«Нарезка и окрашивание срезов: практическое введение в гистологические методы»

2. Переносом с помощью расправляющего шпателя.

Этот метод применяется при монтаже в канадском бальзаме для переноса среза из просветляющего агента (стр. 63) на предметное стекло. Шпатель полируют и подсовывают под срез. Срез, удерживаемый на месте иглой, теперь поднимают из жидкости, излишки которой удаляют, удерживая срез на месте препаровальной иглой и наклоняя шпатель, чтобы дать ей стечь.

Удаление пузырьков воздуха из срезов. — Когда срезы содержат много пузырьков воздуха, лучше всего оставить их на некоторое время в метилированном спирте. Тогда пузырьки сливаются и выходят из среза.

Для нежных структур и свежих срезов перенос в спирт и последующее расправление среза при возвращении в воду рискованны, и лучший метод обработки в таких случаях — поместить сосуд с ними под колпак воздушного насоса, если таковой имеется, и слегка откачать воздух.

Однако наиболее частой причиной появления пузырьков воздуха в смонтированных препаратах является использование покровных стекол, которые не были тщательно очищены. Правильную очистку лучше всего проводить, помещая стекла после покупки в широкогорлый флакон с притертой пробкой, содержащий концентрированную азотную кислоту, и оставляя их в этой жидкости на двадцать четыре часа. Затем кислоту следует слить, а через сосуд пропускать воду из-под крана до тех пор, пока промывные воды перестанут давать кислую реакцию с лакмусовой бумагой. Затем воду следует слить, а стекла залить абсолютным спиртом. Их можно извлекать по одному и быстро высушивать по мере необходимости. При использовании покровных стекол, правильно очищенных таким образом, не только удастся избежать пузырьков воздуха, но и стекла будет гораздо легче высушить тканью, и меньше их будет разбиваться в процессе.

Другой очень частой причиной является перенос пузырьков воздуха вместе с монтажной средой на стеклянной палочке. Это происходит особенно часто, если палочка вплавлена в пробку. Правильные флаконы для использования как для среды Фарранта, так и для бальзама — это «бальзамные флаконы», у которых нет пробки, а горлышко закрывается стеклянным колпачком, который точно прилегает (рис. 9). Короткая стеклянная палочка прикреплена к колпачку и используется для переноса среды на предметное стекло.

Fig. 9.—Balsam bottle.

Обработка сложенных срезов. — Складывание может быть вызвано:

(1.) Тем, что срез смялся из-за того, что его резали ножом, поверхность которого была не идеально гладкой. Это лучше всего исправить, поместив срез на минуту в метилированный спирт, а затем перенеся его в чашку с чистой водой, когда срез быстро поднимется на поверхность и расправится на поверхности воды вследствие быстрой диффузии спирта из краев в окружающую воду.

(2) Тем, что срез содержит большое количество жира, как в срезах кожи и подкожной клетчатки. Жир можно удалить из жировых клеток, не меняя существенно внешний вид среза. Это делается путем обезвоживания среза в спирте, а затем переноса в часовое стекло, содержащее эфир или хлороформ, для экстракции жира. Ткань следует промыть от эфира в спирте, а затем перенести в чашку с водой и дать расправиться. Этот процесс не мешает последующим операциям окрашивания.

Монтажные среды.

Раствор Фарранта:—

Gum Arabic (picked, colourless) equal parts. Glycerine Water

При изготовлении этого раствора необходимо использовать лучший гуммиарабик, причем только самые прозрачные его кусочки. Следует избегать «порошкообразной камеди акации», так как, хотя она выглядит белой, она часто дает коричневую слизь, а кроме того, часто фальсифицируется крахмалом и т. д.

Глицерин и воду следует смешать и добавить гуммиарабик. Смесь следует оставить на несколько недель, часто помешивая, пока весь гуммиарабик не растворится. Затем дайте ей постоять еще неделю или две, чтобы грязь осела, а пузырьки поднялись наверх. Пленку следует удалить, а прозрачную жидкость слить с осадка в «бальзамный флакон» (стр. 58), содержащий несколько капель насыщенного раствора арсената натрия и небольшой кусочек камфоры.

При правильном изготовлении это чрезвычайно полезный монтажный реагент. Он не слишком сильно просветляет ткани, и благодаря содержанию гуммиарабика он высыхает по краям и более или менее прочно цементирует покровное стекло через неделю или две. Если этого не происходит, значит, среда содержит слишком много глицерина, и необходимо добавить больше гуммиарабика, чтобы компенсировать это. Такое высыхание по краям предотвращает дальнейшее испарение, в то время как глицерин поддерживает срез постоянно влажным.

Камфора и арсенат натрия предотвращают образование грибков. Срезы сохраняют свой первоначальный вид в этой среде в течение многих лет. Через долгое время они склонны становиться немного мутными и зернистыми.

Неокрашенные срезы всегда следует монтировать в среде Фарранта, так как процесс с канадским бальзамом делает их совершенно прозрачными. Она подходит практически для любой ткани, окрашенной или неокрашенной, но срезы нервных центров требуют монтажа в канадском бальзаме из-за непрозрачности миелина при монтаже в глицерине.

Раствор канадского бальзама:— Среда изготавливается так:—

Обычный канадский бальзам, имеющий консистенцию патоки, осторожно нагревают на водяной бане в течение нескольких часов, чтобы удалить скипидар и другие летучие масла. Затем его оставляют остывать до желтой стекловидной массы. Возьмите:

Dried Canada balsam equal parts. Xylol

Оставьте до растворения, периодически помешивая.

Если раствор не является совершенно прозрачным, его необходимо профильтровать через очень тонкую бумагу, предварительно смоченную ксилолом. Если среда слишком густая, следует добавить больше ксилола; если слишком жидкая, ксилолу следует дать испариться, пока среда не приобретет консистенцию жидкого сиропа.

Если среда сделана слишком жидкой, возникнет много неприятностей из-за ее испарения по краю покровного стекла, оставляя воздушное пространство, которое будет увеличиваться ежедневно, пока срез не останется совсем сухим. Это следует исправить, нанеся еще одну каплю бальзама на край покровного стекла и позволив ей затечь внутрь и вытеснить воздух. Вскоре после этого следует нанести кольцо цемента.

Флакон, в котором хранится бальзам, должен быть очень тщательно высушен перед наполнением, а затем ополоснут абсолютным спиртом, а впоследствии ксилолом. Скипидар или бензол часто используются вместо ксилола при приготовлении среды и в той же пропорции, но последний менее склонен вымывать анилиновые красители из срезов.

Для монтажа срезов в канадском бальзаме их необходимо сначала перенести в часовое стекло, содержащее абсолютный спирт или спиртовой раствор какого-либо окрашивающего реагента, например, эозина (стр. 72), и оставить в нем, не пытаясь расправить, до полного обезвоживания, т. е. примерно на две минуты. Затем его следует перенести в просветляющее масло на препаровальной игле или на расправляющем шпателе, который должен быть совершенно сухим, так как любая капля влаги, попавшая на срез, будет препятствовать просветляющему действию масла и вызовет неприглядные непрозрачные участки при монтаже среза. Даже дыхание на срез по пути к просветляющему агенту предотвратит равномерность просветления. Если в срезе во время пребывания в масле появляются белые пятна, его необходимо извлечь с как можно меньшим количеством масла и снова обезвожить в абсолютном спирте.

