изменении интенсивности света, падающего на сетчатку. Постоянные препараты удобнее всего изготавливать из мантии обыкновенной улитки. Раковину удаляют, мантию вырезают ножницами. Затем ее расправляют, фиксируют в течение дня в метилированном спирте и монтируют неокрашенной в среде Фарранта. Их также хорошо видно на срезах сосудистой оболочки глаза.

Гиалиновый хрящ. — Образцы можно получить из любого сустава, из реберных хрящей молодых животных или из щитовидного хряща и колец трахеи. Его можно фиксировать в спирте. Окрашивайте пикрокармином, эозином и гематоксилином, а также метиловым фиолетовым.

Эластический хрящ. — Подготавливается из надгортанника или хрящей уха, например, кошки. Фиксируйте в спирте. Окрашивайте пикрокармином или разбавленным фуксином.

Волокнистый хрящ. — Получают из межпозвоночного диска. Подготавливайте и окрашивайте так же, как гиалиновый хрящ.

Кость:

Недекальцинированная кость. — Отрежьте как можно более тонкий срез с помощью тонкой пилы. Шлифуйте срез рукой на сухом масляном камне, пока он не станет максимально тонким. Затем приклейте его канадским бальзамом (разжиженным при нагревании) к кусочку стекла и продолжайте процесс шлифовки, время от времени осматривая его при малом увеличении, чтобы увидеть, достаточно ли он тонок. Как только он станет достаточно тонким, его смывают со стекла метилированным спиртом и промывают, чтобы избавиться от мелкой костной пыли. Затем его следует перенести в скипидар и можно монтировать в бальзаме.

Декальцинированная кость. — Образцы можно получить из ампутированной конечности или из бедренной кости кошки.

Образцы следует декальцинировать в хромо-азотной жидкости, а фиксацию завершить в спирте. При изучении процесса оссификации, например, в головке плечевой кости котенка, лучше всего залить образец в целлоидин перед нарезкой срезов, так как костные трабекулы очень хрупкие и легко отрываются.

Очень красивые эффекты двойного окрашивания можно получить с помощью пикрокармина, или эозина и гематоксилина, а также эозина и метилового фиолетового.

Костный мозг. — Чтобы получить хорошие срезы красного костного мозга, возьмите кусочек ключицы, ребра или одной из костей запястья или предплюсны. Декальцинируйте в хромо-азотной жидкости. Залейте в целлоидин. Окрасьте эозином и кампешевым деревом, эозином и квасцовым кармином или квасцовым кармином и пикриновой кислотой. Смонтируйте в канадском бальзаме. Различные клетки, присутствующие в костном мозге, можно также изучить, выдавив немного свежего мозга из ребра, сделав мазок на покровном стекле и подготовив его точно так же, как указано для мазков крови на странице 116.

Зуб. — Лучше всего нарезать in situ из челюсти кошки. Декальцинируйте в хромо-азотной жидкости и сделайте как вертикальные, так и поперечные срезы. Окрасьте пикрокармином или эозином и гематоксилином.

Развивающийся зуб. — Чрезвычайно хорошие образцы можно получить из челюсти новорожденного котенка или щенка. Легко сделать срезы, показывающие молочный зуб и развивающийся рядом постоянный зуб.

Эмаль растворяется декальцинирующими жидкостями. Чтобы изучить ее, следует подготовить образец недекальцинированного зуба в соответствии с указаниями, данными для кости.

Поперечно-полосатая мышца. — Следует изучать на различных животных.

Ножку насекомого, например таракана, можно зафиксировать в осмиевой кислоте. Одну ножку следует зафиксировать в прямом положении, чтобы закрепить фибриллы в полностью вытянутом состоянии, другую следует согнуть, чтобы получить образцы расслабленных фибрилл.

Части мышцы следует извлечь и расщипать на предметном стекле в какой-либо окрашивающей жидкости, такой как пикрокармин, десятый процентный раствор эозина или четвертьпроцентный раствор сафранина.

Следует подготовить срезы мышц амфибий и млекопитающих, чтобы показать их различия в структуре. Наиболее удобной частью для выбора является язык, так как вид волокон получается как в продольных, так и в поперечных срезах. Срезы следует окрашивать эозином и гематоксилином, что дает прекрасный эффект. Специальные методы окрашивания внутримышечных нервных окончаний см. на странице 92.