Процесс просветления должен выполняться в какой-либо среде, в которой канадский бальзам легко растворим и которая также легко смешивается со спиртом. Наиболее часто используемые — это гвоздичное масло, ксилол, бергамотовое масло, кедровое масло и масло душицы. Первое из названных всегда широко использовалось из-за приятного запаха, дешевизны и легкости, с которой его можно получить. Но оно имеет недостаток: растворяет многие важные окрашивающие реагенты, особенно эозин и различные анилиновые красители. Кроме того, поскольку оно растворяет целлоидин, срезы, сделанные в этой среде, имеют тенденцию распадаться при переносе в гвоздичное масло, поэтому для целлоидиновых срезов всегда следует использовать одно из других масел (которые не обладают растворяющим действием на целлоидин). Бергамотовое масло наиболее универсально, но довольно дорогое. Там, где есть особые причины для использования других обезвоживающих агентов, они будут указаны в специальных инструкциях для конкретных методов окрашивания в главах VI и VII.

Как только срез погружается в масло, спирт быстро диффундирует наружу, так что края среза расправляются вместе с ним, и срез плавает совершенно ровно на поверхности масла. Когда он полностью просветлен (примерно через минуту), о чем свидетельствует его погружение в масло, его следует перенести на предметное стекло с помощью расправляющего шпателя, а масло слить. Излишки масла можно удалить, осторожно прижимая срез плоским куском фильтровальной бумаги, сложенным в несколько раз. Если выполнять это осторожно, маневр не повредит срез, но он требует практики.

Если ткань очень нежная и может быть повреждена при перемещении из одного сосуда в другой, или если она больше, чем может удобно перенести расправляющий шпатель, ее следует расправить на предметном стекле и, удалив как можно больше воды фильтровальной бумагой, обезвожить, добавив немного спирта из пипетки один или два раза. Затем большую часть спирта следует удалить, наклонив стекло, и до того, как остаток испарится, добавить немного гвоздичного или бергамотового масла из другой пипетки. Сначала срез будет плавать на масле, но последнее постепенно пройдет сквозь него и появится на поверхности среза. Когда это произойдет, просветление завершено, и масло можно слить, наклонив стекло, а срез смонтировать в канадском бальзаме.

Цементирование покровных стекол. — Покровные стекла можно приклеивать, чтобы предотвратить их смещение и порчу препарата. Если покровное стекло круглое, следует использовать вращающийся столик Шадболта. Он состоит просто из горизонтального тяжелого латунного диска, легко вращающегося на оси. На диске концентрически начерчено несколько кругов. Затем стекло закрепляют на диске с помощью зажимов так, чтобы окружность покровного стекла соответствовала одному из кругов. Затем диск вращают, а цемент наносят на край покровного стекла кисточкой.

Используется много материалов. Наиболее подходящие: (1) Канадский бальзам, который почти бесцветен и прозрачен и выглядит очень аккуратно. (2) Золотой лак. (3) Морской клей.

Когда они высохнут, законченный вид стеклу можно придать, нанеся кольцо цинковых белил. Оно изготавливается следующим образом:—

Oxide of zinc 1/2 drachm. Benzole half an ounce of each. Gum dammar

Сохранение срезов. — Их следует хранить в плоском виде и оберегать как от света, так и от пыли. Очень полезные картонные лотки сейчас продаются почти всеми дилерами в коробках, рассчитанных на двадцать четыре дюжины стекол, примерно за восемь шиллингов, или подходящие шкафчики может изготовить столяр.

ГЛАВА V.

Общие методы окрашивания.

Много информации можно получить из неокрашенных срезов, и в большинстве случаев один срез следует исследовать неокрашенным, но препараты, смонтированные таким образом, настолько прозрачны, что изучать детали ткани затруднительно. Поэтому их обычно готовят, обрабатывая каким-либо окрашивающим реагентом, не только для того, чтобы сделать их менее прозрачными, но и для «дифференцировки» элементов среза путем окрашивания одной части более интенсивно, чем другой, или в другой цвет. Так, гематоксилин окрашивает ядра и быстро растущие части ткани, оставляя сформированный материал, как правило, гораздо более слабо окрашенным. Метиловый фиолетовый, в свою очередь, окрашивает здоровые ткани в синий цвет, а части, пораженные восковидной дегенерацией, — в красно-фиолетовый. Комбинируя красители, также можно добиться значительной дифференцировки элементов ткани. Срезы следует окрашивать несколькими реагентами, так как их действие на отдельные образцы сильно варьируется.

Ниже приведены наиболее полезные красители для общих целей:—

Кампеш (Logwood). — Этот краситель или его очищенный принцип гематоксилин — наиболее полезный общий краситель. Сам гематоксилин предпочтительнее, так как дает более постоянные результаты и менее диффузное окрашивание.

Для общих целей окрашивания следующая формула даст отличные результаты:— Гематоксилин. Формула Шухардта. —

(a)Hæmatoxyline3grms. 30grs. Absolute alcohol16c.c.2 1/2drms. (b)Pure alum3grms.30grs. Distilled water 100c.c.2ozs.

Добавляйте (a) к (b) по каплям при постоянном перемешивании. Храните несколько дней на рассеянном дневном свету, пока цвет не станет настолько глубоким, что не будет пропускать свет. Затем его следует профильтровать и добавить кристалл тимола. Сначала он не даст очень удовлетворительных реакций окрашивания, и ему следует дать созреть не менее месяца или шести недель перед использованием. Он улучшается как краситель с каждым месяцем хранения. Всякий раз, когда гематоксилин был приготовлен с квасцами, как в приведенной выше формуле, через некоторое время образуется обильный красно-коричневый осадок. Это никак не мешает активности раствора, но перед использованием его всегда необходимо фильтровать.

Формула Барретта. — Представлена доктором У. Х. Барреттом из Белфаста. Она дает почти такие же хорошие результаты, как и вышеуказанная. Она изготавливается из обычного английского экстракта кампеша и значительно дешевле.

Экстракт следует высушить, мелко истолочь, а затем экстрагировать абсолютным спиртом в течение нескольких дней.

Powdered extract of logwood2grms. 1 1/2drms. Absolute alcohol 10c.c.1oz.

Профильтруйте и медленно добавьте к

Benzoate of sodium1grm. 36grs. Alum1grm.36grs. Distilled water 100c.c.10ozs.

Сила раствора будет варьироваться в зависимости от разных образцов кампеша и должна оцениваться опытным путем. Этот раствор сравнительно дешев и полезен для учебных целей.

Гематоксилин Эрлиха. — Этот очень полезный ядерный краситель изготавливается следующим образом:—

(a)Hæmatoxyline2grms.9grs. Absolute alcohol100c.c.2ozs. (b)Glycerine100c.c.2ozs. Distilled water100c.c.2ozs. Alum 120grms.2 1/2ozs. Glacial acetic acid5c.c. 24mins.

Медленно добавляйте (a) к (b) при постоянном перемешивании.

Дайте созреть на солнечном свету в течение двух месяцев перед использованием. Его можно использовать как быстрый краситель в неразбавленном виде, но гораздо лучшие результаты получаются при использовании слабого раствора: несколько капель на часовое стекло с дистиллированной водой, окрашивая медленно от получаса до двух часов. Раствор улучшается при хранении. Если через некоторое время окрашивание становится диффузным, это указывает на то, что уксусная кислота испарилась, и следует добавить еще несколько капель.

Гематоксилин Клейненберга. — Эта формула отличается от предыдущей тем, что является спиртовым раствором. Хлорид кальция добавляется, потому что он «создает диффузионные токи между спиртом в материале, подлежащем окрашиванию, и спиртовым окрашивающим раствором, тем самым позволяя последнему проникать быстрее» (Сквайр). Он широко используется при окрашивании эмбриональных образцов целиком перед заливкой в парафин и был настоятельно рекомендован для этой цели Фостером и Мейтлендом Бальфуром.

Время от времени предлагались различные формулы. Ту, что рекомендована Сквайром (Methods and Formulae, стр. 25), можно точно приготовить без особых трудностей.

(a)Crystallised calcium chloride 20grs. 1/2oz. Distilled water10c.c.2drms. (b)Alum3grms.32grs. Distilled water16c.c. 170mins.

Смешайте и добавьте

Rectified spirit 240c.c. 8ozs.

Дайте постоять, чтобы отделился избыток сульфата кальция и т. д. Профильтруйте и добавьте

Hæmatoxyline 2 1/2grms. 25grs.

В качестве консерванта следует добавить немного тимола.

При приготовлении этих растворов необходимо следить за тем, чтобы использовалась только дистиллированная вода и чтобы все используемые сосуды были предварительно ополоснуты ею, иначе произойдет осаждение гематоксилина.

Если срезы были перекрашены гематоксилином, это можно исправить, промыв их в полупроцентном растворе уксусной кислоты до тех пор, пока не вымоется достаточное количество красителя, но окрашивание будет более диффузным, чем если бы в первом случае была достигнута золотая середина.

Гематоксилин окрашивает ядра клеток в красивый фиолетовый цвет, а также более или менее слабо окрашивает клеточную протоплазму и волокнистые элементы. Он также окрашивает осевые цилиндры нервов и широко используется при специальном окрашивании нервных центров, как будет описано далее (стр. 88–91).

Краситель стойкий. Срезы можно монтировать либо в растворе Фарранта, либо в канадском бальзаме, причем последний предпочтительнее.

Эозин. — Гораздо более удовлетворительные результаты получаются от коммерческого эозина (аморфный оранжевый порошок, используемый в крашении и производстве красных чернил), чем от чистой кристаллической формы.

Его можно использовать в виде водного раствора (1/30 процента) или в виде раствора в абсолютном спирте (1/15 процента). Срезы, окрашенные первым, следует быстро пропустить через однопроцентный раствор уксусной кислоты, чтобы «зафиксировать» краситель, а затем промыть в дистиллированной воде.

Это очень прозрачный краситель, и самые тонкие детали среза, окрашенного им, прекрасно видны.

Он лишь слегка окрашивает ядро, в то время как клеточную протоплазму, волокнистые ткани и особенно мышечные ткани окрашивает в красивый розовый цвет.

Таким образом, видно, что он окрашивает те части, которые остаются неокрашенными гематоксилином, и наоборот. Это комплементарное действие применяется в следующем методе.

Двойное окрашивание эозином и гематоксилином. — Срезы, окрашенные гематоксилином обычным способом, промывают в дистиллированной воде и обезвоживают в растворе (около 1 к 1500) эозина в абсолютном спирте. Они должны оставаться в нем около двух минут, а затем их следует пропустить через гвоздичное масло и смонтировать в канадском бальзаме обычным способом.

Этот метод дает чрезвычайно полезные и красивые результаты почти со всеми тканями и превосходит пикрокармин для дифференцировки элементов ткани. Так, ядра окрашиваются в фиолетовый цвет, клеточная протоплазма — в гораздо более бледный и теплый фиолетовый, волокнистые ткани — в розовый, а эритроциты — в оранжевый или кирпично-красный.

Спиртовой раствор эозина также используется в качестве контрастного красителя после окрашивания на микроорганизмы синими или фиолетовыми красителями.

Кармин. — Он изготавливается следующим образом:—

Carmine (best)21drachm. Strong ammonia21drachm. Distilled water 100 6ounces.

Разотрите кармин с небольшим количеством воды в ступке, добавьте аммиак, после чего жидкость почернеет. Постепенно добавляйте остальную воду, все время растирая. Его следует разлить по флаконам, дать постоять несколько дней, а затем профильтровать и положить во флакон кусочек камфоры.

Литиевый кармин тесно связан с аммиачным кармином по своему окрашивающему эффекту. Обычно это вопрос индивидуальных предпочтений, какой из них использовать.

Carmine2 1/2grms. 10 1/2grs. Saturated aqueous solution of lithium carbonate 100c.c.2ozs.

Растворите и профильтруйте.

Срезы могут быть достаточно окрашены в любой из этих жидкостей за три-пять минут, но более удовлетворительные результаты можно получить, разбавив их в двадцать раз большим объемом дистиллированной воды и оставив срезы окрашиваться на двадцать четыре часа.

После окрашивания кармином срезы необходимо пропустить через полупроцентный раствор уксусной кислоты, чтобы зафиксировать кармин в тканях, иначе вода вымоет краситель.

Бура-кармин —

(a)Borax4grms.3drachms. Carmine2grms. 1 1/2drachms. Distilled water 100c.c.5ounces.

Растворите с помощью нагревания и медленно добавьте к (b).

(b)Alcohol70c.c. 3 1/2ounces. Distilled water 30c.c.1 1/2ounce.

Дайте постоять две недели. Профильтруйте и добавьте кусочек камфоры.

Для использования поместите срезы или ткань целиком в него на срок от четырех до двадцати четырех часов, в зависимости от размера, а затем перенесите в спирт (семьдесят процентов), содержащий каплю соляной кислоты на унцию, на двадцать четыре часа, а затем тщательно промойте в воде. Затем ткань можно поместить в гуммиарабик, если ее нужно заморозить, или обезвожить в спирте, если будут использоваться парафин или целлоидин.

Его преимущество в том, что он очень диффузен, поэтому его можно использовать для окрашивания тканей целиком. Требуется значительное время для достаточно глубокого окрашивания, но мало опасений перекрашивания.

Он ярко окрашивает нервные клетки и осевые цилиндры, а также соединительную ткань, делая склерозированный участок очень заметным.

Квасцовый кармин:—

Alum five per cent. solution in distilled water 100c.c.1oz. Pure carmine1grm. 4 1/2grs.