Сердечная мышца. — Часть следует расщипать в свежем виде в пикрокармине или эозине, другую часть зафиксировать в жидкости Мюллера, сделать срезы и окрасить эозином и гематоксилином.

Гладкую мышцу можно получить, расщипав свежий кусочек мышечной оболочки тонкой кишки животного или сделав срезы фиксированного кишечника, мочевого пузыря или матки. Окрашивайте пикрокармином или, предпочтительно, эозином и гематоксилином.

Нервы. — Специальные методы окрашивания нервных тканей подробно описаны в главе VI. Студент должен помнить, что обычные методы окрашивания также применимы к нервным тканям.

Нервные окончания:

Тельца Мейснера. — Возьмите кончик указательного пальца сразу после ампутации. Поместите его часть сразу в раствор хлорида золота, а остальное — в жидкость Мюллера до фиксации.

Срезы, окрашенные хлоридом золота, следует монтировать в среде Фарранта. Остальные срезы можно окрасить пикрокармином или эозином и гематоксилином.

Тельца Пачини. — Могут быть выделены на мелких ветвях пальцевых нервов или найдены в брыжейке кошки. Последнюю следует расправить на дереве, зафиксировать в жидкости Мюллера, окрасить гематоксилином и смонтировать в бальзаме.

Другие формы осязательных телец можно изучать на языках лягушек, уток или гусей. Сеть нервных фибрилл следует изучать в роговице. Возьмите роговицу недавно убитой лягушки или кошки и окрасьте хлоридом золота (стр. 82).

Концевые пластинки, в которых нервы заканчиваются в мышцах, можно изучать, поместив образцы живой мышцы какого-либо хладнокровного животного в раствор хлорида золота и окрасив довольно интенсивно.

Артерии. — Возьмите кусочек аорты, кусочек какой-либо артерии среднего калибра, например почечной или лучевой, и зафиксируйте в жидкости Мюллера. Окрашивайте пикрокармином и обязательно эозином и гематоксилином. Артериолы лучше всего изучать на срезах различных органов. Так, их можно увидеть в каждом мальпигиевом тельце селезенки, в пограничной зоне почки и так далее. Продольный вид поверхности также можно получить, окрасив и исследовав мягкую мозговую оболочку.

Вены. — Извлекайте, фиксируйте и окрашивайте таким же образом.

Капилляры. — Очень хорошо видны в лапке лягушки.

Оглушите лягушку ударом по голове или хлороформом. Закрепите ее на кусочке картона с V-образным вырезом на одном конце. Привяжите одну из задних лапок с помощью нитей, прикрепленных к пальцам, так, чтобы перепонка лапки была слегка натянута над V-образным вырезом. Затем лапку можно легко исследовать под объективом 1/2 дюйма. Лапку необходимо время от времени смачивать физиологическим раствором, чтобы она оставалась влажной. Движение крови в капиллярах и т. д. можно изучать в течение часа или двух. После смерти брыжейку следует расправить на кусочке дерева и зафиксировать в течение нескольких дней в жидкости Мюллера.

Окрасьте эозином и гематоксилином.

Лимфатические сосуды. — Начало лимфатических сосудов в серозной оболочке. Окрасьте кусочек сальника кошки нитратом серебра (стр. 82) в течение нескольких минут. После промывки подержите в глицерине около недели, затем окрасьте гематоксилином и смонтируйте в среде Фарранта.

Лимфатические узлы. — Можно использовать лимфатические узлы шеи кошки. Фиксируйте в жидкости Мюллера. Окрашивайте пикрокармином, эозином и гематоксилином.

Кожа и потовые железы. — Срезы следует делать из кусочков, взятых (а) с подошвы, (б) с кожи тела, (в) из подмышечной впадины взрослого человека для изучения пигмента. Фиксируйте в жидкости Мюллера. Окрашивайте пикрокармином или эозином и гематоксилином.

Волосы и сальные железы. — Возьмите кусочек кожи головы или кожи щенка. Фиксируйте в жидкости Мюллера. Окрашивайте эозином и гематоксилином, а другие монтируйте неокрашенными.

Волосы с различных частей тела следует также вымочить в течение нескольких часов в liq. potassae и смонтировать неокрашенными в среде Фарранта. Впоследствии их можно обесцветить обработкой водой Жавель (стр. 27).

Головной и спинной мозг. — Должны быть извлечены из тела с особой осторожностью, избегая любого растяжения или сдавливания. Фиксируйте медленно в жидкости Мюллера, к которой можно добавить четверть ее объема воды.