Кипятите в течение двадцати минут. Профильтруйте. Добавьте несколько капель карболовой кислоты.

При использовании этого реагента его следует профильтровать в часовое стекло и поместить в него срезы не менее чем на час. Нет опасений перекрашивания, и их можно оставить на всю ночь. После окрашивания их необходимо тщательно промыть в воде, чтобы удалить квасцы, иначе при монтаже среза в поле зрения будут видны многочисленные кристаллы. Срезы можно монтировать в растворе Фарранта или в канадском бальзаме. Окрашивающий эффект значительно улучшается после того, как срез постоит несколько дней.

При желании его окрашивающее действие можно дополнить обезвоживанием в спиртовом растворе либо эозина (1 к 1500), либо пикриновой кислоты, а затем просветлением в гвоздичном масле и монтажом в канадском бальзаме.

Сам по себе он дает окраску, очень похожую на гематоксилиновую, только теплее. Он выделяет ядра и осевые цилиндры нервов, слегка окрашивает клеточную протоплазму, а волокнистые элементы почти не окрашивает.

Его можно использовать для тех же целей, что и гематоксилин. Цвет менее привлекателен и не такой глубокий, как у последнего, но поскольку он не перекрашивает срезы, даже если оставить их в нем на неделю, это очень удобный краситель для общих целей.

Он особенно полезен в качестве контрастного красителя для срезов головного и спинного мозга после гематоксилинового метода Вейгерта-Паля (стр. 88).

Аммиачный пикрокармин ранее очень широко использовался в качестве окрашивающего реагента. Его место теперь в значительной степени занял литиевый пикрокармин.

При его приготовлении необходимо использовать лучший кармин.

Он изготавливается следующим образом:—

Carmine1part. Liq. ammon. fort.3parts. Distilled water 3parts.

Растворите при слабом нагревании и добавьте

Cold saturated aqueous solution of picric acid 200parts.

Доведите смесь до точки кипения, а затем поместите в неглубокий сосуд, накрытый стеклянной пластиной, и оставьте на ярком солнечном свету на месяц или более. Профильтруйте, разлейте по флаконам и добавьте шесть капель карболовой кислоты на каждую унцию смеси. Он будет храниться бесконечно долго и улучшается с возрастом. Его требуется время от времени фильтровать, так как из раствора имеет тенденцию выпадать студенистая малиновая муть.

Литиевый пикрокармин. — Приготовлен следующим образом:—

Carmine2·5grms. 10grs. Saturated solution lithium carbonate 100c.c.1oz.

Растворите и добавьте

Saturated solution picric acid 250c.c. 2 1/2oz.

Добавьте несколько капель карболовой кислоты на каждую унцию.

Он должен постоять день или два на солнечном свету, а затем быть профильтрованным. Он улучшается при хранении.

Его следует хранить во флаконе с притертой пробкой, в которую вплавлена стеклянная палочка.

Когда срезы подлежат окрашиванию, их следует расправить на чистом предметном стекле, как описано на странице 55. Затем стекло следует наклонить, чтобы дать воде стечь, а излишки влаги вокруг среза удалить мягкой тряпкой или фильтровальной бумагой. Затем на стекло следует перенести каплю или две красителя, и оставить стекло лежать совершенно ровно примерно на десять минут. Если в комнате не очень тепло, рекомендуется очень осторожно нагреть стекло над спиртовкой, так как это заставляет ткани окрашиваться ярче и быстрее.

Излишки пикрокармина следует слить со стекла, а само стекло протереть. Однако часть красителя следует оставить на срезе, так как его действие продолжает усиливаться и часто полностью проявляется только через несколько недель. Их следует монтировать в среде Фарранта. Как правило, те, что смонтированы в канадском бальзаме, не дают таких хороших результатов. Если есть особые причины для использования этой среды, как при монтаже срезов спинного мозга и т. д., их следует обезвоживать после окрашивания пикрокармином в спиртовом растворе пикриновой кислоты (одна часть насыщенного спиртового раствора на пять частей спирта) перед просветлением в гвоздичном масле, иначе спирт вымоет пикриновую кислоту, и большая часть дифференциального окрашивающего эффекта будет потеряна. Ядра должны быть окрашены в ярко-малиновый цвет, протоплазма клеток — в желтый или тускло-розовый, волокнистые элементы — в ярко-розовый, эритроциты — в зеленый, а весь мертвый материал, например, казеозные массы, — в ярко-желтый. Он также очень ярко окрашивает нервные клетки и осевые цилиндры нервных волокон. Однако это довольно ненадежный краситель. Результаты наиболее блестящие в случае свежих срезов.

Осмия кислота бесценна для окрашивания жировых частиц в клетках.

Для обычного использования однопроцентный исходный раствор (стр. 21) следует разбавить в десять раз большим объемом дистиллированной воды, а срезы окрашивать в нем всю ночь в темном шкафу, или часовое стекло, содержащее их, можно поместить внутрь небольшой коробки.

Срезы необходимо тщательно промыть в большом количестве воды. При желании их можно впоследствии окрасить пикрокармином или метиловым фиолетовым, если также присутствует восковидная дегенерация. Срезы следует монтировать в среде Фарранта, так как канадский бальзам обычно дает разочаровывающие результаты.

Он позволяет выявить мельчайшие жировые частицы в перерождающихся клетках и т. д., окрашивая их в черный цвет. Его можно использовать для демонстрации жировых глобул, закупоривающих сосуды при жировой эмболии.

Он окрашивает миелиновые оболочки нервов в черный цвет; к нему мы еще вернемся при описании методов окрашивания спинного мозга.

Нитрат серебра используется для окрашивания межклеточного цемента эпителиальных клеток. Он окрашивает это вещество в глубокий черный цвет, в то время как остальная ткань приобретает коричневый оттенок. Его применяют в виде полупроцентного раствора на дистиллированной воде, который хранят в склянке с притертой пробкой, тщательно обернутой коричневой бумагой. Для использования возьмите немного эпителиальной ткани, например, сальник недавно убитого животного или срез какой-либо эпителиальной опухоли, сразу после иссечения. Тщательно промойте в дистиллированной воде, чтобы удалить все хлориды, а затем поместите в часовое стекло, содержащее раствор серебра. Держите его в темноте в течение получаса, а затем тщательно промойте большим количеством воды. Срез следует заключить в глицерин или среду Фарранта и беречь от света, иначе он окрасится слишком сильно.

Хлорид золота используется для демонстрации периферических окончаний нервов. Его можно применять только в течение первых получаса после извлечения ткани из живого организма. Кусочки ткани должны быть небольшими; их можно окрашивать целиком, а срезы изготавливать впоследствии.

Используется полупроцентный раствор на дистиллированной воде. Ткань переносят в него сразу после извлечения из организма и выдерживают до тех пор, пока она не приобретет лимонный цвет. Затем ее подвергают воздействию однопроцентного раствора уксусной кислоты при ярком освещении, пока она не приобретет пурпурный оттенок, что занимает от двух часов до двух суток. Срезы следует заключать в среду Фарранта. Он окрашивает клетки ткани и нервные клетки в красновато-пурпурный цвет, а нервные фибриллы, особенно терминальные, — в более фиолетовый. Это очень хорошо видно на роговице.