Лучшими окрашивающими реагентами являются эозин и гематоксилин, квасцовый кармин или бура-кармин, анилиновый сине-черный и т. д. Методы окрашивания см. в главе VI.

Глаз. — Зафиксируйте глаз недавно убитого быка, кошки или другого животного в формале (стр. 23), проколов склеру в нескольких местах, чтобы фиксирующая жидкость могла проникнуть внутрь. Примерно через неделю сделайте горизонтальный срез через глаз. Переднюю половину (после удаления хрусталика) можно удовлетворительно нарезать в камеди. Срезы хрусталика не очень удачны. Лучший способ получить образцы волокон — расщипать кусочек свежего хрусталика рыбы (например, трески) в 1/40-процентном водном растворе эозина. Смойте эозин с предметного стекла 1/2-процентным раствором уксусной кислоты и смонтируйте в растворе Фарранта.

Заднюю половину глаза следует залить в целлоидин, так как в противном случае крайне трудно получить срезы сетчатки в ее правильном соотношении с другими оболочками.

Некоторые образцы монтируйте неокрашенными. Другие окрасьте обычными красителями.

Внутреннее ухо. — Декальцинируйте височную кость кошки, собаки, морской свинки и т. д. в хромо-азотной жидкости. Как только кость декальцинируется, завершите фиксацию мягких частей в метилированном спирте, залейте в целлоидин и сделайте срезы вдоль продольной оси улитки. Из-за чрезвычайной твердости кости у взрослых особей лучше всего использовать каменистую часть височной кости новорожденных животных.

Полукружные каналы легче всего изучать в височной кости рыб или птиц, например, обычной курицы. Их также необходимо нарезать в целлоидине и окрасить обычным способом.

Нос и обонятельный эпителий. — Трудно получить образцы от человека, но очень удовлетворительные препараты можно сделать из собаки или, что удобнее, из новорожденного щенка, у которого кости еще хрящевые. Последние фиксируйте в жидкости Мюллера, взрослые образцы декальцинируйте в хромо-азотной жидкости. Образцы мерцательного эпителия и т. д. будут получены из нижней части, а специального обонятельного эпителия — из верхней части. Окрашивайте эозином и гематоксилином.

Легкие. — Осторожно извлеките легкие кошки, не повреждая бронхи или трахею. Введите канюлю в трахею и осторожно надуйте ее воздухом. Перевяжите трахею и поместите легкое в жидкость Мюллера, прикрепив груз, чтобы орган оставался погруженным. Фиксируйте около шести недель, а затем сделайте срезы различных частей.

Чтобы продемонстрировать эндотелий альвеол, вместо воздуха введите нитрат серебра. Оставьте на полчаса, затем удалите промыванием и зафиксируйте в жидкости Мюллера.

Прекрасные слепки альвеол и т. д. можно получить, поместив легкое кошки или человека под колокол воздушного насоса и, когда воздух будет полностью откачан, введя легкоплавкий металл в бронх. Затем ткань легкого удаляется путем коррозии или мацерации. Части слепков следует извлечь, закрепить в стеклянной ячейке с помощью капли канадского бальзама и исследовать в отраженном свете.

Щитовидная железа. — Лучше всего получать от молодого субъекта, человека или животного.

Фиксируйте в жидкости Мюллера. Окрашивайте пикрокармином или эозином и гематоксилином. Также окрашивайте срезы сафранином, который окрашивает коллоидный материал, а также выявляет любое коллоидное образование в самих клетках.

Тимус. — Извлеките из плода или очень молодого животного и подготовьте обычным способом.

Язык. — Язык кошки или кролика подходит очень хорошо.

Следует сделать обычные поперечные срезы, а также срезы через желобоватые сосочки, чтобы изучить «вкусовые почки».

Слюнные железы. — Железы кошки или собаки подходят очень хорошо.

Срезы следует сделать из каждой из трех желез.

Желудок. — Следует изучать желудок кошки или собаки. Орган должен быть извлечен сразу после смерти, до того как произойдет посмертное переваривание оболочек. Желудок следует вскрыть, осторожно промыть и расправить, как можно меньше растягивая, на кусочке дерева и зафиксировать в жидкости Мюллера.

Срезы следует сделать (а) продольно через кардиальный отдел, чтобы показать переход от пищеводной к желудочной слизистой оболочке, (б) из части большой кривизны, (в) продольно через привратник.

Эозин и гематоксилин — лучший краситель для пищеварительного канала.

Кишечник. — Подготавливайте так же, как желудок. Сделайте срезы из (а) верхней части двенадцатиперстной кишки, чтобы показать железы Бруннера, (б) подвздошной кишки, (в) пейеровой бляшки, (г) червеобразного отростка, (д) толстой кишки.

Печень. — Сделайте инъекцию одного образца кармином и желатином (стр. 120). Фиксируйте в метилированном спирте. Другие следует фиксировать в жидкости Мюллера и окрашивать обычным способом.

Почка, надпочечник и поджелудочная железа. — Такая же подготовка, как для печени.

Селезенка. — Фиксируйте в жидкости Мюллера.

Один срез смонтируйте неокрашенным. Другой встряхните с водой в пробирке, чтобы показать структуру пульпы. Остальные окрасьте эозином и гематоксилином.

Мочевой пузырь. — Должен быть извлечен и расправлен сразу после смерти, иначе эпителий будет мацерирован. Следовательно, его нужно брать от животного, например, кошки. Фиксируйте в осмиевой кислоте. Нарезайте в целлоидине, так как оболочки очень склонны к отслоению.

Пенис и семенник. — Легко получить от собаки, кошки или крысы.

Окрашивайте эозином и гематоксилином.

Матка, яичники и фаллопиевы трубы. — Можно получить из секционного зала или от низших животных. Фиксируйте в жидкости Мюллера и сделайте срезы из шейки матки, тела матки, фаллопиевой трубы и яичника.

Окрашивайте эозином и гематоксилином.

Эмбриологические образцы. — Для систематической работы следует обращаться к специальным руководствам.

Образцы следует фиксировать в осмиевой кислоте или жидкости Мюллера и нарезать в целлоидине или парафине.

Мутное набухание. — Образцы получают из органов субъектов, умерших на ранней стадии какой-либо лихорадки. Их всегда следует фиксировать в жидкости Мюллера, так как внешний вид меняется, если ткань долго держать в спирте.

Жировая дистрофия. — Подготавливайте от пациентов, умерших от истощающих заболеваний, фосфорного отравления и т. д.

Окрашивайте осмиевой кислотой. Монтируйте в среде Фарранта и храните в темноте.

Слизистая дистрофия. — Изучайте в бокаловидных клетках нормального кишечника или кист яичников. Не существует удовлетворительных селективных красителей для муцина.

Коллоидная дистрофия. — Встречается в щитовидной железе, в канальцах почек при многих заболеваниях и в предстательной железе у пожилых людей.

Окрашивайте сафранином.

Восковидная или амилоидная дистрофия. — Лучше всего изучать в печени, селезенке или почках. Ее следует искать у лиц, умерших от длительной болезни, сопровождавшейся нагноением, например, чахоткой или болезнью костей. Один срез смонтируйте неокрашенным, другой окрасьте метиловым фиолетовым, третий — слабым раствором йода, и исследуйте последний сразу как в проходящем, так и в отраженном свете. Йодное окрашивание не является постоянным. Еще один срез следует окрасить осмиевой кислотой с последующим метиловым фиолетовым, так как восковидная и жировая дистрофии часто сосуществуют.

Гиалиновая дистрофия. — Наблюдается в артериолах селезенки в некоторых случаях брюшного тифа и дифтерии. Необходимо использовать обычные методы окрашивания.

Известковая дистрофия. — Возникает после жировой дистрофии в гуммах и атероматозных артериях. Она также встречается в матриксе реберных хрящей после среднего возраста. Смонтируйте один срез неокрашенным и исследуйте, если возможно, с помощью полярископа. Остальные окрасьте сафранином.

Пигментная дистрофия. — Можно изучать при бурой атрофии сердца, мускатной печени и т. д. Она также хорошо видна в спинномозговых и церебральных нервных клетках у пожилых людей. Фиксируйте в жидкости Мюллера и монтируйте срезы неокрашенными.

Нет необходимости повторять методы фиксации различных пораженных органов, так как указания для нормальных органов остаются в силе. Если подозревается наличие микроорганизмов, фиксируйте в метилированном спирте или абсолютном алкоголе, но, как правило, как для пораженных органов, так и для опухолей, жидкость Мюллера окажется наиболее удовлетворительным реагентом для общего использования.