Иногда для клинических целей бывает полезно иссечь кусочек мышечной ткани и исследовать нервные окончания этим методом. К сожалению, действие этого красителя несколько ненадежно. Лучшие результаты достигаются с помощью хлораль-гематоксилинового метода Зилера (стр. 92).

Метиловый фиолетовый. — Очень удовлетворительный раствор можно получить в готовом виде в составе «telegraphen tinte» (телеграфных чернил), изготовляемых Леонхарди в Дрездене, как рекомендовал Вудхед. Его также можно использовать в виде однопроцентного раствора на дистиллированной воде с добавлением нескольких капель карболовой кислоты для предотвращения роста грибков.

Это очень полезный избирательный краситель. Он дает две реакции: красно-фиолетовую и сине-фиолетовую. Так, он окрашивает матрикс гиалинового хряща в сине-фиолетовый цвет, а клетки — в красно-фиолетовый. Он также имеет важнейшее патологическое применение, поскольку выявляет любые участки, подвергшиеся «восковому» или «амилоидному» перерождению, окрашивая их в красно-фиолетовый цвет, а остальную часть среза — в сине-фиолетовый.

Около десяти капель однопроцентного раствора следует отфильтровать в часовое стекло с водой и окрашивать срезы в течение примерно пяти минут. Затем их необходимо провести через полупроцентный раствор уксусной кислоты и тщательно промывать в течение некоторого времени в большом количестве воды, пока краситель не перестанет вымываться.

Если эти этапы не выполнять тщательно, краситель будет диффундировать после заключения среза, размывая все детали и портя внешний вид препарата.

Срезы можно заключать в раствор Фарранта (в который можно добавить каплю муравьиной кислоты): при заключении в канадский бальзам срезы необходимо перекрашивать, так как и спирт, и гвоздичное масло быстро растворяют краситель.

Сафранин. — Используется в виде свежеприготовленного насыщенного раствора в анилиново-масляной воде, подогретого до 60° C (140° F). Отфильтруйте в часовое стекло. Окрашивайте не более минуты. Обезвоживайте в спирте, который удалит большую часть красителя, просветляйте в гвоздичном или душицевом масле. Заключайте в бальзам.

Другой метод заключается в окрашивании в течение примерно десяти минут с последующим выдерживанием в течение минуты в йодном растворе Грама. Затем срезы промывают в спирте, обезвоживают, просветляют в гвоздичном масле и заключают в бальзам. При использовании этих методов краситель вымывается отовсюду, кроме определенных элементов, например, подвергающихся коллоидному или известковому перерождению.

Иногда используют четвертьпроцентный водный раствор, так как он очень ярко окрашивает ядрышки и активно делящиеся ядра, в то время как остальная часть клетки окрашивается слабо. Его можно использовать для изучения кариокинеза в клетках быстрорастущего рака.

Краситель Эрлиха-Бионди. — Этот краситель широко применяется для окрашивания препаратов крови, изучения кариокинеза и исследований предполагаемых паразитарных тел, обнаруживаемых в раковых клетках.

Его готовят путем медленного смешивания насыщенных водных растворов следующих анилиновых красителей при постоянном помешивании:

Solution of Orange G 100parts " Rubin S20 " " Methyl Green OO50 "

наконец добавьте

Distilled water 70 "

Отфильтруйте обильный осадок, который образуется. Раствор необходимо готовить часто, так как он плохо хранится.

Срезы можно окрашивать быстро, в течение получаса или часа, но лучшие результаты достигаются при разведении жидкости двадцатью объемами воды и окрашивании в течение всей ночи. Срезы следует промыть в воде, затем быстро провести через абсолютный спирт и ксилол и заключить в канадский бальзам.

ГЛАВА VI.

Специальные методы окрашивания. — Специальные методы окрашивания нервных центров.

1. Для окрашивания нервных волокон.

Три метода (два из которых являются модификациями первого) используются гораздо чаще всех остальных. С помощью этих методов окрашивается миелиновая оболочка. Ткани должны быть предварительно зафиксированы в течение многих недель в жидкости Мюллера или другом растворе бихромата. Затем их перекрашивают в растворе гематоксилина, а срез обрабатывают подходящим обесцвечивающим реагентом, после чего цвет вымывается из всех элементов ткани, кроме нервных волокон. Этот метод позволяет выявить не только нервные волокна в белом веществе, но и тонкую сеть в сером веществе головного и спинного мозга. Дегенерировавшие волокна остаются неокрашенными, поэтому дегенерировавшие тракты выглядят как неокрашенные пятна на темном фоне. Впоследствии срезы можно окрасить квасцовым кармином или эозином для выявления клеток и нейроглии.

Метод Вейгерта. — Кусочек спинного мозга, предназначенный для нарезки после длительной фиксации в жидкости Мюллера, переносят без промывки в абсолютный спирт и обезвоживают перед заливкой в целлоидин (стр. 30). После нарезки срезы сразу переносят в гематоксилиновый раствор Вейгерта:

Hæmatoxyline14grains. Alcohol10 45minims. Distilled water 1001ounce.

Их окрашивают в нем в течение двадцати четырех часов или дольше, пока они не станут совершенно черными.

Окрашивание происходит гораздо быстрее, если жидкость держать при температуре 100° F в термостате. После окрашивания их переносят в дифференцирующий раствор Вейгерта:

Borax2160grs. Potassium ferricyanide2·5 200grs. Distilled water 1001pint.

Их оставляют в этом растворе на несколько часов, пока основной фон не станет почти обесцвеченным.

Иногда срезы окрашиваются более удовлетворительно, если их обработать, согласно первоначальным указаниям Вейгерта, в течение нескольких часов полунасыщенным раствором ацетата меди. Если фиксация в жидкости Мюллера была достаточно длительной, этот этап обычно излишен.

Модификация метода Вейгерта по Палю. — Этот метод позволяет получить более быстрое и полное обесцвечивание нейроглии, нервных клеток и т. д. Срезы готовят точно так же, как в методе Вейгерта, а затем переносят в гематоксилин Вейгерта. Паль рекомендует разбавлять этот раствор вдвое и добавлять несколько капель насыщенного раствора карбоната лития. Автор находит результаты одинаково хорошими и при использовании обычного раствора Вейгерта.

Когда срезы будут тщательно окрашены, их промывают в дистиллированной воде и помещают в трехчетвертьпроцентный раствор перманганата калия. Время, необходимое в этом растворе, зависит от того, сколько времени препарат находился в жидкости Мюллера. Оно должно составлять не менее полуминуты, а для очень хорошо зафиксированных препаратов можно с пользой увеличить его до пяти минут. В этом растворе срезы приобретают непрозрачный коричневый цвет. Их промывают в дистиллированной воде и переносят в:

Дифференцирующий раствор Паля.

Potassium sulphite1grm.40gr. Oxalic acid1grm. 40gr. Distilled water 200cc.1pint.

Их держат в нем от одной до пяти минут, в зависимости от интенсивности окрашивания, пока белое и серое вещество не станут четко определенными, а коричневый цвет полностью не исчезнет. Если коричневый краситель не удаляется легко, срез следует вернуть в раствор перманганата примерно на полминуты и снова обработать «раствором Паля». Этот маневр можно повторить несколько раз. Как только срезы будут полностью дифференцированы, их переносят по одному в большой сосуд с водой и тщательно промывают. Синий цвет гематоксилина становится ярче в процессе промывки. Срезы можно заключать сразу, но более красивые результаты будут получены, если их окрасить квасцовым кармином в течение 24 часов. Затем их следует промыть, обезвожить в спирте, просветлить в бергамотовом масле и заключить в канадский бальзам.

Очень длительная фиксация в жидкости Мюллера, которая является необходимым предварительным условием для этого метода, привела к появлению:

Модификации метода Паля по Шеферу. — В этом методе достаточно фиксации в жидкости Мюллера в течение трех или четырех недель. Срезы изготавливают точно так же, как в предыдущем методе, и переносят в жидкость Марки (стр. 24) на шесть часов. Их промывают и окрашивают всю ночь в следующем растворе:

Hæmatoxylin14grs. Alcohol10 45min. Acetic acid (2 per cent. aqueous solution) 1001oz.

Последующие процессы дифференцировки, обесцвечивания и т. д. точно такие же, как в методе Паля.

Осмия кислота. — Используется как со свежими, так и с зафиксированными препаратами для демонстрации медуллярной оболочки. Гораздо лучшие результаты получаются с первыми. Нервы или небольшие кусочки центральной нервной системы помещают в полупроцентный или однопроцентный раствор осмиевой кислоты как можно скорее после смерти и держат в темноте около недели. Ткань необходимо очень тщательно промыть в проточной воде, чтобы удалить все следы осмиевой кислоты, а затем окрасить в течение пары дней в бура-кармине для демонстрации ядер и осевых цилиндров. Срезы можно изготавливать в гуммиарабике или ткань можно расщеплять иглами, а затем заключать в среду Фарранта. Заливка в целлоидин и заключение в бальзам не рекомендуются, так как эфир имеет тенденцию растворять миелин, а просветляющее масло делает его слишком прозрачным.

2. Внутримышечные разветвления нервов:

Хлораль-гематоксилиновый метод Зилера. — Этот метод выявляет внутримышечные нервные окончания, а также подчеркивает любопытные «мышечные веретена», которые, как показал Шеррингтон, связаны с задними нервными корешками и которые, по мнению некоторых, являются конечными органами, обеспечивающими мышечное чувство.

Кусочек мышцы берут как можно скорее после смерти или от ампутированной конечности и нарезают на замораживающем микротоме ломтиками толщиной около одной десятой дюйма. Перенесите на двадцать четыре часа в следующий раствор:

Acetic acid1part. Glycerine1 " One per cent. aqueous solution of chloral hydrate 6parts.

Ткани набухают в этой жидкости и становятся полупрозрачными и студенистыми на вид. Теперь их помещают в чистый глицерин до насыщения, о чем свидетельствует их погружение на дно сосуда. Обычно это занимает несколько дней. Теперь их можно окрасить в следующем растворе:

Ehrlich’s hæmatoxyline (p. 70)1part. Glycerine1 " One per cent. aqueous solution of chloral hydrate 6parts.

Их можно оставить в нем на срок от трех дней до недели, почти не опасаясь перекрашивания. Затем кусочки можно расщепить иглами и заключить в глицерин, либо окрашенную ткань можно спрессовать в достаточно тонкий слой, сильно сдавив ее между двумя предметными стеклами.

Двигательные и чувствительные нервные окончания. — Их лучше всего окрашивать методом хлорида золота (стр. 82).

Препараты должны быть взяты из организма сразу после смерти. Поэтому метод бесполезен для секционного зала, но может быть использован для тканей, удаленных при операции. Необходимо использовать небольшие кусочки ткани, которые должны быть окрашены целиком, а срезы изготовлены впоследствии.

Для двигательных нервных окончаний можно взять мышцу лягушки или мышцу человека из только что ампутированной конечности. Препараты после окрашивания следует готовить путем расщепления, а не изготовления срезов. Заключайте в среду Фарранта.

Чувствительные нервные окончания удобно изучать на роговице недавно убитой лягушки или кролика, либо на свежеудаленном глазу человека. Осязательные конечные органы можно изучать на губах или кончиках пальцев, вкусовые почки — в листовидных сосочках языка кролика, а тельца Пачини хорошо видны в брыжейке худой кошки.

3. Окрашивание нервных клеток.

Метод анилинового сине-черного красителя Бевана Льюиса: — Этот метод является лучшим для демонстрации богатства нервных клеток в свежей коре головного мозга. Раствор анилинового сине-черного красителя должен иметь концентрацию 1 к 400, около грана на унцию. Кусочек коры головного мозга с прикрепленной мягкой мозговой оболочкой следует извлечь как можно скорее после смерти параллельными разрезами на расстоянии около 1/8 дюйма друг от друга, перпендикулярно поверхности извилины, поместить на пластину замораживающего микротома и слегка заморозить — не слишком сильно, иначе ткань станет хрупкой и повредит лезвие бритвы. Как только получен хороший срез, бритву следует погрузить в большую чашу с холодной водой, чтобы отделить срез, который сразу же переносят на предметное стекло, и поливают из пипетки раствором осмиевой кислоты (1/4 процента). Это зафиксирует элементы ткани примерно за две минуты. Срез снова переносят в чашу с водой и тщательно промывают, чтобы очистить от осмиевой кислоты. Затем его окрашивают либо на предметном стекле, либо в часовом стекле раствором анилинового сине-черного красителя в течение часа в холоде или полчаса, если раствор слегка подогрет. Краситель тщательно вымывают дистиллированной водой, излишек влаги удаляют с предметного стекла фильтровальной бумагой, а срез оставляют сохнуть под стеклянным колпаком. Обезвоживание с помощью спирта нецелесообразно, так как это вызовет внезапное сморщивание тканей. Когда срез высохнет, наносят каплю канадского бальзама и накрывают покровным стеклом обычным способом. Нервные клетки и их отростки окрашиваются в глубокий грифельный цвет, как и ядра клеток соединительной ткани, в то время как основной фон нейроглии окрашивается слабо и имеет нейтральный серый оттенок. Этот метод дает прекрасные результаты как с нормальными, так и с патологическими препаратами.

Различные другие анилиновые красители, индулин, метиленовый синий, генцианвиолет, использовались таким же образом, но ни один из них не дает таких хороших или стабильных результатов, как анилиновый сине-черный.