Иногда, однако, неудобно ждать несколько недель, пока жидкость Мюллера достаточно зафиксирует образец, прежде чем делать срезы. В этом случае лучший план — сделать свежие срезы или же отрезать ломтик толщиной около одной восьмой дюйма и фиксировать около трех дней в большом количестве метилированного спирта или в формале (стр. 23).

Опухоли. — Следует использовать жидкость Мюллера, если не требуется более быстрый агент.

Метилированный спирт можно использовать в случае эпителиомы, аденомы и т. д., но для саркомы, миксомы, опухолей, содержащих кисты или много крови, жидкость Мюллера дает наилучшие результаты.

СПРАВОЧНАЯ ЛИТЕРАТУРА.

Методы в микроскопической анатомии — Уитмен. Практическая патология — Вудхед. Учебник бактериологии — Крукшенк. Руководство для физиологической лаборатории — Харрис и Пауэр. Практическая гистология — Фернли. Практическая патология и гистология — Гиббс. Журнал Микроскопического общества. Методы и формулы — Сквайр. Человеческий мозг — Гудолл. Практическая бактериология — Кантхак и Драйсдейл. Методы микроскопических исследований — Коул.

ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ.

Конденсор Аббе, 11. Абсолютный спирт, 21. Ацетат меди, 89. Пузырьки воздуха, удаление, 56. Квасцовый кармин, 76. Квасцовый гематоксилин, 68, 70. Амилоидная дистрофия, 149. Анилиновый сине-черный, 94. Анилиновое масло, 102, 108. Анилиновая вода, 107. Необходимая аппаратура, 1. Рыхлая соединительная ткань, 133. Бактерии, красители для, 103. Склянка для бальзама, 58. Раствор кампешевого дерева Барретта, 69. Метод Бевана Льюиса, 94. Бихромат калия, 17. Коричневый Бисмарк, 104. Обесцвечивающий раствор, 27. Кристаллы крови, 130. Кровь, методы исследования, 113. Кровеносные сосуды, инъекция, 120. Синяя инъекционная масса, 121. Костный мозг, 136. Кость, срезы, 136. Бура-кармин, 75. Головной мозг, методы окрашивания, 94. Модификация метода Гольджи Бакли, 99. Известковая дистрофия, 149. Раствор канадского бальзама, 61. Карболовая кислота, 23. Кармин, 74. Инъекционная масса, 120. Микротом Кэткарта, 39. Микротом Кэткарта-Фрейзера, 42. Кедровое масло, 8, 63. Целлоидин, 30. Цементирование покровных стекол, 65. Хлоральный гематоксилин, 92. Хлорид золота, 82, 94. Хромо-азотная декальцинирующая жидкость, 26. Мерцательный эпителий, 132. Кровообращение в лапке лягушки, 141. Просветление срезов, 63. Просветляющие агенты, 63. Мутное набухание, 148. Гвоздичное масло, 63. Коллоидная дистрофия, 149. Цилиндрический эпителий, 132. Фиксация сулемой, 23. Окрашивание, 100. Покровные стекла, очистка, 57. Препараты на покровных стеклах, 111. Декальцинирующие растворы, 26. Обезвоживание, 63. Вода Жавель, 27. Раствор Эбнера, 27. Жидкость Эрлиха-Бионди, 85. Гематоксилин Эрлиха, 70. Метод фиксации мазков крови Эрлиха, 116. Метод Эрлиха для туберкулезных бацилл, 110. Метод Эрлиха-Грама для окрашивания бактерий, 108. Эластический хрящ, 135. Эластическая ткань, 133. Методы заливки, 29. Эндотелий, 131. Эозин, 72. Эозин и гематоксилин, 73. Эпителиальный цемент, 131. Микротом с эфирным распылением, 39. Фекалии, окрашивание на бациллы, 112. Раствор Фарранта, 59. Жир, удаление из срезов, 59. Окрашивание жира, 134. Жировая дистрофия, 148. Инъекционный аппарат Фернли, 123. Раствор фуксина Феррье, 117. Раствор Флемминга, 25. Флотация срезов, 55. Складчатые срезы, обработка, 58. Формал, 23. Свежие срезы, 52. Фуксин, 104. Генцианвиолет, 104. Краситель Гиббса для туберкулезных бацилл, 111. Хлорид золота, 82, 94. Серебряный метод Гольджи, 96. Сулемовый метод Гольджи, 99. Йодный раствор Грама, 105. Метод Грама для окрашивания бактерий, 107. Зеленая инъекционная масса, 122. Камедь, 29. Кристаллы гематина, 131. Гематоидин, 131. Гематоксилин Эрлиха, 70. Гематоксилин Клейненберга, 70. Гематоксилин Шухарда, 68. Хлоральный гематоксилин Зилера, 92. Гематоксилин Вейгерта, 88. Кристаллы гемоглобина, 130. Процессы фиксации, 15. Гиалиновый хрящ, 135. Гиалиновая дистрофия, 149. Ледяной замораживающий микротом, 46. Иммерсионные линзы, 8. Инъекция кровеносных сосудов, 120. Инъекция легочных альвеол, 145. Внутреннее ухо, 143. Кишечник, 146. Йодный раствор, 105. Микротом с эфирным распылением Юнга, 45. Гематоксилин Клейненберга, 70. Амилоидная дистрофия, 149. Литиевый пикрокармин, 79. Литиевый кармин, 74. Печень, 147. Метиловый синий Леффлера, 104. Кампешевое дерево, 68. Лимфоидная ткань, 134. Жидкость Марки, 24. Костный мозг, 136. Метиловый синий, 101, 104. Метиловый фиолетовый, 83. Метилированный спирт, 19. Микроорганизмы, красители для, 103. Микроскоп, 6. Микротом Беккера, 49. Кембриджский качающийся микротом, 49. Кэткарт, 39. Кэткарт-Фрейзер, 42. Юнг, 45. Шанце, 47. Свифт, 49. Уильямс, 46. Форма для заливки в парафин, 36. Методы монтажа, 55. Слизистая дистрофия, 148. Мышца, 138. Метод фиксации мазков Мьюира, 116. Жидкость Мюллера, 17. Жидкость Мюллера и формал, 20. Жидкость Мюллера и спирт, 20. Краситель Нильсена для туберкулезных бацилл, 110. Нервные клетки, красители для, 94. Нервные окончания, 139. Нервные волокна, красители для, 87. Анилиновый метод Ниссля, 101. Нитрат серебра, 82. Азотная кислота как фиксирующий агент, 25. Азотная кислота как декальцинирующий агент, 26. Азотная кислота как обесцвечивающий агент, 110. Нормальный физиологический раствор, 53. Револьверная головка, 9. Объективы, 7. Бергамотовое масло, 63. Кедровое масло, 8, 63. Гвоздичное масло, 63. Масло душицы, 63. Осмиевая кислота как фиксирующий агент, 21. Осмиевая кислота как окрашивающий реагент, 81. Метод Паля, 86. Раствор Паля, 90. Парафин, 34. Пикрокармин, 78. Пигментные клетки, 134. Пигментная дистрофия, 150. Плоский нож микротома, 42. Быстрая фиксация, 150. Сетчатка, 143. Сафранин, 85. Слюнные железы, 146. Метод Шефера-Паля, 91. Микротом Шанце, 47. Гематоксилин Шухарда, 68. Хлоральный гематоксилин Зилера, 92. Нитрат серебра, краситель для нервных клеток, 96. Эпителиальный цемент, 131. Кожа, 142. Спинной мозг, 86, 142. Селезенка, 147. Мокрота, окрашивание, 111. Плоский эпителий, 131. Методы окрашивания, 67 и след. Желудок, 146. Поперечно-полосатая мышца, 138. Серная кислота, 105. Потовые железы, 142. Сухожилие, 133. Проверка микроскопа, 13. Тимус, 145. Щитовидная железа, 145. Жидкость Туазона, 118. Зуб, срезы, 137. Переходный эпителий, 132. Туберкулезная бацилла, красители для, 110. Опухоли, фиксация, 150. Гладкая мышца, 139. Моча, исследование на бациллы, 112. Матка, 148. Декальцинирующий раствор фон Эбнера, 27. Восковидная дистрофия, 149. Метод гематоксилина Вейгерта, 88. Метод Вейгерта для окрашивания бактерий, 106. Ледяной замораживающий микротом Уильямса, 46. Инъекционная масса Вудхеда, 120. Ксилол, 61. Карбол-фуксин Циля, 105.

СНОСКИ:

1 Студент должен помнить об опасности работы с бензином вблизи открытого огня.

2 «Практическая гистология» (Macmillan & Co.).