Зафиксированные препараты также можно окрашивать анилиновым сине-черным, но результаты не идут ни в какое сравнение с теми, что получены методом на свежем материале. Окрашивание обычно диффузное, но его можно улучшить, поместив срезы на 1/2–2 минуты в 2-процентный раствор хлоралгидрата на дистиллированной воде после окрашивания.

Металлические красители Гольджи для нервных клеток.

Гольджи ввел методы создания металлического осадка ртути или серебра в нервной клетке, выявляя как саму клетку, так и ее отростки. Этот метод был очень плодотворным для открытий, особенно в руках Рамон-и-Кахаля, Кёлликера, Ван Гехуктена и других. Лучшие результаты он дает с эмбриональными тканями. Для обеспечения хороших результатов важно, чтобы ткань была извлечена сразу после смерти. Срезы мозга, извлеченного через несколько часов после смерти, обычно дают разочаровывающие результаты.

Сейчас существует несколько методов, все они являются небольшими модификациями оригинальных методов Гольджи.

Метод нитрата серебра. — Небольшие кусочки размером не более четверти дюйма переносят прямо из организма в большое количество жидкости Марки (стр. 24) и держат в ней около недели или дольше в случае взрослых препаратов. После извлечения из раствора Марки ткань следует промыть в течение нескольких секунд в дистиллированной воде, а затем поместить в большое количество 3/4-процентного раствора нитрата серебра на дистиллированной воде по крайней мере на неделю. Кусочек ткани приобретает кирпично-красный цвет из-за покрытия хроматом серебра. После извлечения из раствора серебра ткань следует промыть в метилированном спирте в течение нескольких минут, а корку хромата серебра счистить. Срезы можно нарезать в гуммиарабике и целлоидине; или их можно закрепить на пробке с помощью целлоидина или спиртового лака и нарезать без заливки: очень тонкие срезы не требуются. Обезвоживайте в спирте, просветляйте в ксилоле и заключайте в бальзам. Гудолл советует смесь пиридина и ксилола для просветления и заключает в крепкий ксилол-даммарный раствор без покровного стекла.

Требуется очень внимательное отношение к деталям и большая практика, прежде чем можно будет получить стабильно хорошие результаты. Результаты чрезвычайно красивы и вполне оправдывают затраченный на них труд. Клетки и их отростки выглядят черными на желтоватом фоне.

Использовался метод для углубления цвета окрашивания, но автор не имеет опыта его применения. Каллус (Zeitsch. f. Wiss. Mikr., 1893, 477) разбавляет обычный гидрохиноновый проявитель (приготовленный как для проявления обычной фотопластинки) примерно десятикратным объемом дистиллированной воды. Непосредственно перед использованием добавляется третья часть абсолютного спирта. Срезы, прошедшие процесс серебрения, при помещении в него становятся серыми или черными через несколько минут, а после промывки в метилированном спирте их переносят в 20-процентный водный раствор гипосульфита натрия на пару минут, а затем очень тщательно промывают в дистиллированной воде в течение двадцати четырех часов. Затем их обезвоживают и заключают в бальзам.

Модификация серебряного метода по Бакли. — Описана в Brain, зимний выпуск, 1895 г.

Метод применим к препаратам, которые были зафиксированы в жидкости Мюллера. Тонкие ломтики нарезают обычным способом, а затем погружают в

Bichromate of potassium, 3 per cent. solution 5parts Osmic acid, 1 per cent. solution1part

на три-пять дней. Излишек бихромата удаляют со срезов фильтровальной бумагой, и их переносят в свежеприготовленную окрашивающую смесь:

Phospho-molybdic acid (10 per cent.)1minim2drops. Nitrate of silver (1 per cent.) 1ounce 60c.c.

которую нельзя фильтровать. Окрашивайте несколько дней.

Срезы следует нарезать сразу после извлечения из окрашивающего раствора. Утверждается, что мельчайшие детали структуры клеточных отростков лучше видны при этом методе.

Метод сулемы. — Этот метод по своему действию похож на предыдущий, при этом в клетке вместо серебра осаждается ртуть. Он несколько менее надежен и требует больше практики. Он редко окрашивает равномерно. Одна клетка может оказаться прекрасно окрашенной, в то время как соседние останутся незатронутыми.

Небольшие кусочки коры фиксируют в течение нескольких недель в жидкости Мюллера или другом растворе бихромата, а затем переносят прямо в полупроцентный водный раствор сулемы, в котором их следует оставить на срок от трех до шести недель. Более короткие периоды дадут лишь разочаровывающие и непостоянные результаты. Срезы следует нарезать, если возможно, в гуммиарабике. Их можно заключать в среду Фарранта или обезвоживать и заключать в бальзам. Таль предложил сделать эффект более резким, превращая осадок ртути в сульфид ртути путем обработки срезов раствором сульфида натрия, который он готовит путем насыщения десятипроцентного раствора каустической соды сероводородом с последующим добавлением равного количества свежего раствора соды. Их окрашивают в нем несколько минут, а затем тщательно промывают.

При этом методе пирамидальные клетки и их тонкие отростки выглядят как черные непрозрачные объекты на светлом фоне. Клетки нейроглии с их тонкими нежными отростками также часто бывают красиво окрашены.

Анилиновый метод Ниссля. — Этот метод дополняет метод Гольджи. Последний пропитывает клетку, делая ее непрозрачной и показывая ее форму с большой определенностью.

Метод Ниссля окрашивает протоплазму, не сильно снижая ее прозрачность, и позволяет нам изучать детали клеточной структуры. Небольшие кусочки ткани, извлеченные как можно скорее после смерти, фиксируют в спирте. Затем нарезают срезы, предпочтительно в гуммиарабике, так как целлоидин неудобен из-за того, что слишком сильно окрашивается анилиновыми красителями.

Срезы переносят из спирта в полупроцентный водный раствор метиленового синего, который нагревают в часовом стекле до появления пара, но не доводя до кипения. Окрашивайте около четверти часа и дайте остыть. Перенесите срезы в смесь, содержащую одну часть анилинового масла и десять частей абсолютного спирта, и перемещайте их, пока краситель не перестанет вымываться. Перенесите срез на предметное стекло с помощью подъемника для срезов, слейте жидкость и хорошо высушите, осторожно прижимая сложенную фильтровальную бумагу к срезу. Дайте душицевому маслу стечь по срезу и удалите его излишки, прижимая фильтровальную бумагу. Увлажните бензином и добавьте каплю канифольной смолы, растворенной в бензине. Предметное стекло осторожно подогревают, пока бензин не испарится, а канифоль не разжижится только под действием тепла, после чего накладывают покровное стекло.

Маджента и другие анилиновые красители также могут быть использованы аналогичным образом.

ГЛАВА VII.

Специальные методы окрашивания микроорганизмов и крови.

В рамках данной работы невозможно предпринять сколько-нибудь адекватное описание современных методов бактериологического исследования. Некоторые из них очень длительны и сложны и требуют большого мастерства и практики, прежде чем можно будет рассчитывать на хорошие результаты. Но тем, кто не желает специально изучать бактериологию, часто может потребоваться исследовать наличие организмов в срезах или в различных выделениях, и есть надежда, что они найдут следующее краткое описание специальных методов достаточным для своих целей. Для более тщательной работы им следует обратиться к одному из многих отличных учебников по этому предмету.

Студент должен обеспечить себя следующими красителями в порошке:

Метиленовый синий.

Генцианвиолет.

Метиловый фиолетовый.

Фуксин.

Бисмарк коричневый.

Используются следующие растворы этих красителей:

1. Насыщенные спиртовые растворы, которые можно хранить в склянках с притертыми пробками.

2. Однопроцентные водные растворы. Их необходимо готовить свежими каждый раз перед использованием.

При фильтровании спиртовых или водных растворов полезно предварительно смочить фильтровальную бумагу спиртом или водой, в зависимости от случая.

Также потребуются следующие специальные растворы:

Метиленовый синий Леффлера. — В этом растворе в качестве протравы используется слабый раствор каустической поташи:

Saturated alcoholic solution of methylene blue3volumes. Caustic potash, aqueous solution 1 : 10,000 10volumes.

Отфильтруйте.

Этот раствор, пожалуй, является наиболее универсально полезным красителем. Он окрашивает большинство бацилл и микрококков, и, будучи быстрым в действии, редко перекрашивает. Его необходимо готовить свежим каждый раз. Это лучший контрастный краситель после окрашивания бацилл туберкулеза и т. д. фуксином.

Карбол-фуксин Циля.

Carbolic acid (5 per cent. aqueous solution) 100volumes. Fuchsine (saturated alcoholic solution)11volumes.

Раствор необходимо фильтровать непосредственно перед использованием.

Йодный раствор Грама. — Срезы помещают в этот раствор после окрашивания анилиновыми красителями. Йод в некотором роде фиксирует краситель в организмах, так что они не обесцвечиваются вместе с остальными тканями.

Его готовят так:

Iodine1grm. 1 1/2grains. Iodide of potassium2grms.3grains. Distilled water 300c.c.1ounce.

Следует приготовить десятипроцентные водные растворы азотной и серной кислот, которые могут храниться неопределенно долго.

Ниже приведены общие методы использования этих реагентов для окрашивания организмов в срезах. Для специальных организмов требуются специальные методы, но можно привести лишь один или два.

Метод Вейгерта. — Срезы необходимо поместить в свежеприготовленный однопроцентный водный раствор метилового фиолетового, генцианвиолета, фуксина и т. д. Раствор можно держать при температуре тела в термостате. Организмы часто окрашиваются легче, если срез провести через раствор сулемы 1 к 2000 перед помещением в окрашивающую жидкость. После окрашивания срез промывают в дистиллированной воде, а затем в метилированном спирте, пока он не станет почти обесцвеченным. Некоторые предпочитают обесцвечивать ткани промыванием в полупроцентном растворе уксусной кислоты вместо метилированного спирта. Требуется практика, прежде чем можно будет точно оценить правильное время для обесцвечивания. Новичку следует время от времени быстро переносить срез на предметное стекло, накладывать покровное стекло и рассматривать его под малым увеличением, чтобы увидеть, достаточно ли далеко зашло обесцвечивание. Затем можно использовать контрастный краситель, такой как пикрокармин, после чего срез можно заключить в среду Фарранта: или можно использовать слабый раствор другого анилинового красителя в качестве контрастного, после чего срез просветляют в ксилоле и заключают в бальзам, растворенный в ксилоле.

Метод Грама. — Налейте немного анилинового масла в пробирку и добавьте десятикратный объем дистиллированной воды. Закройте конец большим пальцем и очень тщательно встряхните. Отфильтруйте девяносто капель в другую чистую пробирку и добавьте десять капель насыщенного раствора генцианвиолета или какого-либо аналогичного красителя. Отфильтруйте смесь в часовое стекло. Окрашивайте срезы в нем от трех минут до получаса в зависимости от температуры — меньшее время для термостата при 100°, большее, когда срезы окрашиваются при обычной комнатной температуре. Промойте в дистиллированной воде и перенесите в йодный раствор Грама, пока они не станут черными, обычно через несколько минут. Затем их обесцвечивают в абсолютном спирте. Это часто занимает некоторое время. Его можно ускорить, как предлагает Крукшенк, поместив срез в гвоздичное масло, вернув в спирт и так далее.

Модификация метода Грама по Эрлиху. Здесь контрастный краситель используется первым.

Окрасьте срез (например, митрального клапана при язвенном эндокардите) в спиртовом растворе эозина (1 к 1500). Перенесите в раствор какого-либо анилинового красителя, такого как генцианвиолет, растворенный в анилиново-масляной воде, точно так же, как в методе Грама. Срез плавает на поверхности и расправляется из-за диффузии спирта. Окрашивайте около двадцати минут. Промойте срез в воде и перенесите (стр. 55) на предметное стекло. Дайте воде стечь и медленно добавьте йод Грама из пипетки, чтобы не нарушить срез. Когда срез станет совершенно черным, слейте раствор Грама. Удалите всю лишнюю жидкость с предметного стекла фильтровальной бумагой и высушите срез, осторожно и сильно прижимая к нему сложенный кусочек фильтровальной бумаги. Если это делать осторожно, срез не будет поврежден ни в малейшей степени. Обесцвечивание осуществляется на предметном стекле анилиновым маслом, а не спиртом, как в предыдущем методе. Предметное стекло покачивают, чтобы цвет равномерно вымывался анилином. Когда краситель перестанет выходить, анилиновое масло сливают, срез просветляют в ксилоле и заключают в канадский бальзам.

Как только срез обесцвечен, его можно обработать контрастным красителем, наиболее подходящими из которых являются спиртовые растворы эозина или Бисмарк коричневого, если использовался синий краситель, или метиленовый синий, если первым использовался фуксин.

Ниже приведены наиболее полезные красители и контрастные красители:

Stains. Contrast Stains. Gentian violet.

Methyl violet.

Methylene blue. Picrocarmine.

Eosine.

Bismarck brown.

Safranine. Magenta.

Fuchsine.Methylene blue. And vice versâ.

Требуется большая практика в использовании любого из этих методов, прежде чем можно будет точно судить, как долго оставлять срезы в окрашивающих или обесцвечивающих реагентах, и новичок не должен расстраиваться, если поначалу он не может получить хорошие результаты, хотя и следует указаниям книги самым тщательным образом.

Метод Эрлиха для бацилл туберкулеза. — Срезы окрашивают в течение шести-двадцати четырех часов в однопроцентном растворе генцианвиолета, метилового фиолетового, метилового синего или фуксина. Они окрасятся быстрее, если окрашивающую жидкость держать в термостате при температуре тела. Их следует извлечь из окрашивающей жидкости, промыть в дистиллированной воде, а затем перенести (предпочтительно на подъемнике для срезов) в десятипроцентный раствор азотной кислоты на дистиллированной воде, пока они почти не обесцветятся. Затем их следует очень тщательно промыть в дистиллированной воде. После этого их можно обработать подходящим контрастным красителем и заключить в канадский бальзам.